用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測方法及載體試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測方法及載體試劑盒，屬于蛋白質研究技術，其特征在于，將gateway技術引入到熒光素酶互補圖像檢測方法中，得到了熒光素酶互補圖像檢測的gateway表達載體、試劑盒及優化的蛋白質互作檢測方法，用于高效快速高通量地檢測蛋白質之間的互作。
【專利說明】用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測方法及載體試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及蛋白質研究技術，特別是一種用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測方法及載體試劑盒。
【背景技術】
[0002]目前用于蛋白質互作的檢測技術有酵母雙雜交技術(Yeast two hybrid, Y2H)、突光共振能量轉移技術(FRET)、化學發光共振能量轉移技術(BRET)和雙分子熒光互補技術(BiFC)等等。
[0003]酵母雙雜交系統(Y2H)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白一蛋白的相互作用。熒光能量共振轉移(FRET)是距離很近的兩個熒光分子間產生的一種能量轉移現象，當供體熒光分子的發射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在IOnm范圍以內時，就會發生一種非放射性的能量轉移，即FRET現象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多(熒光猝滅)，而受體發射的熒光卻大大增強(敏化熒光)。可用于檢測某一細胞中兩個蛋白質分子是否存在直接的相互作用。當供體發射的熒光與受體發色團分子的吸收光譜重疊，并且兩個探針的距離在IOnm范圍以內時，就會產生FRET現象。而在生物體內，如果兩個蛋白質分子的距離在IOnm之內，一般認為這兩個蛋白質分子存在直接相互作用。雙分子熒光互補技術(BiFC)是將熒光蛋白在某些特定的位點切開，形成不發熒光的N和C端2個多肽，稱為N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。這2個片段在細胞內共表達或體外混合時，不能自發地組裝成完整的熒光蛋白，在該熒光蛋白的激發光激發時不能產生熒光。但是，當這2個熒光蛋白的片段分別連接到I組有相互作用的目標蛋白上，在細胞內共表達或體外混合這2個融合蛋白時，由于目標蛋白質的相互作用，熒光蛋白的2個片段在空間上互相靠近互補，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，并在該熒光蛋白的激發光激發下，發射`熒光，作為報告蛋白，直接反映目標蛋白質蛋白質之間的相互作用。
[0004]基于雙分子熒光互補技術，發明人的前期研究中提出熒光素酶互補圖像檢測技術 LCI 技術(Huamin Chen,et al;2008, Firefly Luciferase ComplementationImaging Assay for Protein-Protein interaction in Plants.Plant Physiology.Vol.146，pp.368^376)，當檢測兩種目標蛋白是否互作時，將熒光素酶分成N端(NLuc)片段2~416和C端(CLuc) 398~550兩部分作為報告蛋白，將編碼N端(NLuc)片段和C端(CLuc)片段的基因分別構建到不同的表達載體上得到N端載體和C端載體，在N端載體上N端(NLuc)片段的氨基端載入一種目標待檢測蛋白的基因得N端檢測載體，在C端載體上C端(CLuc)片段的羧基端載入另一種目標蛋白的基因得C端檢測載體。將N端檢測載體和C端檢測載體的表產物混合在一起，目標蛋白下游兩部分報告蛋白不會自發地裝配起來，僅僅當與這兩部分報告融合的目標蛋白之間可以互作時，兩部分報告蛋白才能夠正確地組裝并產生活性，在加入發光底物后，可以通過特定儀器來檢測其化學發光情況，如果發光情況判斷兩種目標蛋白之間是否存在互作。LCI技術可以利用原生質體表達系統，也可以利用農桿菌介導的瞬時表達系統來完成蛋白互作的檢測或驗證，LCI檢測的是群體細胞的結果，而非單一細胞內的結果，因此有效避免了細胞個體所造成的假象，排除了細胞自發熒光的干擾。
