用于白酒釀造的釀酒酵母的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)菌種HJY-002，保藏編號為CGMCC?No6979。該菌株最佳發酵培養基是高粱汁培養基。發酵參數條件為溫度30℃，培養時間70h，接種量3％和pH6.5，其酒精含量達到7.4％vol；產乙酸乙酯的最佳工藝參數為：溫度25.5℃，培養時間60h，接種量5％和pH5.7，其乙酸乙酯含量達到16.95mg/100mL。該菌株既產酒精又產酯，既能有一定的酒精產量，又能很好地滿足白酒對酯香的要求，兼具了酒精酵母和產酯酵母的雙重特性，成為老白干釀造過程不可缺少的特征性功能菌，對于老白干酒的典型風格特點的形成具有重要意義。
【專利說明】用于白酒釀造的釀酒酵母
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于微生物發酵【技術領域】。
【背景技術】
[0002]中國白酒香味物質種類繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、縮醛、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物、醚類、內酷類等化合物達數百種之多(莊名揚,釀酒,2007，34 (2):109一 113)。中國白酒風味物質的形成，是微生物代謝的產物，同時也是原料中基本組分及非基本組分，在各類生物酶的直接或間接催化下的生物合成、非酶促化學反應和熱降解反應等多種因素共同作用結果。
[0003]白酒的風味與釀造微生物及釀造工藝也有直接關系。釀造基酒質量的聞低對廣品的最終質量的好壞起決定性的作用。白酒釀造中的生香酵母又稱產酯酵母，主要屬于產膜酵母和假絲酵母，大多為異型漢遜酵母及少數小圓型酵母屬，是白酒和黃酒發酵產香的重要菌種(熊子書，釀酒科技，2002，5:19 — 21)。濃香型白酒以己酸乙酷為主的復合香，是由梭狀芽抱桿菌，俗稱己酸菌的作用，產于泥質發酵老窖或人工培養泥窖中，發酵周期長；清香型白酒以醋酸乙酯為主體香，在小曲、鼓曲或液態法白酒中添加生香酵母，在發酵過程中生成醋酸及其乙酯。酒精發酵過程中酯的產生量與特殊的酵母菌種類有密切關系。
[0004]白酒發酵要求釀酒菌劑具有產酯率高、產酒精率高并耐高溫。質量相同的原料使用不同的釀酒菌劑，形成不同的酒精產量和酯含量。好的釀酒菌劑使同樣的原料酒精產量高、富含酯類，并使白酒純香。但傳統大曲雖然產酯率高，產酒率卻較低，特別是大曲構成成份復雜，使白酒質量不穩定；而單個酵母菌或釀酒菌劑組合物不耐高溫，雖發酵產酒率高但產酯率低，白酒品質較差。
[0005]酒精發酵過程中酯的產生量與特殊的酵母菌種類有密切關系。乙酸乙酯的產生量高低被普遍認為是依賴于酯的合成和酯的水解之間的平衡。在最新審定通過的中國兼香型白酒國家標準中，總酯含量(以乙酸乙酯計)是劃分白酒等級的重要指標，優級酒總酷酯含量比一級酒高I倍(熊小毛等，2009)。如何提高白酒中總酯含量，提高白酒等級是白酒企業和研究者面對的技術難題。

【發明內容】

[0006]本發明提供一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種HJY-002,該菌株已經于2012年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號，(郵編100101)，保藏編號為CGMCC No6979
[0007]CGMCC No6979菌株的細胞卵圓形，在麥芽固體培養基培養24h后，形成乳白色菌落，表面濕潤、有光澤，圓形，邊緣整齊，隆起，不透明。
[0008]CGMCC No6979既產酒精又產酯，既能有一定的酒精產量，又能很好地滿足白酒對酯香的要求，兼具了酒精酵母和產酯酵母的雙重特性，成為老白干釀造過程不可缺少的特征性功能菌。其代謝特性對于老白干酒的典型風格特點的形成具有重要意義。[0009]釀酒酵母CGMCC No6979的最佳發酵培養基是高粱汁培養基，該菌株酒精的最佳發酵工藝參數為:溫度30°C，培養時間73h，接種量3%和pH6.5，發酵液的酒精度為7.6%voL.其產乙酸乙酯的最佳工藝參數為:溫度25.5°C，培養時間60h，接種量5%和pH5.7，其乙酸乙酯含量達到16.95mg/100mL。
[0010]CGMCC No6979菌株從衡水老白干大曲中培養、經過分離得到，具體步驟為:
[0011](I)麥芽粉培養基制備:
[0012]麥芽粉20g,蛋白胨Ig,萄萄糖20g,蒸懼水1000mL,pH調至6.0,121°C滅菌20min。 [0013]固體培養基加2 %瓊脂.[0014](2)菌株分離及形態觀察:
[0015]將粉碎的大曲Ig溶于9mL0.9%的滅菌生理鹽水的試管中，振蕩30分鐘，吸出ImL,注入9mL0.9%的滅菌生理鹽水的試管中，依次操作五次，稀釋倍數達107，從IO7試管中吸取0.2mL，注入裝有固體麥芽粉培養基的培養皿內進行涂布，30°C培養2d后，觀察菌落形態，從中挑出乳白色，表面濕潤、有光澤，圓形，邊緣整齊，隆起，不透明菌落，挑取單菌落，在顯微鏡下觀察細胞形態，選取酵母大小均一、酵母細胞健壯的單個菌落在裝有固體麥芽粉培養基的培養皿內劃線培養，從中挑取單個菌落接入試管斜面，30°C下培養2d，將試管斜面菌種放入冰箱0-4°C保存備用。
[0016](3) 26S rRNA基因序列測定:
