3,5-二氟代酪氨酸翻譯系統及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種氨酰基-tRNA合成酶突變體，其為一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列和SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本發明還提供一種3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統，其包含：(i)3，5-二氟代酪氨酸；(ii)本發明的正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5-二氟代酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。
【專利說明】3,5- 二氟代酪氨酸翻譯系統及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物化學領域。具體地，本發明提供一種氨酰基-tRNA合成酶突變體，其為一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本發明還涉及一種3，5_二氟代酪氨酸(簡寫為F2Y)翻譯系統。更具體地，本發明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配對將3，5-二氟代酪氨酸定點特異性插入目標蛋白質的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統，和利用所述翻譯系統在目標蛋白質中定點特異性插入3，5_ 二氟代酪氨酸的方法。本發明還涉及用這套翻譯系統和這種方法產生的含有3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質，例如，插入3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，以及插入3，5- 二氟代酪氨酸的突變蛋白質的應用。
【背景技術】
[0002]蛋白質磷酸化對于許多生物現象的引發是很必要的，包括細胞生長、增殖、泛素(ubiquitin)介導的蛋白降解等過程。特別是酪氨酸磷酸化，作為細胞信號轉導和酶活性調控的一種主要方式，通常通過引發蛋白質之間的相互作用，進而介導生長因子、荷爾蒙和細胞因子等對細胞膜上受體的信號調控。然而，酪氨酸磷酸化在細胞的所有磷酸化修飾中所占的比例卻非常低。大概10%的細胞蛋白會受到磷酸化共價修飾，但每100次蛋白的磷酸化修飾中僅有I次酪氨酸基團的修飾。與大部分細胞中的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化水平相t匕，酪氨酸磷酸化的水平估計要低2000倍。正是由于細胞中酪氨酸磷酸化的水平相當低，才能保證細胞在內外信號的刺激下，作出靈敏的反應，所以研究酪氨酸的磷酸化對于細胞信號的調控和許多重要 生物現象的研究具有極為重要的意義，而對發生酪氨酸磷酸化的蛋白質的識別及磷酸化位點的鑒定對揭示細胞過程的調控和藥物的作用位點起到非常重要的作用。
[0003]19F-NMR技術由于其化學位移范圍大、不易出現峰重疊及靈敏度高等優點，自上個世紀50年代出現以來，在分析光學異構體、生命科學等研究中有其特殊意義。在體內核磁共振技術中，19F-NMR與其他方法相比，在不損傷樣品的條件下，就可進行實時定量監測。近30年，引入氟代指示劑進行體內19F-NMR的研究，含氟生物活性物質以及含氟材料的研究受到很大的重視，19F-NMR技術及其應用發展起來。從近10年的情況來看，含氟生物活性物質的研究以及在醫藥、農藥和具有優異性能的含氟材料的研究應用受到很大的重視，這是近期19F-NMR研究發展的一個主要特點。
[0004]根據先前的報道，含有3，5-二氟代酪氨酸的肽段作為蛋白酪氨酸激酶的底物，其表現出了與相應的含有酪氨酸的肽段作為底物類似的效率，并且不會顯著影響蛋白酪氨酸磷酸酶的催化活性。因此本研究旨在通過遺傳密碼擴展，用非天然氨基酸3，5_ 二氟代酪氨酸替代酪氨酸，使其作為氟代指示劑，從而可以通過19F-NMR技術來檢測及量化酪氨酸磷酸化水平。同時，本研究現已開發了在原核和真核生物中將各種非天然氨基酸體內位點特異性地定點插入蛋白質的通用方法。這些方法依賴于正交蛋白質翻譯組分，所述組分識別合適的選擇密碼子(selector codon)從而能在體內多肽翻譯期間將所需的非天然氨基酸插入限定位置。這些方法利用識別選擇密碼子的正交tRNA (Ο-tRNA)，而相應的特異性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該Ο-tRNA。這些組分不與宿主生物體內的任何內源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密碼子交叉反應(B卩，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對可能遺傳編碼大量結構各異的非天然氨基酸。
[0005]本領域普遍知道利用適合于制備含一個或多個非天然氨基酸的蛋白質的正交翻譯系統，例如產生正交翻譯系統的通用方法。例如，參見國際公布號WO 2002/086075，其發明名稱為 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS” ；TO 2002/085923，其發明名稱為 “ IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”;W0 2004/094593，其發明名稱為“EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定點特異性插入非天然氨基酸的正交翻譯系統及它們的產生和使用方法的其他討論還可參見Wang和Schultz, Chem.Commun.(Camb) I:1-11(2002) ；ffang 和 Schultz, Angewandte Chemie Int.Ed.44(I):34-66(2005) ；Xie 和Schultz, Methods36 (3):227-238 (2005) ；Xie 和 Schultz, Curr.0pinion in ChemicalBiology9 (6):548-554(2005) ；ffang 等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35:225-249(2006)。

