一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，該方法涉及一株高產色素和桔霉素的紅曲霉菌株L，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為：CCTCC?M2013039。在本發明技術條件下生產的液態發酵曲，其色價水平為110～120U/mL，發酵周期為5～7d，糖化酶活力為630～740U/mL，同時桔霉素含量僅為2～3mg/L，低于日本厚生省在1999年頒布、2003年修訂的《日本食品添加劑標準》中對紅曲色素的桔霉素含量限量指標0.2mg/kg（色價基準為5u/g，1%），該液態發酵曲不存在安全上的隱患，可應用于紅曲黃酒釀造體系。
【專利說明】一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物發酵領域，尤其涉及一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法。
【背景技術】
[0002]紅曲霉是一種腐生絲狀真菌，屬紅曲科。將紅曲霉應用于釀酒已有相當長的歷史，主要是利用紅曲霉代謝產生的紅曲色素、各種酶以及多種生理活性物質，如麥角固醇、Monacolin K和Y -氨基丁酸等,不僅營養豐富,而且具有抗氧化、抗衰老、降血壓、降膽固醇、參與機體代謝和免疫調節等生理功效。此外，紅曲霉在代謝過程中還會產生一種真菌毒素一一桔霉素，桔霉素主要作用的靶器官是腎臟，它不僅可以致畸、導致腫瘤的發生，而且可以誘發突變，使得紅曲產品的食用安全性受到嚴重挑戰，生產無桔霉素或低桔霉素含量的紅曲產品具有重要的現實意義。
[0003]福建紅曲黃酒作為我國黃酒產業的一朵奇葩，因添加了紅曲進行發酵而有與眾不同的功效。紅曲是以大米為主要原料，經紅曲霉固態發酵而成的一種紫紅色米曲，在福建紅曲黃酒釀造中有著舉足輕重的作用，賦予紅曲黃酒獨特的風味和藥用保健價值。固態發酵作為傳統紅曲的生產方式，具有培養基簡單、成本低、對環境污染少、能耗低等優點，但是其抗微生物污染能力低、勞動強度大，操作繁瑣，生長速度慢、生產周期長且產品質量穩定性不高而不適宜大規模機械化生產。

【發明內容】

[0004]為了克服現有紅曲制備技術的缺點與不足，本發明提供了一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，該方法是一種高產糖化酶、低產桔霉素的紅曲霉液態發酵曲的生產方法，以期應用于紅曲黃酒釀造。液態發酵是工業化生產的前提，相比于固態發酵具有可操控強、能實現液態發酵生產紅曲，對紅曲黃酒工藝穩定性、機械化生產都有很大的促進作用。
[0005] 為實現上述目的，本發明提供的技術方案如下:
本發明的一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，所述紅曲霉名稱為紅曲霉菌株L(Monascus kaoliang Strains L)，于中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期為2013年I月22日，保藏編號為=CCTCC M 2013039。
[0006]所述生產方法包含以下的步驟:
①菌株活化:取權利要求1所述的紅曲霉菌株L保藏菌種，在無菌條件下，挑取少許菌種轉接到PDA培養基上，活化培養；
②挑取活化好的菌種轉接到種子培養基中，培養發酵種子，得到發酵種子液；
③在發酵培養基中接入上述發酵種子液，進行液態發酵；
④發酵完畢，測定發酵液的糖化酶活力、色價和桔霉素含量。
[0007]所述液態發酵的具體步驟如下:取發酵培養基30~50mL于250mL三角瓶裝中，按3~8%接種量移取種子培養液于發酵培養基中，在32~36°C培養箱中，200-250 rpm/min旋轉振蕩培養5~7天。[0008]更優選的，所述生產方法包括以下具體步驟:
①取權利要求1所述的紅曲霉菌株L保藏菌種，在無菌條件下，挑少許菌種，轉接于含PDA培養基的培養皿中，30°C活化培養8天；
②用打孔器打取PDA平板上的紅曲霉菌落轉接到種子培養基中，搖床轉速200rpm/min，溫度30°C培養60h，制得種子培養液；
③250mL三角瓶裝發酵培養基30mL，以體積比計，按5%的接種量移取種子培養液于發酵培養基中，在32°C恒溫培養箱中，250rpm/min旋轉振蕩培養6天；
④發酵液勻漿后，測定發酵液糖化酶活力、色價和桔霉素含量。
[0009]所述PDA培養基的配方如下:稱取200g去皮切塊的馬鈴薯，加入20g瓊脂，20g葡萄糖，1000 mL去離子水,煮沸20~30 min,八層紗布過濾,混勻、分裝、121°C滅菌30min。
