亞歷山大病相關(guān)基因突變、其檢測方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及遺傳神經(jīng)疾病領(lǐng)域，具體而言涉及亞歷山大病領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明公開了亞歷山大病相關(guān)基因突變、其檢測方法及其用途。本發(fā)明提供了亞歷山大病的生物標(biāo)記物，即突變的GFAP基因或蛋白：c.1289G>A、p.R430H；檢測突變的GFAP基因或蛋白的方法；所述方法中使用的引物對和探針；以及包含所述引物對和探針的試劑盒。
【專利說明】亞歷山大病相關(guān)基因突變、其檢測方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及遺傳神經(jīng)疾病領(lǐng)域，具體而言涉及亞歷山大病。
【背景技術(shù)】
[0002]亞歷山大病是一種罕見的致命性的遺傳神經(jīng)性退化疾病。1949年由亞歷山大首先提出此病，是一種由于星型膠質(zhì)細(xì)胞功能異常導(dǎo)致的腦白質(zhì)營養(yǎng)不良性疾病。典型病例表現(xiàn)為以額葉為主的白質(zhì)異常和巨腦，組織學(xué)檢測顯示腦內(nèi)存在Rosenthal纖維，為中間絲等幾種類型細(xì)胞細(xì)胞骨架的組成部分，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞。亞歷山大病的診斷標(biāo)準(zhǔn):以額葉為主的廣泛腦白質(zhì)異常；腦室周緣Tl加權(quán)像呈高信號而T2加權(quán)像呈低信號；基底節(jié)和丘腦異常；腦干異常，特別累及了中腦和延髓；一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)(包括腦室周緣、額葉白質(zhì)、視交叉、穹隆、基底節(jié)、丘腦、齒狀核和腦干)的對比強(qiáng)化。以上5條標(biāo)準(zhǔn)符合4條即可確診。
[0003]亞歷山大病的遺傳方式尚不十分清楚，多為散發(fā)病例，也有一些家系報(bào)道，可能為常染色體顯性遺傳。根據(jù)發(fā)病年齡及臨床表現(xiàn)的不同，通常可分為嬰兒型、青年型和成年型。嬰兒型，目前為最常見類型，多在2歲以內(nèi)起病，表現(xiàn)為智力發(fā)育遲緩、肢無力、肌張力降低、吸吮、飲水困難、構(gòu)音不清、小腦性共濟(jì)失調(diào)，70%的患者有癲癇發(fā)作、巨腦。嬰兒型亞歷山大病的病情嚴(yán)重，常在10歲前死亡。青年型，比嬰兒型少見，在4-14歲起病，男女均可發(fā)病臨床特征與嬰兒型有很多相似處，不同點(diǎn)為少見癲癇發(fā)作、巨腦表現(xiàn)。青年型亞歷山大病的病情發(fā)展相對緩慢。成年型，罕見，在20-70歲起病，男女均可發(fā)病，首先表現(xiàn)為下丘腦、腦干和脊髓受損的癥狀。成年型亞歷山大病的病情進(jìn)展緩慢，臨床上不易與多發(fā)性硬化相鑒別。研究表明，雖然各種類型亞歷山大病的臨床表型不同，但是截止到目前發(fā)現(xiàn)的各種類型亞歷山大病的大部分病例均為GFAP基因突變，但是也有部分確診為亞歷山大病患者中并沒有發(fā)現(xiàn)GFAP基因突變。另外，2%存在GFAP基因突變的人表型正常。對于GFAP基因突變的病例，相同的GFAP突變位點(diǎn)，男女患者臨床癥狀不同，這提示性別可能會影響亞歷山大疾病的發(fā)展程度。對于GFAP基因突變的家系病例，相同的GFAP基因突變位點(diǎn)，但是家系內(nèi)患者臨床癥狀不同，這提示可能存在修飾基因或者其他因素導(dǎo)致患者的臨床特性不一致。
[0004]因此，有必要深入研究亞歷山大病的遺傳機(jī)制。而且，本領(lǐng)域仍然需要發(fā)現(xiàn)亞歷山大病相關(guān)的基因突變，以及檢測亞歷山大病的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及到的一個(gè)患病家系，兩個(gè)患者，同母異父，父母正常。兩名患者臨床表型不一致，而影像學(xué)MRI檢測發(fā)現(xiàn)兩名患者均具有成年型亞歷山大疾病的特征。
[0006]本發(fā)明人經(jīng)過不懈的努力，發(fā)現(xiàn)了亞歷山大病基因的新突變，并由此提供了下述發(fā)明:
[0007]本發(fā)明涉及亞歷山大病基因新的突變，具體為:GFAP基因c.1289G>A (p.R430H)；HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)，其中 GFAP 蛋白突變 p.R430H 發(fā)生在 GFAP-ε 上。
[0008]在第一方面，本發(fā)明涉及亞歷山大病的生物標(biāo)記物，即突變的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白，所述生物標(biāo)記物是具有選自如下的突變基因或蛋白:
[0009]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0010]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變GFAP基因分別為具有以下突變的SEQ ID N0:1:c.1289G>A。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變HDAC6基因分別為具有以下突變的SEQ IDNO:2:c.2566C>T。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變的GFAP-ε蛋白為具有以下突變的SEQ IDNO:3:p.R430H。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變的HDAC6蛋白為具有以下突變的SEQ ID NO:4:p.P856S。