【發明內容】

[0006]1、技術問題
[0007]本發明提供一種氨酰基-tRNA合成酶突變體，其為一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列 選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。這種氨酰基-tRNA合成酶突變體能夠用3，5-二氟代酪氨酸(簡寫為F2Y)優先氨酰化與之配對的正交tRNA，從而在翻譯的氨基酸序列中插入F2Y。這是本發明人首次發現的，同時，本發明人還解析了它的高分辨率晶體結構，相應地，在本發明中將其命名為正交3，5- 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)。
[0008]在上述發現的基礎上，本發明提供一種利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配對將3，5- 二氟代酪氨酸定點特異性插入目標蛋白質的3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統，和利用所述翻譯系統在目標蛋白質中定點特異性插入3，5_ 二氟代酪氨酸的方法。本發明還涉及用這種翻譯系統和這種方法產生的含有3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質及其應用。
[0009]因此，本發明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配對將3，5_ 二氟代酪氨酸定點特異性插入蛋白質的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統，并且提供利用該翻譯系統在目標蛋白質中定點特異性插入3，5-二氟代酪氨酸的方法。
[0010]本發明還提供利用本發明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統產生的含有至少一個3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質。在本發明的優選方面中，本發明人利用這種方法將3，5-二氟代酪氨酸定點特異性插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，原核蛋白酪氨酸激酶Etk。通過本發明的方法得到的包含3，5_二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體蛋白可以作為氟代指示劑，從而通過19F-NMR技術來檢測及量化酪氨酸磷酸化水平。然而，本領域技術人員應該理解，本發明的方法也可以用于在蛋白酪氨酸激酶之外的多種蛋白中定點特異性插入3，5-二氟代酪氨酸，并不局限于該蛋白。2、技術方案
[0011]本發明人經過篩選，獲得一種正交氨酰基-tRNA合成酶突變體，其為一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列和SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的酶活性，在本發明中將其命名為正交3，5- 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)。同時，本發明人還解析了它的高分辨率晶體結構。并且，本發明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研發了 3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統。
[0012]本領域技術人員應該理解，在本發明中，除了 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之外，術語“本發明的正交氨酰基-tRNA合成酶”或“正交3，5- 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”還包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的保守性變體，只要所述保守性變體具有與SEQID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且還包括將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0013]并且，編碼本發明的正交3，5_ 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)的核苷酸序列也包括在本發明的范圍內。優選地，所述編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:3所示。
[0014]具體來說，本發明提供在體內(例如在宿主細胞內)識別選擇密碼子(selectorcodon)如琥珀終止密碼子(TAG)從而將非天然氨基酸3，5-二氟代酪氨酸定點特異性插入到多肽鏈中的3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統。所述3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統包含不與宿主細胞翻譯機制相互作用的正交-tRNA (Ο-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)配對。即，宿主細胞內源性氨酰基-tRNA合成酶不會識別Ο-tRNA。類似地，本發明提供的O-RS不以顯著水平或者某些情況下不以可檢測水平地識別內源性tRNA。利用所述翻譯系統能夠產生在翻譯過程中定點特異性插入3，5- 二氟代酪氨酸的大量蛋白質。
[0015]在一些方面中，本發明提供3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統。所述翻譯系統包含:
[0016](a)非天然氨基酸，即3，5-二氟代酪氨酸，
[0017](b)本發明的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和
[0018](c)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3，5-二氟代酪氨酸)，優先氨酰化所述0-tRNA。