[0005]但前期LCI表達載體其多克隆酶切位點單一，當進行蛋白質互作驗證時，待測定基因克隆入表達載體具有很多局限性，僅僅適合于2個待測蛋白互作的驗證，不方便于高通量的蛋白質互作篩選。
[0006]Gateway技術(Invitrogen):能夠克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統，并且大大地簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，去除了冗長的亞克隆步驟，同時克隆效率高達95%或更高。當基因在目的表達載體之間快速簡便地穿梭時，還可以保證正確的方向和閱讀框，因此Gateway技術被多數實驗室廣泛使用。
[0007]目前尚未見到將gateway技術與LCI技術相結合的報道。

【發明內容】

[0008]本發明根據上述領域的空白，提供一種簡捷、方便，同時也可以方便地適用于大規模的蛋白互作篩選和驗證的方法及相應的LCI表達載體試劑盒。
[0009]本發明的技術方案如下:
[0010]用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測的表達載體，N端載體為表達熒光素酶N端2~416位多肽片段Nluc的pNG或pUC-Nluc-G，C端載體為表達熒光素酶C端398~550位多肽片段Cluc的pCG或pUC-Cluc-G，
[0011]所述pNG及pUC-Nluc-G的構建過程如下:用限制性內切酶Kpn1-Sal I消化PUC-Nluc切除多克隆位點序列，采用T4DNApo I ymerase同時對3 ’ -突出末端切割，對5 ’ -突出末端進行補平；然后利用堿性磷酸酶對其末端進行去磷酸化處理，獲得pUC-Nluc-KS ；pUC-Nluc-KS 與 RFC2.1 片段連接得 pUC-Nluc-G ;用限制性酶 HindII1-SacI 消化pUC-Nluc-G 質粒形成 pUC-Nluc-G`-HS ;用限制性酶 HindII1-SacI 消化 pCAMBIA-nLUC 質粒切除nLUC片段，回收載體片段PCAMBIA-35S-HS ;連接pUC-Nluc-G-HS片段和載體片段PCAMBIA-35S-HS 得到 pNG ；
[0012]所述pCG的構建過程如下:用限制性內切酶Kpn1-PstI消化pUC_Cluc切除多克隆位點序列，采用T4DNAp0lymeraSe同時對3’突出末端切割，對5’突出末端進行補平；然后利用堿性磷酸酶對其末端進行去磷酸化處理，獲得pUC-Cluc-KP ；pUC-Cluc-KP與RFC2.1片段連接得pUC-Cluc-G ;用限制性酶HindII1-SacI消化pUC-Cluc-G質粒形成pUC-Cluc-G-HS ;用限制性酶HindII1-SacI消化pCAMBIA_cLUC質粒切除cLUC片段，回收載體片段 PCAMBIA-35S-HS ;連接 pUC-Cluc-G-HS 片段和載體片段 pCAMBIA_35S_HS 得到 pCG.。
[0013]一種用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測方法，其步驟如下:
[0014]( I)預備N端載體和C端載體，
[0015](2)構建待測基因的入門表達載體，
[0016](3)構建融合表達載體:通過LR反應將一種入門表達載體中的待測蛋白基因重組克隆到PNG載體上所述N端2~416位多肽片段的氨基端得到N端LCI融合表達載體；另一種入門表達載體中的待測蛋白基因通過LR反應重組克隆到pCG載體上所述C端398~550位多肽片段的羧基端得到C端LCI融合表達載體；[0017](4)轉化瞬時表達系統:所述N端載體為pUC-Nluc-G，所述C端載體為pUC-Cluc-G，所述瞬時表達系統指原生質體瞬時發表系統，將步驟(2)制備得到的N端LCI融合表達載體和C端LCI融合表達載體的質粒共轉化到原生質體中進行瞬時表達，
[0018]或者，所述瞬時表達系統指煙草瞬時表達系統，所述N端載體為pNG，所述C端載體為pCG ;將步驟(2)制備得到的N端LCI融合表達載體和C端LCI融合表達載體分別轉化農桿菌中，培養農桿菌，得到轉化有不同待測蛋白基因的N端農桿菌菌株和C端農桿菌菌株，按比例混合所述N端農桿菌菌株和所述C端農桿菌菌株的菌液，將混合菌液注射到煙草葉片中進行瞬時表達，