[0015]在第二方面，本發(fā)明涉及一種檢測亞歷山大病的方法，所述方法包括檢測受試者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突變位點(diǎn)，如果有突變位點(diǎn)，則所述受試者被鑒定為患有亞歷山大病或易患亞歷山大病，或者其后代會患有亞歷山大病或易患亞歷山大病，所述突變位點(diǎn)選自如下任一種或其組合:
[0016]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0017]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，GFAP基因?yàn)镾EQ ID N0:1的序列表不。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，GFAP- ε蛋白為SEQ ID NO:3的序列表示。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC6基因?yàn)镾EQ ID NO:2的序列表示。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC6蛋白為SEQ ID NO:4的序列表示。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測亞歷山大病的方法包括如下至少一組引物擴(kuò)增的步驟:
[0023]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0024]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測亞歷山大病的方法中檢測突變位點(diǎn)通過選自如下的技術(shù)進(jìn)行:測序、電泳、核酸雜交、原位雜交、PCR、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)和變性高效液相色
-1'TfeP曰。
[0026]在本發(fā)明第二方面的方法中，優(yōu)選檢測雜合的突變GFAP基因。
[0027]在本發(fā)明第二方面的方法中，優(yōu)選檢測純合的突變HDAC6基因。
[0028]在第三方面，本發(fā)明涉及一種檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法，所述方法包括檢測受試者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突變位點(diǎn)，所述突變位點(diǎn)選自如下任一種或其組合:
[0029]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0030]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方案中，GFAP基因?yàn)镾EQ ID NO:1的序列表示。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中，GFAP- ε蛋白為SEQ ID NO:3的序列表示。[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC6基因?yàn)镾EQ ID NO:2的序列表示。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC6蛋白為SEQ ID NO:4的序列表示。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法包括如下至少一組引物擴(kuò)增的步驟:
[0036]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0037]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法中檢測突變位點(diǎn)通過選自如下的技術(shù)進(jìn)行:測序、電泳、核酸雜交、原位雜交、PCR、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)和變性高效液相色譜。
[0039]在第四方面，本發(fā)明涉及通過PCR檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中使用的引物對，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0040]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0041]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0042]其中所述引物對分別基于選自如下的位置在基因組序列或cDNA序列上前后設(shè)計(jì)，使得擴(kuò)增該位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。 [0043]在第五方面，本發(fā)明涉及與突變GFAP和/或HDAC6基因互補(bǔ)的核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0044]GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
[0045]HDAC6 基因 c.2566C>T。
[0046]所述探針與突變GFAP和/或HDAC6基因的互補(bǔ)區(qū)包括選自如下的基因組序列或cDNA序列上的位置:GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。