[0019]優選地，本發明的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統還包含編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識別的至少一個選擇密碼子，優選地為琥珀密碼子。更優選地，本發明的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統還包含編碼正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0020]所述系統中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)即為本發明人首次發現的氨酰基tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列和SEQID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
[0021] 在本發明的優選方面中，本發明提供一種3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統，所述系統包含:[0022](i) 3，5- 二氟代酪氨酸；
[0023](ii)本發明的正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0024](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0025](iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。
[0026]優選地，所述3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統還包含編碼本發明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0027]該翻譯系統中的各種組分可以衍生自各種物種來源，例如，該翻譯系統中的各組分衍生自詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA (Ο-tRNA)為古菌來源的反密碼子突變為與琥珀密碼互補的酪氨酸tRNA。在一些實施方式中，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些實施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，優選地，Ο-tRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。在一個實施方式中，用于該系統的正交氨酰基-tRNA合成酶可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列及該序列的保守變體。在優選的實施方案中，用于該系統的正交氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:4所示。
[0028]在一些方面中，本發明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統還包含編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識別的至少一個選擇密碼子。在優選方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。 [0029]在一些方面中，本發明提供包含編碼本發明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相對應的正交tRNA序列的宿主細胞。所用的宿主細胞不作具體限定，只要正交氨酰基-tRNA合成酶和正交tRNA在它們的宿主細胞環境中保留它們的正交性即可。例如，所述宿主細胞可以是真細菌細胞，優選大腸桿菌。
[0030]本發明還提供產生在至少一個所選位置定點特異性插入3，5- 二氟代酪氨酸的突變蛋白質的方法。所述方法利用上述3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統。所述方法通常包括下述步驟:
[0031](a)提供含有以下組分的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統的步驟:
[0032](i)非天然氨基酸，即3，5- 二氟代酪氨酸；
[0033](ii)本發明的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；
[0034](iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用3, 5- 二氟代酪氨酸優先氨酰化所述Ο-tRNA ;和
[0035](iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；
[0036](b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標蛋白質的核酸序列克隆并轉化到適當的宿主細胞中，在培養基中加入3，5- 二氟代酪氨酸，在所述目標蛋白質的翻譯過程中，3，5- 二氟代酪氨酸氨酰化的正交RNA識別編碼所述目標蛋白質的mRNA上的選擇密碼子以及3，5_ 二氟代酪氨酸，從而介導3，5- 二氟代酪氨酸定點特異性插入所述選擇密碼子對應的氨基酸位置，從而產生在所選位置含有3，5- 二氟代酪氨酸的突變蛋白質。
[0037]本領域技術人員應該理解，適當的重組載體的構建和宿主細胞的篩選可以通過常規分子克隆技術和篩選技術實現。