[0019](5)加入熒光素酶底物檢測發光情況:所述原生質體中加0.2%-0.5%的lmg/mL熒光素酶底物D-Luciferin鉀鹽,所述煙草葉面上噴lmg/mL突光素酶底物D-Luciferin鉀鹽，檢測發光情況，如果有發光，即說明待測蛋白之間存在互作。
[0020]所述指農桿菌為菌株GV3101。
[0021]所述按比例混合指兩株農桿菌菌液相同濃度下按體積比1:1混合。
[0022]當所述所述瞬時表達系統指煙草瞬時表達系統時，瞬時表達指注射農桿菌至飽和狀態煙草葉片置于24~28°C條件下培養2-5天。
[0023]所述檢測發光情況采用超敏化學發光檢測系統，微孔板發光檢測儀。
[0024]所述混合菌液的OD值不高于1.2。
[0025]一種從cDNA文庫中高通量篩選互作蛋白的方法，其特征在于采用基于N端載體為pNG，C端載體為pCG的熒光素酶互補圖像檢測方法，步驟如下:
[0026]步驟1:構建cDNA文庫構建:合成兩端分別帶有BamHI和SalI酶切位點的雙鏈cDNA，，通過amH1-Sall消化cDNA和p`NG或pCG，連接酶切產物得到cDNA文庫入門載體，cDNA文庫入門載體轉化E.coli得到cDNA文庫；
[0027]步驟2:通過BP反應構建誘餌蛋白基因的入門載體:
[0028]步驟3:通過LR反應將入門載體中的誘餌蛋白基因重組克隆到pCG或pNG構建誘餌蛋白融合表達載體，并轉化農桿菌，選出陽性單菌落誘餌蛋白農桿菌菌株；
[0029]步驟4:提取cDNA文庫中的質粒，將質粒轉化到農桿菌中，分離并培養單菌落，獲得一批cDNA文庫農桿菌菌株；
[0030]當誘餌蛋白融合表達載體所用的載體為PNG時，cDNA文庫融合表達載體所用的載體為pCG，當誘餌蛋白融合表達載體所用的載體為pCG時，cDNA文庫融合表達載體所用的載體為PNG ；
[0031]步驟5:每株cDNA文庫農桿菌的菌液分別與誘餌蛋白農桿菌的菌液混合，將混合的農桿菌菌液注射到煙草葉片中進行瞬時表達；
[0032]步驟6:通過檢測煙草葉片中的熒光活性，找出與所述誘餌蛋白的互作蛋白，然后找出表達互作蛋白的cDNA文庫農桿菌菌株；
[0033]步驟7:以表達互作蛋白的cDNA文庫農桿菌菌株為DNA模板進行PCR擴增，對擴增產物進行測序得到互作蛋白的基因信息。
[0034]所述表達互作蛋白的cDNA文庫農桿菌菌株所用的載體為pNG時，PCR擴增米用的引物為 NG-S-F:gacgagctcgatcaaacaag / NG-S-Ritcttcatagccttatgcag ；表達互作蛋白的cDNA文庫農桿菌菌株所用的載體為pCG時，PCR擴增采用的引物為CG-S-F:tcttaccggaaaactcgac/G-S-R:atcgaaccactttgtacaag。
[0035]用于檢測蛋白質互作的試劑盒，其特征在于:含有熒光素酶互補圖像檢測的表達載體 pCG/pNG 或 pUC-Nluc-G/pUC-Cluc-G。
[0036]本發明首次將gateway技術與LCI技術結合起來，引入了目前多數實驗室都已采用的Gateway技術,構建成了適用于LCI技術Gateway載體,優化后的LCI表達載體,不僅便于構建驗證互作的2個蛋白表達載體，同時也可以適用于蛋白互作的高通量篩選的表達載體。
[0037]本發明提供的用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測方法基于Huamin Chen, et al;2008, Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay forProtein-Protein interaction in Plants.Plant Physiology.Vol.146, pp.368^376 中提到的熒光素酶互補圖像檢測方法，是對其中的熒光素酶互補表達載體(LCI載體)進行改造，采用該文章發表的35S::Nluc、35S::Cluc為出發載體先構建其Gateway的目標載體pUC-Nluc-G和pUC-Cluc-G,然后再通過亞克隆構建最終的Gateway表達載體pNG和pCG,使得熒光素酶互補圖像檢測方法在檢測蛋白質互作過程中，將蛋白質基因構建到LCI載體的過程更方便。其中PNG表達熒光素酶2~416位氨基酸殘基構成的片段，pCG表達熒光素酶398~550位氨基酸殘基構成的片段。
