一種制備長心卡帕藻原生質體的方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，具體的說是一種利用籃子魚內臟提取液制備長心卡帕藻原生質體的方法。取雜食性熱帶籃子魚，預先飼喂長心卡帕藻誘導其產消化卡拉膠的酶類，然后以籃子魚內臟為原料制備混合酶液，進而利用該混合酶液降解長心卡帕藻的細胞壁及其細胞間質組分，從中獲取游離的原生質體。本發明可為借助傳統原生質體細胞融合、愈傷組織誘導與分化，人工培育長心卡帕藻新品系，提供育苗和育種新途徑與相關支撐技術。
【專利說明】一種制備長心卡帕藻原生質體的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體的說是一種利用籃子魚內臟提取液制備長心卡帕藻原生質體的方法。
【背景技術】
[0002]長心卡帕藻是國際上產K-卡拉膠的重要熱帶紅藻資源。K-卡拉膠是海藻細胞粘性多糖，由D-半乳糖及其衍生物組成的大分子構成，具有廣闊的市場開發和應用前景?？ɡz具有凝膠和保水特性，具有一定硬度，因此是支撐奶制品、火腿、冰淇淋等食品制造行業的重要加工原料，在食品、化工等領域有非常廣泛的應用前景。卡拉膠在醫藥上也有較好的應用前景，研究表明皮下注射卡拉膠可刺激結締組織可逆生長，并能刺激骨膠原的生長，增加骨骼對鈣的吸收。有報道研究表明麒麟菜提取物對風濕性關節炎有療效，對胃潰瘍和十二指腸潰瘍也有治療作用，在抗血凝及免疫方面也具有重要的生理活性等。近年來，卡拉膠在醫藥工業中應用越來越廣泛，可用于植物性薄膜包衣和膠囊，可有效發揮其具有無交聯反應、藥物吸濕低、無動物源傳染病風險、不易與含醛基藥物反應、以及易于廢棄材料再利用和利潤高等諸多優點，K-卡拉膠是制備藥材包衣和膠囊的最好植物性原料之
O
[0003]國際上長心卡帕藻栽培多在熱帶和亞熱帶地區進行，長心卡帕藻主產區在印度尼西亞和菲律賓等東南亞國家和地區。除我國海南外，在菲律賓、印度尼西亞、馬來西亞、越南等東南亞國家和斐濟等太平洋島域，以及中南美洲的墨西哥、巴西，和非洲的肯尼亞、坦桑尼亞等熱帶國家和地區，上述產膠海藻都已經實現了人工規模化栽培，共同支撐著國際上逐年增長的卡拉膠市場需求。目前，這些紅藻原料只有很少一部分來自于珊瑚礁等熱帶海洋自然生境中的海菜，大多數源自于人工栽培海菜，而該藻的規?；斯ぴ耘嘀饕蕾囉跔I養繁殖，其孢子繁殖和有性生殖方式已經嚴重退化，生產過程中難以發現。
[0004]應當指出，至今為止，長心卡帕藻一直沿用人工選育的野生種苗為苗源，然而該藻長期營養繁殖方式栽培已經造成種質退化，海菜生長速度減緩、產膠性能降低和抗病能力下降。由于藻種無性和有性繁殖高度退化，只能依賴于營養繁殖方式擴大栽培，其遺傳育種和育苗工作步履艱難，在國內外尚沒有實質性突破。如何開展新品種培育，恢復和提高種質優良生產性狀是該領域關注的研究熱點問題。
[0005]通過制備原生質體，進而結合細胞融合和愈傷組織等生物技術培育優良品種，目前已在許多生物物種中得到證實和應用，能否適用于長心卡帕藻種質種苗培育，目前尚難評論。但無論如何，制備長心卡帕藻原生質體是通過該途徑培育種苗的基礎和第一步工作，受該藻細胞壁中含有大量K -卡拉膠的限制，傳統酶解技術效果不明顯。

【發明內容】

[0006]本發明目的在于提供一種制備長心卡帕藻原生質體的方法。
[0007]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:[0008]一種制備長心卡帕藻原生質體的方法，以經長心卡帕藻飼喂誘導的雜食性熱帶籃子魚消化內臟器官為原料，提取混合消化酶液，再由所得混合酶液降解長心卡帕藻細胞壁及其細胞間質組分，從中獲取游離的長心卡帕藻原生質體。
[0009]所述原料為預先用富含K -卡拉膠的長心卡帕藻飼喂籃子魚7天以上，而后收集籃子魚消化內臟器官組織。