[0047]在第六方面，本發(fā)明涉及檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的試劑盒，包含一組或多組引物對，其中所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0048]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0049]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0050]其中所述引物對分別基于選自如下的位置在基因組序列或cDNA序列上設(shè)計(jì)，使得其擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋該位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566 位。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的試劑盒包含選自如下的至少一組引物:
[0052]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0053]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0054]在第七方面，本發(fā)明涉及檢測突變GFAP和/或HDAC6基因的試劑盒，包含一個(gè)或多個(gè)核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0055]GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
[0056]HDAC6 基因 c.2566C>T。
[0057]所述探針與突變GFAP和/或HDAC6基因上包含選自如下位置的基因組序列或cDNA序列上的區(qū)域互補(bǔ):GFAP基因cDNA序列弟1289似和/或HDAC6基因cDNA序列弟2566位。
[0058]在第八方面，本發(fā)明涉及GFAP基因的突變外顯子7A和/或HDAC6基因突變外顯子25。
[0059]在本發(fā)明中，引物對SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6用于擴(kuò)增GFAP基因的野生型或突變外顯子7A ;引物對SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8用于擴(kuò)增HDAC6基因的野生型或突變外顯子25。
[0060]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的GFAP基因的雜合突變即致病；而本發(fā)明的HDCA6基因雜合并不致病，如本文中患者的母親，本發(fā)明的HDCA6基因突變使患者的臨床病癥不同。
[0061]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了亞歷山大病相關(guān)基因的2個(gè)新的突變位點(diǎn)，對該基因位點(diǎn)的檢測可能用于亞歷山大病患者的輔助診斷，并且可能有利于明確亞歷山大病患者的分子診斷。因此，本發(fā)明的檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法可以用于診斷亞歷山大病的目的，例如產(chǎn)前診斷、植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)、患者篩查。然而，本發(fā)明的方法并不僅限于用于診斷疾病的目的。
[0062]另外，本發(fā)明的檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法也可以用于非診斷疾病的目的。所述的非檢測疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多態(tài)性，用于家族演化研究。本發(fā)明可以對亞歷山大病的發(fā)病機(jī)理提供重要線索，對亞歷山大病的診斷治療具有十分重要的意義。這樣的應(yīng)用也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的。
[0063]例如，根據(jù)本文的描述可以看出，有些個(gè)體攜帶本發(fā)明所述的突變HDAC6基因但不患亞歷山大病，例如僅一條染色體攜帶突變的雜合基因型。對這部分人群的檢測可以任何不涉及診斷疾病的目的，因?yàn)檫@些個(gè)體并不患病。但對于他們進(jìn)行檢測的結(jié)果可以作為例如有用信息使用，例如作為育前檢查的重要指標(biāo)，指導(dǎo)生育，或者用于突變攜帶者篩查，或者作為SNP分布和多態(tài)性研究的工具或者追蹤基因突變或家族演化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0064]圖1患者家系圖，示出患者(I1-2、I1-4)及其父母(1-1-3)、兄弟姐妹(ΙΙ-1、ΙΙ-3和I1-5-7)和子女(II1-1-4)的關(guān)系圖。圓表示女性，方框表示男性。
[0065]圖2患者腦部MRI圖，其中患者Ptl (b、C、d、e、g),患者Pt2 (a、f)。
[0066]圖3GFP轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)圖。
[0067]圖4患者Ptl、Pt2及患者母親GFP突變位點(diǎn)的測序。
[0068]圖5患者Ptl、Pt2及患者母親HDAC6突變位點(diǎn)的測序圖。Wt是指野生型。
[0069]圖6HDAC6功能驗(yàn)證。Ct指對照。
[0070]野生型HDAC6基因和GFAP基因的cDNA和所編碼的蛋白序列說明(下劃線示出本發(fā)明相關(guān)的突變發(fā)生的位置):
[0071]GFAPcDNA，示出野生型GFAP基因的cDNA的核苷酸序列，1296nt (SEQ ID NO:1):