[0038]本發明提供的LCI技術Gateway載體用于檢測蛋白質互作的原理與現有技術Huamin Chen, et al;2008,Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay forProtein-Proteininteraction in Plants.Plant `Physiology.Vol.146，pp.368~376 中記載的一樣，如同【背景技術】中的描述，在此不再贅述。其改進之處在于本發明構建的LCI技術Gateway載體能夠更易于構建待測蛋白融合表達載體，這種改進使得蛋白質互作檢測過程效率更高。該改進使得LCI技術可用于高通量檢測蛋白質互作，例如檢測/篩查cDNA文庫中與特定誘餌蛋白互作的蛋白基因。
[0039]本發明還提供了檢測蛋白質互作技術的熒光檢測方法。
[0040]基于本發明提供的熒光素酶互補圖像檢測方法的表達載體，還可以做成試劑盒便于銷售。
[0041]本發明中涉及的專業術語解釋:
[0042]LR反應:指將含目的蛋白基因的入門載體(具有attL重組位點)與Gateway最終表達載體(具有attR重組位點，如本發明中的pNG/pCG)在LR Clonase? II enzyme mix的作用下進行重組反應的過程。最終將目的蛋白基因轉入最終表達載體中(詳見InvitrogenGateway Clone Technology)。執行LR反應的前提是,實驗者已經有了含待測蛋白基因的入門載體。
[0043]入門載體:通過BP反應(attB重組位點與attP重組位點發生重組)獲得兩端含有特異重組位點attB的目的基因入門載體(詳見Invitrogen Gateway Clone Technology)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖l.pNG載體示意圖。
[0045]圖2.pCG載體示意圖。
[0046]圖3.35S::Nluc (pUC-Nluc)載體不意圖。[0047]圖4a.pUC-Nluc-G 載體示意圖。
[0048]圖4b.pUC-Nluc-G 驗證不意圖。
[0049]M:1Kb plus marker ；
[0050]P:未進行酶切的質粒；
[0051]1、2表示酶切驗證的pUC-Nluc-Gl和pUC_Nluc_G2載體質粒；
[0052]H-X:表示 HindIII/Xbal 雙酶切 pUC-Nluc-Gl 和 pUC_Nluc_G2 ；
[0053]ECoRI,表示 HindIII/Xbal 雙酶切 pUC-Nluc-Gl 和 pUC_Nluc_G2 ；
[0054]其中HindIII酶切位點位于pCAMBIA_35S_HS載體中，XbaI位于RFC2.1片段中，H-X 雙酶切 pUC-Nluc-Gl 和 pUC_Nluc_G2 后產生 2.8Kb 和 4.4Kb ；
[0055]ECoRI在pCAMBIA-35S-HS載體和RFC2.1片段中各有一個酶切位點，切出1.3Kb和
5.8Kb。質粒2因為濃度大，酶切消化不充分，電泳效果稍有偏差。
[0056]酶切驗證結果表明質粒pUC-Nluc-Gl和pUC_Nluc_G2都是正確的pUC-Nluc-G。
[0057]圖5.pCAMBIA-Nluc (pCAMBIA1300_Nluc)載體示意圖。
[0058]構建融合表達載體時，可以使用SacI，Kpn1、BamHI, XhoI和SalI等限制酶切位點，但SalI是必需使用的(即插入片段的3‘_必須用SalI限制性酶切位點，為了保證Nluc片段蛋白正確的編碼順序。)·[0059]圖6.pNG驗證示意圖。
[0060]M:1Kb plus marker ；
[0061]P:未進行酶切的質粒；
[0062]P-X:用PstI和XhoI進行雙酶切；
[0063]1、2:酶切驗證的pNGl和pNG2載體質粒。
[0064]其中PstI在pCAMBIA-35S-HS和RFC2.1中各有I個酶切位點；XhoI在PCAMBIA-35S-HS中有2個酶切位點，P-X雙酶切后產生1.0KbU.4Kb,3.5Kb和7.4Kb，如P-X消化后的質粒2，因此質粒pNG2是正確的pNG載體質粒。
[0065]圖7.35S::Cluc (pUC-Cluc)載體不意圖。
[0066]圖8a.pUC-Cluc-G載體結構不意圖。
[0067]圖8b.pUC-Cluc-G 驗證不意圖。
[0068]M:1Kb plus marker ；
[0069]P:未進行酶切的質粒載體；
[0070]1、2:酶切驗證的 pUC-Cluc-Gl 和 pUC_Cluc_G2 載體質粒；