[0010]所述種子培養基的配方如下(g. 1):秈米粉35，葡萄糖12，黃豆粉12，NaNO3 1，KH2PO4 I, MgSO4.7H20 0.5, pH 自然，121°C滅菌 20min。
[0011]所述發酵培養基的配方如下(g.L—1):米粉30~50，葡萄糖10~20，味精20~30，硫酸銨10~15，磷酸二氫鉀2~3，七水合 硫酸鎂0.4~0.7，一水合硫酸錳0.05~0.07，pH 6.5，121°C 滅菌 20min。
[0012]所述液態發酵的具體步驟如下:取發酵培養基30~50mL于250mL三角瓶裝中，按3~8%接種量移取種子培養液于發酵培養基中，在32~36°C培養箱中，200-250 rpm/min旋轉振蕩培養5~7天。
[0013]所述的米粉為秈米粉、粳米粉、糯米粉、小米粉中的一種或幾種。
[0014]本發明中紅曲霉液態發酵物指標(糖化酶活力、色價和桔霉素)的測定方法如下:
1.糖化酶活力的測定方法:
取兩根25mL比色管，分別加入事先(40°C)下預熱的2.5mL 2%可溶性淀粉溶液和0.5mL稀釋15倍的發酵液，在40°C反應lOmin，立即加入2mL DNS試劑，在沸水浴中加熱5min，用水冷卻，最后定容至25mL，在540nm處測定吸光度。以加入事先40°C下預熱的2.5mL2%可溶性淀粉溶液和0.5mL適量稀釋的酶液，立即加入2mL DNS試劑做空白。酶活力單位的定義=ImL酶液于40°C，pH4.6的條件下，Ih分解可溶性淀粉，產生Img葡萄糖，即為I個酶活力單位，以U/g表示。
[0015]2.色價的測定方法:
將發酵液勻漿后，取0.2g發酵勻漿液到25ml離心管中，添加13%乙醇溶液10mL，60°C水浴浸提Ih后用8000r/min離心,取離心上清液稀釋10倍后測定410nm、465nm、505nm處吸光值，以水調零。色價=(OD410+ OD465+ OD505 ) X稀釋倍數。
[0016]3.桔霉素的測定方法:
采用國家標準(GB / T 5009.222-2008)方法測定。將帶有菌絲體的液態發酵紅曲樣品勻漿后用吸管吸取IOmL,置于50mL具塞試管中，加入20mL無水乙醇，60°C水浴加熱I小時(期間不停地振蕩)，冷卻 至室溫后轉入塑料離心管中，3000r/min離心15分鐘，上清液經0.22um濾膜過濾后進行HPLC分析。
[0017]本發明的顯著優點:本發明成功建立了一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，該液態曲可用于紅曲黃酒的釀造生產。紅曲霉菌株L液態發酵生產的發酵曲色價水平為115.58~123.17U/mL，發酵周期為5~7d，糖化酶活力為632.32~738.84 U/mL,同時桔霉素含量僅為1.18~3.0Omg/L，低于日本厚生省在1999年頒布、2003年修訂的《日本食品添加劑標準》中對紅曲色素的桔霉素含量限量指標0.2mg/kg (色價基準為5u/g，1%)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為紅曲霉菌株L在實施例1、實施例2和實施例3的發酵結果。
【具體實施方式】
[0019]本發明的PDA培養基的配方如下:稱取200g去皮切塊的馬鈴薯，加入20g瓊脂，20g葡萄糖，1000 mL去離子水，煮沸20-30 min，八層紗布過濾，混勻、分裝、121 °C滅菌30mino
[0020]本發明的種子培養基的配方如下:秈米粉35 g，葡萄糖12 g，黃豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 I g，MgSO4.7H20 0.5 g，去離子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C滅菌 20min。
[0021]本發明的發酵培養基的配方如下:米粉30~50 g，葡萄糖10~20 g，味精20~30 g，硫酸銨10~15 g，磷酸二氫鉀2~3 g，七水合硫酸鎂0.4~0.7 g，一水合硫酸錳
0.05 ~0.07 g，去離子水定容到 1000 mL，pH 6.5，121°C滅菌 20min。
[0022]本發明的液態發酵的具體步驟如下:取發酵培養基30~50mL于250mL三角瓶裝中，按3~8%接種量移取種子培養液于發酵培養基中，在32~36 °C培養箱中，200-250rpm/min旋轉振蕩培養5~7天。
[0023]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明并不限于此。