[0017]挑取一環試管斜面菌種于10 μ L滅菌水中，99°C、IOmin變性，離心取上清液做模板，使用試劑盒 TaKaRa Fungi Identification PCRIit (Code N0.D317)，進行 PCR 擴增目的片段，取5ul進行3%瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKitVer.2.0 (Code N0.DV805A)切膠回收目的片段，以Seq Forward為引物進行DNA測序。測序結果在GeneBank中利用Blast程序進行比對。
[0018]采用特異性引物擴增后，獲得的26SrDNA序列在GeneBank的比對結果顯示，HJY-002與釀酒酵母(⑶565213.1)的26S rRNA基因的相似性達到100 %。結合菌體形態特征的鑒定結果，將菌株HJY-002確定為釀酒酵母。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0019]圖1為HJY-002在顯微鏡下的菌體細胞形態
[0020]圖2為HJY-002在培養皿內的菌落形態
【具體實施方式】:
[0021]下面通過具體的實施方案敘述本發明用于白酒釀造的釀酒酵母。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
[0022]釀酒酵母HJY-002在液態條件下產酒精產酯實驗:
[0023]培養基制備:
[0024](I)麥芽粉培養基[0025]麥芽粉20g，蛋白胨lg，萄萄糖20g，蒸餾水lOOOmL，pH調至6.0，121°C滅菌20min。固體培養基加2%瓊脂.[0026](2)大米麥芽培養基
[0027]取粉碎后的麥芽和大米按質量比1: 4混合后，加入3倍量的水，加液化酶液化后，再加糖化酶糖化，過濾備用，糖度控制在12Brix，121°C滅菌30min。
[0028](3)純麥芽培養基
[0029]取粉碎后的麥芽加水，加入液化酶液化后，再加糖化酶糖化，過濾備用，糖度控制在 12Brix, 121°C滅菌 30min。
[0030](4)高粱汁培養基
[0031]取粉碎后的高粱加水，加入液化酶液化后，再加糖化酶糖化，過濾備用，糖度控制在 12Brix, 121°C滅菌 30min。
[0032](5)玉米汁培養基
[0033]按GB/T20886-2007的制備方法進行。
[0034]測定方法
[0035]I酒精度的測定
[0036]取成熟發酵液200mL加入到蒸餾瓶中，加入IOOmL蒸餾水，調pH在6.5左右，混勻后蒸餾，準確取出IOOmL蒸餾液，用酒精計測定酒精含量，同時測定溫度，轉換成20°C時的酒精度。
[0037]2香氣成分分析
`[0038]采用島津GC-14C氣相色譜儀對蒸餾后的溜出液進行測定，測定條件:大口徑毛細管柱，柱溫70°C，進樣器溫度250°C，檢測器溫度230°C。
[0039]酵母菌發酵
[0040]通過對酵母菌在不同溫度、不同培養基、不同接種量和不同發酵時間條件下，發酵產物的酒精度測定，確定其各自最佳溫度、培養基、接種量和發酵時間。
[0041]菌株HJY-002可在23°C~30°C的范圍內發酵，29°C時，發酵液的酒精含量最高，達到4.6% vol，相當于23°C時的1.58倍。該菌株的最佳發酵培養基是高粱汁培養基。高粱培養基中酒精含量最高，達到6.30% vol，是玉米培養基的2.1倍。接種量在2% -7%的范圍內，隨著接種量的提高，發酵液的酒精含量逐漸增大，3%的接種量，發酵液酒精含量最高，達到4.3% voL.當培養時間為72h時，發酵液的酒精含量最高，達到3.5% vol，是36h含量的1.3倍。
[0042]發酵參數條件為溫度30°C，培養時間70h，接種量3%和pH6.5，其酒精含量達到
7.4% voL.更優的發酵參數為:為:溫度30 ? C，培養時間73h，接種量3%和pH6.5。酒精度為 7.6% vol。
[0043]釀酒酵母(HJY-002)香氣成分實驗結果
[0044]釀酒酵母HJY-001香氣成分發酵條件的L9 (34)正交實驗結果
[0045]
【權利要求】
1.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種 HJY-002，保藏編號為 CGMCC No6979。
2.根據權利要求1所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種HJY-002，其特征在于所述釀酒酵母CGMCC No6979的最佳發酵培養基是高粱汁培養基。
3.根據權利要求1所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種HJY-002，其特征在于所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種HJY-002產乙酸乙酯的最佳工藝參數為:溫度25.5°C，培養時間60h，接種量5%和pH5.7，其乙酸乙酯含量達到16.95mg/100mL。
4.根據權利要求1所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種HJY-002，其特征在于所述釀酒酵母CGMCC No6979的最佳發酵培養基是高粱汁培養基，該菌株酒精的最佳發酵工藝參數為:溫度30°C，培養時間73h，接種量3%和pH6.5，發酵液的酒精度為7.6%νο? ο`
【文檔編號】C12R1/865GK103789219SQ201310041825
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年2月1日 優先權日:2013年2月1日
【發明者】肖冬光, 劉彥龍, 李澤霞, 程宗志, 王慶宇 申請人:河北衡水老白干酒業股份有限公司