[0071]H-X =HindIII 和 XbaI 雙酶切。
[0072]其中HindIII酶切位點位于pUC-cLUC-HS載體中，XbaI位于RFC2.1片段中，H-X雙酶切后產生1.4Kb和4.9Kb的片段；
[0073]ECoRI在pUC-cLUC-HS載體和RFC2.1片段中各有一個酶切位點，酶切消化產生1.8Kb和4.5Kb的片段。酶切驗證結果顯示質粒pUC-Cluc-Gl和pUC-Cluc_G2都是正確的pUC-cLUC-G 載體。
[0074]圖9.pCAMBIA-Cluc (pCAMBIA1300_Cluc)載體示意圖。
[0075]構建融合表達載體時，可以使用Kpnl，BamHI, XhoI, SalI和PstI等限制酶切位點，但KpnI是必需使用的(即插入片段的5 必須用KpnI限制性酶切位點，為了保證目的蛋白正確的編碼順序)。
[0076]圖10.pCG驗證示意圖。
[0077]M:1Kb plus marker ；
[0078]P:未進行酶切的質粒；
[0079]E-H:用 ECoRI 和 HindIII 進行雙酶切；
[0080]1、2:酶切驗證的pCGl和pCG2載體質粒。
[0081]ECoRI 在 pCAMBIA1300-HS 和 RFC2.1 中各有 I 個酶切位點；HindIII 僅在PCAMBIA-35S-HS中有I個酶切位點，E-H雙酶切后產生1.8Kb、l.9Kb和8.9Kb的片段(如E-H消化后的質粒1、2，因為片段1.8Kb和1.9Kb太接近，電泳難以區分，所以，E-H消化后僅可看見2個片段。)；
[0082]P-X:用PstI和XhoI進行雙酶切；PstI僅在RFC2.1中有I個酶切位點；XhoI在PCAMBIA-35S-HS中有2個酶切位點，P-X雙酶切后產生1.0Kb,4.0Kb和7.5Kb的片段(如P-X消化后的質粒1、2)。酶切 驗證表明質粒pCGl和pCG2都是正確的pCG載體質粒。
[0083]圖11.AtSGTla入門載體的測序驗證示意圖。
[0084]測序引物:通用引物M13-F (5’ -GTAAAACGACGGCCAG-3’華大基因提供);通用引物M13-R (5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'華大基因提供)
[0085]構建入門載體時由于pDONR載體上的ccdB基因具有負選擇壓力，在轉化BP反應產物時，極少產生假陽性，因此直接測序驗證序列的正確性，不再進行酶切驗證。
[0086]圖12.AtRARl入門載體的測序驗證示意圖。
[0087]測序引物:通用引物M13-R (5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'華大基因提供)
[0088]圖13.AtR77入門載體的測序驗證示意圖。
[0089]測序引物:通用引物M13-R (5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'華大基因提供)
[0090]圖14.pNG和pCG表達載體的驗證。
[0091]其中:葉片的左上、左下、右上和右下分別標有11、12、21、22數字，分別表示數字對應部位注射的農桿菌含有不同的表達載體，具體為:11表示農桿菌含有PNL-AtSGTla和pCL-AtRARl兩個表達載體；12表示農桿菌含有pNL_AtSGTla和pCL_AtR77兩個表達載體；21表示農桿菌含有pNG-AtSGTla和pCG_AtRARl兩個表達載體；22表示農桿菌含有pNG-AtSGTla和pCG_AtR77兩個表達載體。
[0092]圖15.GloMax發光檢測儀驗證pNG/pCG表達載體。
[0093]pNL/pCL:指采用前期的表達載體系統，pNL-AtSGTla 與 pCL-AtRARl、pCL_AtR77 間的互作；
[0094]pNG/pCG:指采用改造后的表達載體系統。pNG-AtSGTla 與 pCG-AtRARl、pCG_AtR77間的互作。
[0095]圖16.pNG/pCG BamH1-SalI 酶切位點示意圖。
【具體實施方式】
[0096]以下通過【具體實施方式】說明本發明的原理和效果。
[0097]生物材料發放聲明:
[0098]本發明所用的以下生物材料均為現有技術中有記載或可以商購獲得的，本實驗室也有保存， 申請人:保證自申請日起20年內可向公眾發放用于驗證試驗。