[0072]A TGGAGAGGAGACGCATCACCTCCGCTGCTCGCCGCTCCTACGTCTCCTCAGGGGAGATGATGGTGGGGGGCCTGGCTCCTGGCCGCCGTCTGGGTCCTGGCACCCGCCTCTCCCTGGCTCGAATGCCCCCTCCACTCCCGACCCGGGTGGATTTCTCCCTGGCTGGGGCACTCAATGCTGGCTTCAAGGAGACCCGGGCCAGTGAGCGGGCAGAGATGATGGAGCTCAATGACCGCTTTGCCAGCTACATCGAGAAGGTTCGCTTCCTGGAACAGCAAAACAAGGCGCTGGCTGCTGAGCTGAACCAGCTGCGGGCCAAGGAGCCCACCAAGCTGGCAGACGTCTACCAGGCTGAGCTGCGAGAGCTGCGGCTGCGGCTCGATCAACTCACCGCCAACAGCGCCCGGCTGGAGGTTGAGAGGGACAATCTGGCACAGGACCTGGCCACTGTGA
GGCAGAAGCTCCAGGATGAAACCAACCTGAGGCTGGAAGCCGAGAACAACCTGGCTGCCTATAGACAGGAAGCAGAT
GAAGCCACCCTGGCCCGTCTGGATCTGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGGAGGAGGAGATCCGGTTCTTGAGGAAGAT
CCACGAGGAGGAGGTTCGGGAACTCCAGGAGCAGCTGGCCCGACAGCAGGTCCATGTGGAGCTTGACGTGGCCAAGC
CAGACCTCACCGCAGCCCTGAAAGAGATCCGCACGCAGTATGAGGCAATGGCGTCCAGCAACATGCATGAAGCCGAA
GAGTGGTACCGCTCCAAGTTTGCAGACCTGACAGACGCTGCTGCCCGCAACGCGGAGCTGCTCCGCCAGGCCAAGCA
CGAAGCCAACGACTACCGGCGCCAGTTGCAGTCCTTGACCTGCGACCTGGAGTCTCTGCGCGGCACGAACGAGTCCC
TGGAGAGGCAGATGCGCGAGCAGGAGGAGCGGCACGTGCGGGAGGCGGCCAGTTATCAGGAGGCGCTGGCGCGGCTG
GAGGAAGAGGGGCAGAGCCTCAAGGACGAGATGGCCCGCCACTTGCAGGAGTACCAGGACCTGCTCAATGTCAAGCT
GGCCCTGGACATCGAGATCGCCACCTACAGGAAGCTGCTAGAGGGCGAGGAGAACCGGATCACCATTCCCGTGCAGA
CCTTCTCCAACCTGCAGATTCGAGGGGGCAAAAGCACCAAAGACGGGGAAAATCACAAGGTCACAAGATATCTCAAA
AGCCTCACAATACGAGTTATACCAATACAGGCTCACCAGATTGTAAATGGAACGCCGCCGGCTCGCGGTTAG
[0073]HDAC6cDNA，示出野生型 HDAC6 基因的 cDNA 的核苷酸序列，3648nt(SEQ ID N0:2):
[0074]ATGACCTCAACCGGCCAGGATTCCACCACAACCAGGCAGCGAAGAAGTAGGCAGAACCCCCAGTCGCCCCCTCAGGACTCCAGTGTCACTTCGAAGCGAAATATTAAAAAGGGAGCCGTTCCCCGCTCTATCCCCAATCTAGCGGAGGTAAAGAAGAAAGGCAAAATGAAGAAGCTCGGCCAAGCAATGGAAGAAGACCTAATCGTGGGACTGCAAGGGATGGATCTGAACCTTGAGGCTGAAGCACTGGCTGGCACTGGCTTGGTGTTGGATGAGCAGTTAAATGAATTCCATTGCCTCTGGGATGACAGCTTCCCGGAAGGCCCTGAGCGGCTCCATGCCATCAAGGAGCAACTGATCCAGGAGGGCCTCCTAGATCGCTGCGTGTCCTTTCAGGCCCGGTTTGCTGAAAAGGAAGAGCTGATGTTGGTTCACAGCCTAGAATATATTGATCTGATGGAAACAACCCAGTACATGAATGAGGGAGAACTCCGTGTCCTAGCAGACACCTACGACTCAGTTTATCTGCATCCGAACTCATACTCCTGTGCCTGCCTGGCCTCAGGCTCTGTCCTCAGGCTGGTGGATGCGGTCCTGGGGGCTGAGATCCGGAATGGCATGGCCATCATTAGGCCTCCTGGACATCACGCCCAGCACAGTCTTATGGATGGCTATTGCATGTTCAACCACGTGGCTGTGGCAGCCCGCTATGCTCAACAGAAACACCGCATCCGGAGGGTCCTTATCGTAGATTGGGATGTGCACCACGGTCAAGGAACACAGTTCACCTTCGACCAGGACCCCAGTGTCCTCTATTTCTCCATCCACCGCTACGAGCAGGGTAGGTTCTGGCCCCACCTGAAGGCCTCTAACTGGTCCACCACAGGTTTCGGCCAAGGCCAAGGATATACCATCAATGTGCCTTGGAACCAGGTGGGGATGCGGGATGCTGACTACATTGCTGCTTTCCTGCACGTCCTGCTGCCAGTCGCCCTCGAGTTCCAGCCTCAGCTGGTCCTGGTGGCTGCTGGATTTGATGCCCTGCAAGGGGACCCCAAGGGTGAGATGGCCGCCACTCCGGCAGGGTTCGCCCAGCTAACCCACCTGCTCATGGGTCTGGCAGGAGGCAAGCTGATCCTGTCTCTGGAGGGTGGCTACAACCTCCGCGCCCTGGCTGAAGGCGTCAGTGCTTCGCTCCACACCCTTCTGGGAGACCCTTGCCCCATGCTGGAGTCACCTGGTGCCCCCTGCCGGAGTGCCCAGGCTTCAGTTTCCTGTGCTCTGGAAGCCCTTGAGCCCTTCTGGGAGGTTCTTGTGAGATCAACTGAGACCGTGGAGAGGGACAACATGGAGGAGGACAATGTAGAGGAGAGCGAGGAGGAAGGACCCTGGGAGCCCCCTGTGCTCCCAATCCTGACATGGCCAGTGCTACAGTCTCGCACAGGGCTGGTCTATGACCAAAATATGATGAATCACTGCAACTTGTGGGACAGCCACCACCCTGAGGTACCCCAGCGCATCTTGCGGATCATGTGCCGTCTGGAGGAGCTGGGCCTTGCCGGGCGCTGCCTCACCCTGACACCGCGCCCTGCCACAGAGGCTGAGCTGCTCACCTGTCACAGTGCTGAGTACGTGGGTCATCTCCGGGCCACAGAGAAAATGAAAACCCGGGAGCTGCACCGTGAGAGTTCCAACTTTGACTCCATCTATATCTGCCCCAGTACCTTCGCCTGTGCACAGCTTGCCACTGGCGCTGCCTGCCGCCTGGTGGAGGCTGTGCTCTCAGGAGAGGTTCTGAATGGTGCTGCTGTGGTGCGTCCCCCAGGACACCACGCAGAGCAGGATGCAGCTTGCGGTTTTTGCTTTTTCAACTCTGTGGCTGTGGCTGCTCGCCATGCCCAGACTATCAGTGGGCATGCCCTACGGATCCTGATTGTGGATTGGGATGTCCACCACGGTAATGGAACTCAGCACATGTTTGAGGATGACCCCAGTGTGCTATATGTGTCCCTGCACCGCTATGATCATGGCACCTTCTTCCCCATGGGGGATGAGGGTGCCAGCAGCCAGA
TCGGCCGGGCTGCGGGCACAGGCTTCACCGTCAACGTGGCATGGAACGGGCCCCGCATGGGTGATGCTGACTACCTA
GCTGCCTGGCATCGCCTGGTGCTTCCCATTGCCTACGAGTTTAACCCAGAACTGGTGCTGGTCTCAGCTGGCTTTGA
TGCTGCACGGGGGGATCCGCTGGGGGGCTGCCAGGTGTCACCTGAGGGTTATGCCCACCTCACCCACCTGCTGATGG
GCCTTGCCAGTGGCCGCATTATCCTTATCCTAGAGGGTGGCTATAACCTGACATCCATCTCAGAGTCCATGGCTGCC
TGCACTCGCTCCCTCCTTGGAGACCCACCACCCCTGCTGACCCTGCCACGGCCCCCACTATCAGGGGCCCTGGCCTC
AATCACTGAGACCATCCAAGTCCATCGCAGATACTGGCGCAGCTTACGGGTCATGAAGGTAGAAGACAGAGAAGGAC
CCTCCAGTTCTAAGTTGGTCACCAAGAAGGCACCCCAACCAGCCAAACCTAGGTTAGCTGAGCGGATGACCACACGA
GAAAAGAAGGTTCTGGAAGCAGGCATGGGGAAAGTCACCTCGGCATCATTTGGGGAAGAGTCCACTCCAGGCCAGAC
TAACTCAGAGACAGCTGTGGTGGCCCTCACTCAGGACCAGCCCTCAGAGGCAGCCACAGGGGGAGCCACTCTGGCCC
AGACCATTTCTGAGGCAGCCATTGGGGGAGCCATGCTGGGCCAGACCACCTCAGAGGAGGCTGTCGGGGGAGCCACT
CCGGACCAGACCACCTCAGAGGAGACTGTGGGAGGAGCCATTCTGGACCAGACCACCTCAGAGGATGCTGTTGGGGG
AGCCACGCTGGGCCAGACTACCTCAGAGGAGGCTGTAGGAGGAGCTACACTGGCCCAGACCACCTCGGAGGCAGCC ATGGAGGGAGCCACACTGGACCAGACTACGTCAGAGGAGGCTCCAGGGGGCACCGAGCTGATCCAAACTCCTCTAGC
CTCGAGCACAGACCACCAGACCCCCCCAACCTCACCTGTGCAGGGAACTACACCCCAGATATCTCCCAGTACACTGA
TTGGGAGTCTCAGGACCTTGGAGCTAGGCAGCGAATCTCAGGGGGCCTCAGAATCTCAGGCCCCAGGAGAGGAGAAC
CTACTAGGAGAGGCAGCTGGAGGTCAGGACATGGCTGATTCGATGCTGATGCAGGGATCTAGGGGCCTCACTGATCA
GGCCATATTTTATGCTGTGACACCACTGCCCTGGTGTCCCCATTTGGTGGCAGTATGCCCCATACCTGCAGCAGGCC
TAGACGTGACCCAACCTTGTGGGGACTGTGGAACAATCCAAGAGAATTGGGTGTGTCTCTCTTGCTATCAGGTCTAC
TGTGGTCGTTACATCAATGGCCACATGCTCCAACACCATGGAAATTCTGGACACCCGCTGGTCCTCAGCTACATCGA
CCTGTCAGCCTGGTGTTACTACTGTCAGGCCTATGTCCACCACCAGGCTCTCCTAGATGTGAAGAACATCGCCCACC
AGAACAAGTTTGGGGAGGATATGCCCCACCCACACTAA
[0075]GFP蛋白序列，示出GFAPcDNA序列編碼的膠質(zhì)纖維酸性蛋白的氨基酸序列，43Iaa(SEQ ID N0:3):
[0076]MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRGGKSTKDGENHKVTRYLKSLTIRVIPIQAHQIVNGTPPARG
[0077]HDAC6蛋白序列，示出HDAC6cDNA序列編碼的組蛋白去乙酰化酶6的氨基酸序列，1215aa (SEQ ID N0:4):