[0024]實施例1:
本發明的PDA培養基的配方如下:稱取200g去皮切塊的馬鈴薯，加入20g瓊脂，20g葡萄糖，1000 mL去離子水,煮沸30 min,八層紗布過濾,混勻、分裝、121°C滅菌30min。
[0025]本發明的種子培養基的配方如下:秈米粉35 g，葡萄糖12 g，黃豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 I g，MgSO4.7H20 0.5 g，去離子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C滅菌 20min。
[0026]本發明的發酵培養基的配方如下:米粉50 g，葡萄糖20 g，味精30 g，硫酸銨15 g，磷酸二氫鉀3 g，七水合硫酸鎂0.7 g，一水合硫酸錳0.07 g，去離子水定容到1000 mL，pH 6.5，121。。滅菌 20min。
[0027]—種紅曲霉液態發酵曲的生產方法具體如下:取紅曲霉菌株L保藏菌種，在無菌條件下，挑少許菌種，轉接于含PDA的培養皿中，30°C活化培養。取活化后的紅曲霉菌株L以同樣的方式接種到種子培養基中，30°C 200rpm/min培養60h。制備種子液。按5%接種量分別移取種子培養液于發酵培養基中，培養條件為250mL三角瓶裝發酵培養基30mL，在32°C培養箱中，250 r/min旋轉振蕩培養6天。所得發酵液分別測定發酵產物的色價、糖化酶活力和桔霉素含量。
[0028]本發明中所涉及的紅曲霉菌株L在上述方法下生產的液態發酵曲色價可達115.58U/mL，糖化酶活力達到738.84 U/mL，桔霉素含量僅為2.87 mg/L。
[0029]實施例2:
本發明的PDA培養基的配方如下:稱取200g去皮切塊的馬鈴薯，加入20g瓊脂，20g葡萄糖，1000 mL去離子水，煮沸20 min，八層紗布過濾，混勻、分裝、121°C滅菌30min。
[0030]本發明的種子培養基的配方如下:秈米粉35 g，葡萄糖12 g，黃豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 I g，MgSO4.7H20 0.5 g，去離子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C滅菌 20min。
[0031]本發明的發酵培養基的配方如下:米粉30g，葡萄糖10 g，味精20 g，硫酸銨10g，磷酸二氫鉀2 g，七水合硫酸鎂0.4 g，一水合硫酸錳0.05 g，去離子水定容到1000 mL，pH 6.5，121。。滅菌 20min。
[0032]一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法具體如下:取紅曲霉菌株L保藏菌種，在無菌條件下，挑少許菌種，轉接于含PDA的培養皿中，30°C活化培養。取活化后的紅曲霉菌株L以同樣的方式接種到種子培養基中，30°C 200rpm/min培養60h。制備種子液。按3%接種量分別移取種子培養液于發酵培養基中，培養條件為250mL三角瓶裝發酵培養基40mL，在32°C培養箱中，200 r/min旋轉振蕩培養7天。所得發酵液分別測定發酵產物的色價、糖化酶活力和桔霉素含量。
[0033]本發明中所涉及的紅曲霉菌株L在上述方法下生產的液態發酵曲色價可達123.17U/mL，糖化酶活力達到691.14 U/mL，桔霉素含量僅為3.00 mg/L。
[0034]實施例3:
本發明的PDA培養基的配方如下:稱取200g去皮切塊的馬鈴薯，加入20g瓊脂，20g葡萄糖，1000 mL去離子水，煮沸25 min，八層紗布過濾，混勻、分裝、121°C滅菌30min。
[0035]本發明的種子培養基的配方如下:秈米粉35 g，葡萄糖12 g，黃豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 I g，MgSO4.7H20 0.5 g，去離子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C滅菌 20min。
[0036]本發明的發酵培養基的配方如下:米粉35 g，葡萄糖15 g，味精25 g，硫酸銨12g，磷酸二氫鉀2.5 g，七水合硫酸鎂0.5 g，一水合硫酸錳0.06 g，去離子水定容到1000mL ，pH 6.5,121°C滅菌 20min。