[0099]35S::Nluc / 35S::Clue, pCAMBIA-Nluc / pCAMBIA-Cluc，pNL/pCL, pNL-AtSGTla與 pCL-AtRARl、pCL_AtR77 為已知載體，記載于 Huamin Chen, et al; 2008, FireflyLuciferase Complementation Imaging Assay for Protein-Protein interaction inPlants.Plant Physiology.Vol.146, pp.368~376。
[0100]RFC2.1 片段:購于 Invitrogen (Catalog n0.11828-029)。
[0101]One Shot? ccdB Survival?2TlR感受態細胞，可耐 ccdB基因:Invitrogen Catalogn0.11828-029)。
[0102]LR Clonase? II Enzyme Mix:1nvitrogen Cat.N0.11791-20/11791-100):
[0103]突光素酶底物:D_Luciferin鉀鹽(D-Luciferin, potassium salt),購于北京泛博生物化學有限公司。
[0104]實施例1.LCI技術Gateway載體的構建:(Nluc位于重組位點的C-端)
[0105]1.LpNG (圖1)的構建
[0106]步驟1.用限制性內切酶Kpn1-SalI消化pUC-Nluc (即35S::Nluc)(圖3)，切除多克隆位點序列，對獲得片段進行末端抹平處理以便于插入RFC2.1重組片段。
[0107]步驟2.利用T4DNApolymerase(NEB)同時對步驟I的酶切回收驗證片段的3，-突出末端切割(KpnI形成末端),對5’ -突出末端進行補平(Sail形成末端);然后利用堿性磷酸酶對其末端進行去磷酸 化處理，防止連接反應中形成自連，獲得pUC-Nluc-KS。
[0108]步驟3.RFC2.1 重組位點克隆入 pUC-Nluc-KS:將 pUC-Nluc-KS 與 RFC2.1 片段(見Invitrogen)相連接，連接產物轉化One Shot? ccdB Survival?2TlK感受態細胞(Invitrogen,可耐ccdB基因)，篩選陽性克隆并驗證,驗證圖片見圖4b,形成pUC-Nluc-G(圖 4a)。
[0109]步驟4.pUC-Nluc-G的消化:用限制性酶HindIIΙ-Sacl消化pUC-Nluc-G質粒。消化后形成3.5kb和3.7kb兩個片段，難以分離回收，因此利用堿性磷酸酶對其末端進行去磷酸化處理(防止片段自連或兩片段的重新組裝)，形成pUC-Nluc-G-HS。
[0110]步驟5.pCAMBIA-Nluc(圖 5)的消化:用限制性酶HindII1-SacI 消化pCAMBIA-Nluc質粒切除了含有nLUC的片段，并回收其載體片段PCAMBIA-35S-HS。
[0111]步驟6.PCAMBIA-35S-HS 和 pUC-Nluc-G-HS 連接，連接產物轉化 One Shot?ccdB Survival?2TlE感受態細胞。通過KanE (來自pCAMBIA_35S_HS片段)和CMe (來自pUC-Nluc-G-HS片段)抗性篩選陽性克隆，并進行驗證，驗證圖片見圖6。驗證無誤的即為最終的PNG表達載體。
[0112]1.2.PCG (圖 2)的構建
[0113]pCG的構建:(Cluc位于重組位點的N-端)
[0114]步驟1.用限制性內切酶Kpn1-PstI消化pUC_Cluc (即35S::Cluc)(圖7)，切除多克隆位點序列，對獲得片段進行末端抹平處理以便于插入RFC2.1重組片段。
[0115]步驟2.利用T4DNA polymerase (NEB)同時對Kpnl、PstI消化產物的3’ -突出末端進行切割，形成平末端；然后利用堿性磷酸酶對其片段末端進行去磷酸化處理，防止連接反應中形成自連，獲得pUC-Cluc-KP。
[0116]步驟3.RFC2.1 重組位點克隆入 pUC-Cluc-KP:將 pUC-Cluc-KP 與 RFC2.1 片段(見Invitrogen)相連接，連接產物轉化One Shot? ccdB Survival?2TlK感受態細胞(Invitrogen,可耐ccdB基因)，篩選陽性克隆并驗證,驗證圖片見圖8b,形成pUC-Cluc-G(圖 8a)。
[0117]步驟4.pUC-Cluc-G的消化:用限制性酶HindII1-SacI消化pUC_Cluc_G質粒形成