[0078]MTSTGQDSTTTRQRRSRQNPQSPPQDSSVTSKRNIKKGAVPRSIPNLAEVKKKGKMKKLGQAMEEDLIVGLQGMDLNLEAEALAGTGLVLDEQLNEFHCLWDDSFPEGPERLHAIKEQLIQEGLLDRCVSFQARFAEKEELMLVHSLEYIDLMETTQYMNEGELRVLADTYDSVYLHPNSYSCACLASGSVLRLVDAVLGAEIRNGMAIIRPPGHHAQHSLMDGYCMFNHVAVAARYAQQKHRIRRVLIVDWDVHHGQGTQFTFDQDPSVLYFSIHRYEQGRFWPHLKASNWSTTGFGQGQGYTINVPWNQVGMRDADYIAAFLHVLLPVALEFQPQLVLVAAGFDALQGDPKGEMAATPAGFAQLTHLLMGLAGGKLILSLEGGYNLRALAEGVSASLHTLLGDPCPMLESPGAPCRSAQASVSCALEALEPFWEVLVRSTETVERDNMEEDNVEESEEEGPffEPPVLPILTWPVLQSRTGLVYDQNMMNHCNLWDSHHPEVPQRILRIMCRLEELGLAGRCLTLTPRPATEAELLTCHSAEYVGHLRATEKMKTRELHRESSNFDSIYICPSTFACAQLATGAACRLVEAVLSGEVLNGAAVVRPPGHHAEQDAACGFCFFNSVAVAARHAQTISGHALRILIVDWDVHHGNGTQHMFEDDPSVLYVSLHRYDHGTFFPMGDEGASSQIGRAAGTGFTVNVAWNGPRMGDADYLAAWHRLVLPIAYEFNPELVLVSAGFDAARGDPLGGCQVSPEGYAHLTHLLMGLASGRIILILEGGYNLTSISESMAACTRSLLGDPPPLLTLPRPPLSGALASITETIQVHRRYffRSLRVMKVEDREGPSSSKLVTKKAPQPAKPRLAERMTTREKKVLEAGMGKVTSASFGEESTPGQTNSETAVVALTQDQPSEAATGGATLAQTISEAAIGGAMLGQTTSEEAVGGATPDQTTSEETVGGAILDQTTSEDAVGGATLGQTTSEEAVGGATLAQTTSEAAMEGATLDQTTSEEAPGGTELIQTPLASSTDHQTPPTSPVQGTTPQISPSTLIGSLRTLELGSESQGASESQAPGEENLLGEAAGGQDMADSMLMQGSRGLTDQAIFYAVTPLPWCPHLVAVCPIPAAGLDVTQPC⑶CGTIQENWVCLSCYQVYCGRYINGHMLQHHGNSGHPLVLSYIDLSAWCYYCQAYVHHQALLDVKNIAHQNKFGEDMPHPH
【具體實(shí)施方式】
[0079]發(fā)明人收集到一個(gè)意大利的異父同胞家系，父母(圖1中I中的1-3)表型正常，異父同胞的女性患者(I1-2)和男性患者(I1-4)均表現(xiàn)為神經(jīng)類疾病，但是兩者臨床癥狀不同。
[0080]患者Ptl (圖1，11-2)，女，68歲。55歲發(fā)病，起病隱襲、智力減退伴隨中度共濟(jì)失調(diào)、構(gòu)音障礙、吞咽困難、腭肌陣攣。61歲腦電圖EEG檢查表現(xiàn)出非特異性刺激性異常、PEV改變、EMG正常、眼球運(yùn)動正常、簡易精神狀態(tài)檢查MMSE得分為22/30。該綜合征病程發(fā)病緩慢、起病時(shí)出現(xiàn)尿失禁。
[0081]患者Pt2 (圖1，11_4)，男，60歲。52歲因隱襲性漸進(jìn)性行走困難就診、患者46歲時(shí)出現(xiàn)右下肢僵硬無力、3-5年后逐漸累及到右上肢和左上下肢。56歲需輔助輪椅行走；發(fā)音、吞咽困難；伴隨嚴(yán)重四痙攣、雙側(cè)踝陣攣；雙側(cè)巴賓斯基征；雙側(cè)顳肌、骨間肌和脛骨前肌發(fā)育不良。感官檢驗(yàn)和植物神經(jīng)系統(tǒng)檢查均正常，例如眼球運(yùn)動正常。肌電圖EMG顯示神經(jīng)源性異常、無自發(fā)顫動。神經(jīng)傳導(dǎo)研究表明，下肢運(yùn)動性軸索型神經(jīng)病變、外周感覺神經(jīng)傳導(dǎo)正常。上述檢測結(jié)果顯示患者具有嚴(yán)重的肢體和延髓區(qū)運(yùn)動神經(jīng)元疾病(MND);病程呈緩慢、漸進(jìn)性發(fā)展；患者無認(rèn)知功能減退。
[0082]顱腦MRI (來自患者Ptl和Pt2在醫(yī)院檢查的圖像。圖2，其中患者Ptl (b、c、d、e、g)，患者Pt2 (a、f))示兩個(gè)患者均表現(xiàn)出輕微的惡化，包括蝌蚪狀的延髓和頸脊髓萎縮，前后中央腦回和額底區(qū)呈現(xiàn)萎縮段，齒狀核，腦室周緣、皮質(zhì)下白質(zhì)異常信號，與文獻(xiàn)中亞歷山大病患者M(jìn)RI的癥狀極為相似。
[0083]由于患者Ptl和Pt2為同母異父，因此對mtDNA進(jìn)行了測序，未發(fā)現(xiàn)mtDNA基因突變，排除了線粒體遺傳mtDNA基因突變導(dǎo)致的疾病。發(fā)明人對GFAP的9個(gè)外顯子進(jìn)行了sanger測序未見突變，因此發(fā)明人利用Agilent Sureselect50M Kit結(jié)合Solexa高通量測序技術(shù)對病例PtI和Pt2進(jìn)行了外顯子組測序，具體方法參見實(shí)施列3。
[0084]結(jié)果，發(fā)明人在病例Ptl中發(fā)現(xiàn)有87380個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)和6866處的插入/缺失，在病例Pt2中發(fā)現(xiàn)有89065個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)和6760處的插入/缺失。隨后通過 dbSNP 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(www.1OOOgenomes.0rg/)、HapMap8 數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncb1.nlm.nih.gov/)等公共數(shù)據(jù)庫的過濾，去掉所有已知的且在數(shù)據(jù)庫中等位基因頻率大于0.005的變異。去掉同義突變，將剩下的非同義/剪接位點(diǎn)突變和微小插入缺失進(jìn)行優(yōu)先選擇:根據(jù)患者癥狀，優(yōu)先考慮已知亞歷山大病致病基因GFAP基因，發(fā)明人找到了 GFAP基因上的一個(gè)新突變，G到A的錯(cuò)義突變c.1289G>A，導(dǎo)致R430H的氨基酸改變。