[0037]—種紅曲霉液態發酵曲的生產方法具體如下:取紅曲霉菌株L保藏菌種，在無菌條件下，挑少許菌種，轉接于含PDA的培養皿中，30°C活化培養。取活化后的紅曲霉菌株L以同樣的方式接種到種子培養基中，30°C 200rpm/min培養60h。制備種子液。按8%接種量分別移取種子培養液于發酵培養基中，培養條件為250mL三角瓶裝發酵培養基50mL，在36°C培養箱中，240 r/min旋轉振蕩培養5天。所得發酵液分別測定發酵產物的色價、糖化酶活力和桔霉素含量。
[0038]本發明中所涉及的紅曲霉菌株L在上述方法下生產的液態發酵曲色價可達118.32U/mL，糖化酶活力達到632.32 U/mL，桔霉素含量僅為1.18mg/L。
【權利要求】
1.一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，其特征在于:所述紅曲霉名稱為紅曲霉菌株L{Monascus kaoliang Strains L),于中國典型培養物保藏中心保藏,保藏編號為:CCTCC M2013039。
2.根據權利要求1所述的一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，其特征在于:所述生產方法包含以下的步驟: ①取權利要求1所述的紅曲霉菌株L保藏菌種，在無菌條件下，挑取少許菌種轉接到PDA培養基上，活化培養； ②挑取活化好的菌種轉接到種子培養基中，培養發酵種子，得到發酵種子液； ③在發酵培養基中接入上述發酵種子液，進行液態發酵； ④發酵完畢，測定發酵液的糖化酶活力、色價和桔霉素含量。
3.根據權利要求2所述的一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，其特征在于:所述液態發酵的具體步驟如下:取發酵培養基30~50mL于250mL三角瓶裝中，按3~8%接種量移取種子培養液于發酵培養基中，在32~36°C培養箱中，200-250 rpm/min旋轉振蕩培養5~7天。
4.根據權利要求2所述一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，其特征在于:所述生產方法包括以下具體步驟: ①取權利要求1所述的紅曲霉菌株L保藏菌種，在無菌條件下，挑少許菌種，轉接于含PDA培養基的培養皿中，30°C活化培養8天； ②用打孔器打取PDA平板 上的紅曲霉菌落轉接到種子培養基中，搖床轉速200rpm/min，溫度30°C培養60h，制得種子培養液； ③250mL三角瓶裝發酵培養基30mL，以體積比計，按5%的接種量移取種子培養液于發酵培養基中，在32°C恒溫培養箱中，250rpm/min旋轉振蕩培養6天； ④發酵液勻漿后，測定發酵液糖化酶活力、色價和桔霉素含量。
5.根據權利要求3或4所述的一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，其特征在于:所述PDA培養基的配方如下:稱取200g去皮切塊的馬鈴薯，加入20g瓊脂，20g葡萄糖，1000 mL去離子水,煮沸20-30 min,八層紗布過濾,混勻、分裝、121°C滅菌30min。
6.根據權利要求3或4所述的一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，其特征在于:所述種子培養基的配方如下:秈米粉35 g，葡萄糖12 g，黃豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 Ig，MgSO4.7H20 0.5 g，去離子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C滅菌 20min。
7.根據權利要求3或4所述的一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，其特征在于:所述發酵培養基的配方如下:米粉30~50 g，葡萄糖10~20 g，味精20~30 g，硫酸銨10~15 g，磷酸二氫鉀2~3 g，七水合硫酸鎂0.4~0.7 g，一水合硫酸錳0.05~0.07 g，去離子水定容到1000 mL，pH 6.5，121°C滅菌20min。
8.根據權利要求6所述的一種紅曲霉液態發酵曲的生產方法，其特征在于:所述的米粉為秈米粉、粳米粉、糯米粉、小米粉中的一種或幾種。
【文檔編號】C12G3/02GK103468463SQ201310034337
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年1月30日 優先權日:2013年1月30日
【發明者】倪莉, 梁爽 申請人:福州大學