3.5kb和2.9kb兩種片段，純化回收2.9kb片段，即pUC-Cluc-G-HS;
[0118]步驟5.pCAMBIA-Cluc 圖 9 的消化:用限制性酶 HindII1-SacI 消化 pCAMBIA-Cluc質粒切除了含有cLUC的片段，并回收其載體片段PCAMBIA-35S-HS。
[0119]步驟6.pCAMBIA-35S-HS 和 pUC-Cluc-G-HS 連接，連接產物轉化 One Shot'ccdB Survival?2TlE感受態細胞。通過KanE (來自pCAMBIA_35S_HS片段)和CMe (來自pUC-Nluc-G-HS片段)篩選陽性克隆，并進行驗證，驗證圖片見圖10，驗證無誤的即為最終的PCG表達載體(圖2)。
[0120]注:本發明中所用到的酶試劑的使用均依照試劑說明書中建議的進行。
[0121]實施例2.LCI技術Gateway載體用于檢測蛋白質基因AtSGTla與AtRARl之間的互作構建融合載體，并導入農桿菌GV3101或GV2260等(均可)。
[0122]目的:檢測AtSGTla和AtRARl之間的互作，以AtSGTla和AtR77的互作為負對照。AtR77僅包含AtRARl的N端77個氨基酸。
[0123]以原有的LCI表達載體pCAMBIA-Nluc和pCAMBIA-Cluc為對照，驗證pNG和pCG表達載體在LCI技術上的適用性。
[0124]步驟1.構建目的基因的入門載體(詳見invitrogen Catalog nos.12535-019說明書)
[0125]AtSGTla基因、AtRARl基因、AtR77基因的入門載體構建過程:
[0126](I)帶attB重組位點目的基因的PCR擴增
[0127]通過采用帶attB重組位點的引物擴增待測基因，使目的基因帶有attB重組位點以便于進行BP反應。
[0128]本實驗以已知載體質粒pNL-AtSGTla與pCL-AtRARl、pCL_AtR77 (記載于Huamin Chen, et al;2008, Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay forProtein-Protein interaction in Plants.Plant Physiology.Vol.146，pp.368~376)為模板，以以下帶有attB重組位點(斜體下劃線部分)的引物進行PCR擴增得到用于構建入門載體的目的基因::
【權利要求】
1.用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測的表達載體，N端載體為表達熒光素酶N端2~416位多肽片段Nluc的pNG或pUC-Nluc_G，C端載體為表達熒光素酶C端398~550位多肽片段Cluc的pCG或pUC-Cluc-G， 所述PNG及pUC-Nluc-G的構建過程如下:用限制性內切酶Kpn1-Sal I消化pUC-Nluc切除多克隆位點序列，采用T4DNApoIymerase同時對3 ’ -突出末端切割，對5 ’ -突出末端進行補平；然后利用堿性磷酸酶對其末端進行去磷酸化處理，獲得pUC-Nluc-KS ；pUC-Nluc-KS與RFC2.1片段連接得pUC-Nluc-G ;用限制性酶HindII1-SacI消化pUC-Nluc-G質粒形成pUC-Nluc-G-HS ;用限制性酶HindII1-SacI消化pCAMBIA-nLUC質粒切除nLUC片段，回收載體片段 PCAMBIA-35S-HS ;連接 pUC-Nluc-G-HS 片段和載體片段 pCAMBIA_35S_HS 得到 pNG ； 所述PCG的構建過程如下:用限制性內切酶Kpn1-PstI消化pUC_Cluc切除多克隆位點序列，采用T4DNAp0lymeraSe同時對3’突出末端切割，對5’突出末端進行補平；然后利用堿性磷酸酶對其末端進行去磷酸化處理，獲得pUC-Cluc-KP ；pUC-Cluc-KP與RFC2.1片段連接得PUC-Cluc-G ;用限制性酶HindII1-SacI 消化pUC-Cluc-G質粒形成pUC-Cluc-G-HS ；用限制性酶HindII1-SacI消化pCAMBIA_cLUC質粒切除cLUC片段，回收載體片段PCAMBIA-35S-HS ;連接 pUC-Cluc-G-HS 片段和載體片段 pCAMBIA_35S_HS 得到 pCG.。