[0010]所述原料在50mM和pH值6.0±0.1的磷酸緩鈉鹽緩沖液中冰凍研磨、均漿，再經過濾去除雜質，即得到混合消化酶液。
[0011]所述混合消化酶液中加入滲透劑和膜穩定劑共同作為酶解液，而后與長心卡帕藻混合在25±2°c條件下，連續輕微震蕩酶解10-12小時，即可獲得游離的長心卡帕藻原生質體。
[0012]所述混合消化酶液中加入滲透劑、膜穩定劑、以及強化作用效果的纖維素酶和果膠酶共同作為酶解液，而后與長心卡帕藻混合在25±2°C條件下，連續輕微震蕩酶解10-12小時，即可獲得到游離的長心卡帕藻原生質體。
[0013]將上述酶解后酶解液中加入洗脫液在25±2°C條件下，震蕩酶解1±0.2小時，酶解后過濾，濾液離心，棄去最上層的清液，再加入洗脫液懸浮并充分混勻，再次離心收集沉淀，沉淀再經洗脫液懸浮即為長心卡帕藻原生質體；其中洗脫液為含0.6M甘露醇和5mM氯化鈣的F/2培養基溶液；酶解液與粉碎后的長心卡帕藻泥體積比為:3:1。
[0014]本發明所具有的優點:針對長心卡帕藻有性和無性繁殖高度退化，培育新品種困難問題，采用本發明利用攝食該藻的籃子魚誘導和制備消化酶解粗提液的方法，可有效獲得長心卡帕藻原生質體；有望結合細胞融合和愈傷組織等技術，進而形成培育藻株的新途徑，實現該藻種質種苗培育。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發明實施例提供的通過籃子魚內臟提取液酶解所制備的長心卡帕藻原生質體效果圖。其中，圖中A為通過本發明方式所得的制備較完整的原生質體，B為制備不完全、仍存有一定細胞壁的長心卡帕藻原生質體。
[0016]圖2為本發明實施例提供的長心卡帕藻原生質體樣品經伊文思藍染色后的效果圖。圖中顏色較深原生質體，示染料大量進入細胞，表明其結構已破損，而顏色較淺的原生質體，示染料不能自由進入細胞，表明其結構完整。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
[0018]所需溶液配制:配制pH為6.0的50mM磷酸鈉鹽緩沖液，取lmol/L磷酸二氫鈉
4.4mI和lmol/L磷酸氫二鈉0.6ml混勻,用蒸懼水將混合液定容至100ml,作為儲備液放入4度冰箱中儲存備用。
[0019]消毒海水溶 液的配制:取50mg氯霉素,加入到100mL無菌海水中。
[0020]洗脫液的配制:取109.3g甘露醇(0.6M)和554.9mg氯化鈣(5mM)，依次溶入含I升F/2培養基(培養基配方參見表1)的錐形瓶(2L)中，然后放入滅菌鍋中，在高溫(121 °C )、高壓(102.9kPa)條件下滅菌25min，待冷卻后轉入儲液瓶，待用。[0021]實驗材料準備:取IOg健康的長心卡帕藻鮮藻藻體，在無菌海水中沖洗干凈，然后用消毒紙巾吸干，并轉入消毒培養基溶液中處理0.5-0.8h，再用無菌海水沖洗，最后用組織均漿器將藻體打碎均漿，備用。
[0022]籃子魚內臟提取液的制備:取20只熱帶籃子魚，每天人工投喂長心卡帕藻150-200g鮮菜。飼喂一周后，分別選取其胃和肝臟內臟，并存放在低溫冰凍條件下備用。將籃子魚的胃和肝臟放入4°C預冷的小燒杯中，按每g內臟加20ml磷酸緩鈉鹽沖液，磷酸緩鈉鹽沖液濃度為50mM，其pH值為6.0。利用組織勻漿器研磨籃子魚內臟，提取液分別用20微米、8微米和I微米的濾紙過濾。向過濾后的粗提液中添加0.5%的纖維素酶(solarbio)、
0.玨^的果膠酶^。]^!^;^)、。.6M的甘露醇和5mM的氯化鈣，備用。