[0085]為 了進(jìn)一步解釋Ptl和Pt2臨床癥狀差異是否還有其他突變導(dǎo)致，發(fā)明人進(jìn)一步用 Endeavour software (http://homes.esat.kuleuven.be/bioiuser/endeavour/tool/endeavourweb.php)對候選基因進(jìn)行優(yōu)先級排序,位于染色體Xpll.23的HDAC6基因綜合排名第一，該基因編碼組蛋白去乙酰化酶6。患者Pt2為半合子突變，C到T的錯(cuò)義突變c.25660T,導(dǎo)致P856S氨基酸改變。
[0086]然后，發(fā)明人又通過Polyphen2 (http: / / genetics, bwh.harvard.edu/pph2)、SIFT (http: //sift, bi 1.a-star.edu.Sg)、Mutpred (http: //mutpred.mutdb.0rg)、Pmut (http://mmb.pcb.ub.es/PMut)軟件按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行預(yù)測,進(jìn)一步確認(rèn)了上述2個(gè)
突變基因。
[0087]已知，GFAP基因(0MM:*137780)位于17號染色體，編碼膠質(zhì)纖維酸性蛋白。膠質(zhì)纖維酸性蛋白被認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞的成熟標(biāo)志。對于健康成人，星形膠質(zhì)細(xì)胞占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)的40%。GFAP蛋白是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)中間絲蛋白的主要構(gòu)成部分，在膠質(zhì)細(xì)胞分化中參與細(xì)胞骨架的形成。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)GFAP蛋白在腦損傷發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。GFAP基因突變會導(dǎo)致腦內(nèi)Rosenthal纖維的積累，而腦內(nèi)Rosenthal纖維是確診亞歷山大病的組織學(xué)前提。由于選擇性剪接，GFAP基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，見圖3，GFAP-a (GenBank登錄號 ΝΡ_002046.1)，含有 9 個(gè)外顯子。GFAP- ε (GenBank 登錄號 ΝΡ_001124491.1)，由于選擇性剪接，C末端最后35個(gè)氨基酸與GFAP-α不同。GFAP-κ (GenBank登錄號NP_001229305.1)C末端與GFAP-α不同，存在7B外顯子。最常見的轉(zhuǎn)錄本是GFAP-a，截止到目前，GFAP基因的突變都是在這個(gè)轉(zhuǎn)錄本上。臨床上遺傳檢測通常檢測該轉(zhuǎn)錄本上9個(gè)外顯子是否存在突變。但是目前仍有少數(shù)確診的患者該基因未發(fā)現(xiàn)突變。發(fā)明人在GFAP- a轉(zhuǎn)錄本上尚未找到致病突變，通過外顯子測序后意外發(fā)現(xiàn)，2個(gè)患者GFAP-ε轉(zhuǎn)錄本外顯子7Α編碼區(qū)上均存在c.1289G>A和p.R430H的雜合突變。這個(gè)突變也可以在GFAP-κ轉(zhuǎn)錄本的3，-UTR上找到。
[0088]已知HDAC6基因位于X染色體，編碼組蛋白去乙酰化酶6，為HDAC家族中b類成員之一，催化組蛋白和非組蛋白的賴氨酸殘基去乙酰化。HDAC6蛋白擁有兩個(gè)獨(dú)特的催化區(qū)域，且高度同源，均有去乙酰化酶活性，決定了它可以使不同底物去乙酰化。C末端有一個(gè)保守的半胱氨酸和組氨酸富含區(qū)構(gòu)成鋅指結(jié)構(gòu)ZnF-UBP。在體內(nèi)，HDAC6蛋白能夠催化組蛋白和非組蛋白如去乙酰化酶，在體內(nèi)HDAC6蛋白除有組蛋白去乙酰化酶活性外，還可介導(dǎo)非組蛋白如a-微管蛋白(tubulin)、熱休克蛋白90 (HSP90)和抗氧化蛋白去乙酰化。在小鼠和果蠅的模型中，HDAC6基因的突變會導(dǎo)致如帕金森病、亨廷頓病神經(jīng)退行性變疾病。a -微管蛋白是HDAC6蛋白去乙酰化的底物之一，在體內(nèi)去乙酰化的微管蛋白快速解聚，而乙酰化的a-微管蛋白易于聚集而有利于微管的穩(wěn)定。有意思的是，與肌萎縮性側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis)疾病相關(guān)的 RNA 結(jié)合調(diào)控因子 TDP-43 和 FUS/TLS 以HDAC6mRNA作為特異性底物。在果蠅模型中，沉默TDP-43導(dǎo)致HDAC6基因下調(diào)表達(dá)，而過量表達(dá)HDAC6基因，使患脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)的果蠅癥狀得到緩解。