2.一種用于檢測蛋白質互作的熒光素酶互補圖像檢測方法，其步驟如下: (1)預備N端載體和C端載體， (2)構建待測基因的入門表達載體， (3)構建融合表達載體:通過LR反應將一種入門表達載體中的待測蛋白基因重組克隆到PNG載體上所述N端2~416位多肽片段的氨基端得到N端LCI融合表達載體；另一種入門表達載體中的待測蛋白基因通過LR反應重組克隆到pCG載體上所述C端398飛50位多肽片段的羧基端得到C端LCI融合表達載體，` (4)轉化瞬時表達系統:所述N端載體為pUC-Nluc-G，所述C端載體為pUC-Cluc-G，所述瞬時表達系統指原生質體瞬時發表系統，將步驟(2)制備得到的N端LCI融合表達載體和C端LCI融合表達載體的質粒共轉化到原生質體中進行瞬時表達， 或者，所述瞬時表達系統指煙草瞬時表達系統，所述N端載體為pNG，所述C端載體為PCG ;將步驟(2)制備得到的N端LCI融合表達載體和C端LCI融合表達載體分別轉化農桿菌中，培養農桿菌，得到轉化有不同待測蛋白基因的N端農桿菌菌株和C端農桿菌菌株，按比例混合所述N端農桿菌菌株和所述C端農桿菌菌株的菌液，將混合菌液注射到煙草葉片中進彳丁瞬時表達， (5)加入突光素酶底物檢測發光情況:所述原生質體中加0.2%-0.5%的lmg/mL突光素酶底物D-Luciferin鉀鹽,所述煙草葉面上噴lmg/mL突光素酶底物D-Luciferin鉀鹽,檢測發光情況，如果有發光，即說明待測蛋白之間存在互作。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，所述指農桿菌為菌株GV3101。
4.根據權利要求2所述的檢測方法，所述按比例混合指兩株農桿菌菌液相同濃度下按體積比1:1混合。
5.根據權利要求2所述的檢測方法，當所述所述瞬時表達系統指煙草瞬時表達系統時，瞬時表達指注射農桿菌至飽和狀態煙草葉片置于24~28°C條件下培養2-5天。
6.根據權利要求2所述的檢測方法，所述檢測發光情況采用超敏化學發光檢測系統，微孔板發光檢測儀。
7.根據權利要求2所述的檢測方法，所述混合菌液的OD值不高于1.2。
8.—種從cDNA文庫中高通量篩選互作蛋白的方法，其特征在于采用基于N端載體為pNG，C端載體為pCG的熒光素酶互補圖像檢測方法，步驟如下: 步驟1:構建cDNA文庫構建:合成兩端分別帶有BamHI和SalI酶切位點的雙鏈cDNA，，通過amH1-Sall消化cDNA和pNG或pCG，連接酶切產物得到cDNA文庫入門載體，cDNA文庫入門載體轉化E.coli得到cDNA文庫； 步驟2:通過BP反應構建誘餌蛋白基因的入門載體: 步驟3:通過LR反應將入門載體中的誘餌蛋白基因重組克隆到pCG或pNG構建誘餌蛋白融合表達載體，并轉化農桿菌，選出陽性單菌落誘餌蛋白農桿菌菌株； 步驟4:提取cDNA文庫中的質粒，將質粒轉化到農桿菌中，分離并培養單菌落，獲得一批cDNA文庫農桿菌菌株； 當誘餌蛋白融合表達載體所用的載體為PNG時，cDNA文庫融合表達載體所用的載體為PCG，當誘餌蛋白融合表達載體所用的載體為pCG時，cDNA文庫融合表達載體所用的載體為pNG ； 步驟5:每株cDNA文庫農桿菌的菌液分別與誘餌蛋白農桿菌的菌液混合，將混合的農桿菌菌液注射到煙草葉片中進行瞬時表達； 步驟6:通過檢測煙草葉片中的熒光活性，找出與所述誘餌蛋白的互作蛋白，然后找出表達互作蛋白的cDNA文庫農·桿菌菌株； 步驟7:以表達互作蛋白的cDNA文庫農桿菌菌株為DNA模板進行PCR擴增，對擴增產物進行測序得到互作蛋白的基因信息。
9.根據權利要求8所述的方法，所述表達互作蛋白的cDNA文庫農桿菌菌株所用的載體為pNG時，PCR擴增采用的引物為NG-S-F: gacgagctcgatcaaacaag /NG-S-Ritcttcatagccttatgcag ;表達互作蛋白的cDNA文庫農桿菌菌株所用的載體為pCG時，PCR 擴增米用的引物為 CG-S-F: tcttaccggaaaactcgac/G-S-R:atcgaaccactttgtacaag。
10.用于檢測蛋白質互作的試劑盒，其特征在于:含有熒光素酶互補圖像檢測的表達載體 pCG/pNG 或 pUC-Nluc-G/pUC-Cluc-G。
【文檔編號】C12N15/84GK103849645SQ201310046363
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年2月5日 優先權日:2013年2月5日
【發明者】陳華民, 周儉民, 何晨陽, 田芳 申請人:中國農業科學院植物保護研究所