[0023]酶解:將上述均漿后的藻泥和粗提酶解液按照1:3的體積比例混勻(即Iml藻泥與3ml提酶解液混合)，然后置于搖床上震蕩酶解。酶解過程中采用搖床連續震蕩，震蕩速度100轉/分鐘，酶解溫度25°C。酶解半天(約11-12小時)后，向6-8毫升酶解液中加入3ml洗脫液，再放回搖床繼續在25°C條件酶解。I小時后，用孔徑500微米的篩絹過濾酶解液，去粗大藻塊，將濾液轉入離心管中，在200g (湘儀TGL-16M)下離心5min。棄去離心管最上層的清液5ml，并向離心管內加入5ml洗脫液，懸浮混勻。然后，在200g下再次離心5min，棄上清，向離心管中加入1ml洗脫液重新懸浮，可獲得完整的長心卡帕藻原生質體。
[0024]上述所得原生質體狀態和活性的鑒定: [0025]去壁狀態鑒定，其中形態變化狀況具體分為:
[0026]原生質體為完整:細胞出現吸水膨大、甚至完全漲大破裂，并且在細胞破碎后無細胞壁殘余存在。
[0027]細胞壁殘存:細胞出現小幅變化或不對稱性膨脹，并且在漲大破裂后仍然殘存細胞壁。
[0028]完整帶細胞壁的細胞:未見待測樣品細胞出現漲大。
[0029]具體鑒定，以蒸餾水處理上述所得原生質體樣品，在顯徽鏡下觀察細胞形態變化狀況(參見圖1)。由圖中可見細胞出現吸水膨大、甚至完全漲大破裂，并且在細胞破碎后無細胞壁殘余存在，則表明上述所得原生質體樣品為完整的。
[0030]原生質體存活狀況鑒定:其中存活狀況由染色后具體分為:
[0031]染色后為深色，說明染料可進入細胞內，表明樣品原生質體已經存在一定程度的破損；
[0032]染色后為較淺，說明染料不能自由進入細胞內，表明所獲得的樣品細胞為完整原生質體。
[0033]具體鑒定，取0.5%伊文思藍染液，對上述實施例所得原生質體進行染色，然后借助顯微鏡對待測樣品進行鏡檢可見(參見圖2)染色后的顏色較淺，表明所獲得的樣品細胞為完整的原生質體。
[0034]將上述所得原生質體再借助傳統原生質體細胞融合、愈傷組織誘導與分化，可人工培育長心卡帕藻新品系的育苗和育種。
[0035]所述f/2培養基配制方法:
[0036]A.鈉鹽儲液
【權利要求】
1.一種制備長心卡帕藻原生質體的方法，其特征在于:以經長心卡帕藻飼喂誘導的雜食性熱帶籃子魚消化內臟器官為原料，提取混合消化酶液，再由所得混合酶液降解長心卡帕藻細胞壁及其細胞間質組分，從中獲取游離的長心卡帕藻原生質體。
2.按權利要求1所述的制備長心卡帕藻原生質體的方法，其特征在于:所述原料為預先用富含K -卡拉膠的長心卡帕藻飼喂籃子魚7天以上，而后收集籃子魚消化內臟器官組織。
3.按權利要求1或2所述的制備長心卡帕藻原生質體的方法，其特征在于:所述原料在50mM和pH值6.0±0.1的磷酸緩鈉鹽緩沖液中冰凍研磨、均漿，再經過濾去除雜質，即得到混合消化酶液。
4.按權利要求1所述的制備長心卡帕藻原生質體的方法，其特征在于:所述混合消化酶液中加入滲透劑和膜穩定劑共同作為酶解液，而后與長心卡帕藻混合在25±2°C條件下，連續輕微震蕩酶解10-12小時，即可獲得游離的長心卡帕藻原生質體。
5.按權利要求1所述的制備長心卡帕藻原生質體的方法，其特征在于:所述混合消化酶液中加入滲透劑、膜穩定劑、以及強化作用效果的纖維素酶和果膠酶共同作為酶解液，而后與長心卡帕藻混合在25±2°C條件下，連續輕微震蕩酶解10-12小時，即可獲得到游離的長心卡帕藻原生質體。
6.按權利要求1、4或5所述的制備長心卡帕藻原生質體的方法，其特征在于:將上述酶解后酶解液中加入洗脫液在25±2°C條件下，震蕩酶解1±0.2小時，酶解后過濾，濾液離心，棄去最上層的清液，再加入洗脫液懸浮并充分混勻，再次離心收集沉淀，沉淀再經洗脫液懸浮即為長心卡帕藻原生質體；其中洗脫液為含0.6M甘露醇和5mM氯化鈣的F/2培養基溶液；酶解液與粉碎后的長心卡帕藻泥體積比為3:1。
【文檔編號】C12N5/04GK103966154SQ201310045707
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優先權日:2013年2月5日
【發明者】劉建國, 李俊鵬, 龐通, 李虎, 林偉 申請人:中國科學院海洋研究所