[0089]由于外顯子組測序存在一定程度的假陽性，接下來，發(fā)明人又利用Sanger測序方法，對這兩個(gè)基因的突變位點(diǎn)在家系內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證，GFAP基因在患者Ptl和Pt2中均為雜合突變，而在家系內(nèi)1-2 (母親)、11-6、11-7、111-1、111_4均無突變(見圖4)。HDAC6基因在患者Pt2中為半合子突變，患者Ptl中無突變，家系內(nèi)1-2 (母親)為雜合突變，11-6、I1-7均無突變(見圖5)。EVS外顯子數(shù)據(jù)庫(http://evs.gs.Washington.edu/EVS)中未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)的突變。
[0090]為了進(jìn)一步解釋HDAC6基因突變導(dǎo)致患者Pt2特有的運(yùn)動神經(jīng)元疾病表型，發(fā)明人測定了 Ptl和Pt2患者以及正常人成纖維細(xì)胞中HDAC6基因的表達(dá)量，結(jié)果表明兩個(gè)患者及對照中HDAC6基因表達(dá)量并無明顯差異(圖6A)。接著發(fā)明人利用免疫沉淀的方法檢測到患者Pt2乙酰化的α-微管蛋白較患者Ptl及對照明顯增加(圖6B)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示患者Pt2成纖維細(xì)胞核周區(qū)域乙酰化α -微管蛋白成塊異常聚集(圖6C，上排、中排為20倍鏡，下排為100倍鏡)。從圖6D可以明顯地看出患者Pt2成纖維細(xì)胞中多葉核/多形核的比例較對照和患者Ptl顯著性增加，而對照和患者Ptl之間無顯著性差異。因此可以推測HDAC6基因突變，導(dǎo)致微管組織中心功能失調(diào)，打破了 α -微管蛋白乙酰化與去乙酰化的動態(tài)平衡，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變，使患者表現(xiàn)出運(yùn)動神經(jīng)元疾病的癥狀。
[0091]因此，綜上所述，發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明找到的GFAP基因的突變是成年型亞歷山大疾病的另一致病突變位點(diǎn)，而HDAC6基因的半合子突變使Pt2患者具有不同于患者Ptl的臨床表型(見表1)。
[0092]表1.2名患者的基因突變位點(diǎn)
【權(quán)利要求】
1.一種亞歷山大病的生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物包括突變的GFAP基因或蛋白: c.1289G>A、p.R430H。
2.權(quán)利要求1的生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物還包括突變的HDAC6基因或蛋白: c.2566C>T、p.P856S。
3.權(quán)利要求1或2的生物標(biāo)記物，所述突變GFAP蛋白為SEQID N0:3的序列中具有以下突變:
p.R430H。
4.權(quán)利要求2的生物標(biāo)記物，所述突變HDAC6蛋白為SEQID N0:4的序列中具有以下突變:
p.P856S。
5.一種檢測受試者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突變位點(diǎn)的方法，所述突變位點(diǎn)選自如下任一種或其組合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S。
6.權(quán)利要求5的方法，包括如下至少一組引物擴(kuò)增的步驟:
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
7.檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中使用的引物對，所述突變是選自如下任一種或其組合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S, 其中所述引物對分別基于選自如下的位置在基因組序列或cDNA序列上前后設(shè)計(jì)，使得擴(kuò)增該位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
8.與突變GFAP和/或HDAC6基因互補(bǔ)的核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合:
GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T, 所述探針與突變GFAP和/或HDAC6基因的互補(bǔ)區(qū)包括選自如下的基因組序列或cDNA序列上的位置:GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
9.檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的試劑盒，包含一組或多組引物對，并且/或者包含一個(gè)或多個(gè)核酸探針，其中所述突變是選自如下任一種或其組合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S, 其中所述引物對分別基于選自如下的位置在基因組序列或cDNA序列上設(shè)計(jì)，使得其擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋該位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，所述引物對選自如下的一組或兩組:
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
【文檔編號】C12N15/11GK103966226SQ201310047545
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月6日
【發(fā)明者】方明艷, 蓋齊·達(dá)尼埃萊, 王海榮, 劉軒竹, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請人:深圳華大基因研究院