[0038]本領域技術人員應該理解，在步驟(b)中，將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標蛋白質的核酸序列克隆并轉化到適當的宿主細胞中可以通過多種方式進行，例如，將所述正交tRNA序列、編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標蛋白質的核酸序列分別可操作性地連接到適當的載體中，再以任意次序或三者共同轉化到適當的宿主細胞中；或者，也可以將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地連接到一個適當的載體中(兩種序列之間有或無適當的接頭連接)，將編碼所述目標蛋白質的核酸序列可操作性地連接到另一種不同的適當的載體中，然后將構建好的兩種重組載體共同轉化到適當的宿主細胞中；或者，也可以將所述正交tRNA序列和編碼所述目標蛋白質的核酸序列可操作性地連接到一個適當的載體中(兩種序列之間有或無適當的接頭連接)，將編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地連接到另一種不同的適當的載體中，然后將構建好的兩種重組載體共同轉化到適當的宿主細胞中。或者，也可以將正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼目標蛋白質的核酸序列以任意適當的順序可操作性地連接在一起，然后克隆到一個載體上，最后轉化到適當的宿主細胞中。上述克隆方案都是可行的，本領域技術人員可以根據實驗的需要容易地進行適當的選擇。
[0039]另外，本領域技術人員還應該理解，為了避免宿主細胞對外源重組載體的“踢除”效應，往往選擇用帶有不同抗生素標記的載體來構建需要共同轉化到同一宿主細胞中的核酸序列片段。對于適當的載體的選擇、重組載體的構建、宿主細胞的轉化或轉染等等，都是本領域的常規技術，例如，可以參見美國冷泉港實驗室出版的分子克隆手冊。
[0040]在所述方法的一些實施方式中，提供翻譯系統的步驟包括通過定點誘變使野生型氨酰基-tRNA合成酶的氨 基酸結合口袋發生突變，選擇用所述非天然氨基酸(即3，5- 二氟代酪氨酸)優先氨酰化所述Ο-tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突變體(即，本發明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述選擇步驟包括定點誘變后從得到的氨酰基-tRNA合成酶分子庫進行所述O-RS的正選擇和負選擇(參見下述實施例2)。在一些實施方式中，提供翻譯系統的步驟還包括提供Ο-tRNA的序列，Ο-tRNA為古菌來源的反密碼子突變為與琥珀密碼互補的酪氨酸tRNA，例如，所述Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。在這些方法中，提供翻譯系統的步驟還包括提供含有所述翻譯系統所用的琥珀選擇密碼子的編碼目標蛋白質的核酸。
[0041]還可在宿主細胞內實施產生含有3，5_ 二氟代酪氨酸的突變蛋白質的方法。在這些情況中，提供的宿主細胞包含本發明的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(即，包含編碼本發明的O-RS的核苷酸序列、Ο-tRNA序列和含有至少一個選擇密碼子的編碼目標蛋白質的核酸)，而在適宜的培養條件下(例如，在培養基中添加3，5-二氟代酪氨酸等)培養該宿主細胞可導致在所述目標蛋白質中定點特異性插入3，5_ 二氟代酪氨酸。在一些實施方式中，提供步驟包括提供真細菌宿主細胞(例如，大腸桿菌)。
[0042]本發明還提供生產含有3，5- 二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突變體的方法，其利用上述產生在至少一個所選位置定點特異性插入3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質的方法，其中所用的編碼原核蛋白酪氨酸激酶突變體的核酸序列在選定的位置包含所述正交tRNA特異性識別的選擇密碼子，在酪氨酸激酶的翻譯期間，3，5-二氟代酪氨酸定點插入到所述選擇密碼子對應的氨基酸位置，從而產生在選定位置含有3，5- 二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突變體。
[0043]優選地，本發明還提供生產含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體的方法，所述方法利用上述3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統進行，所述方法通常包括下述步驟:
[0044](a)提供含有以下組分的3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統的步驟:
[0045]⑴3，5- 二氟代酪氨酸；
[0046](ii)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；
[0047](iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3, 5- 二氟代酪氨酸優先氨酰化所述Ο-tRNA ;和
[0048](iv)編碼所述原核蛋白酪氨酸激酶的核酸，例如，但不限于，SEQ ID N0:7，其中所述核酸含有所述Ο-tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；
[0049](b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標蛋白質的核酸序列克隆并轉化到適當的宿主細胞中，在培養基中加入3，5-二氟代酪氨酸，在所述目標蛋白質(即原核蛋白酪氨酸激酶)的翻譯過程中，3，5_ 二氟代酪氨酸氨酰化的正交RNA識別編碼酪氨酸激酶的mRNA上的選擇密碼子以及3，5- 二氟代酪氨酸，從而介導3，5- 二氟代酪氨酸定點插入所述目標蛋白質的特定位置(即，所述選擇密碼子對應的氨基酸 位置)。
[0050]本發明還提供利用本發明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統產生的作為氟代指示劑的含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，在野生型原核蛋白酪氨酸激酶的574位引入3，5_ 二氟代酪氨酸，所述酪氨酸激酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:8。所述激酶突變體與野生型酪氨酸激酶一樣在適宜條件下可以進行活性中心酪氨酸的自磷酸化，從而激活自身的蛋白激酶活性。
[0051]本發明還提供一種新穎的鑒定目標蛋白的酪氨酸磷酸化位點的方法，所述方法包括利用本發明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統將所述目標蛋白中推定進行磷酸化的酪氨酸取代為3，5- 二氟代酪氨酸，由此得到含有3，5- 二氟代酪氨酸的目標蛋白突變體，利用該目標蛋白突變體作為氟代指示劑，通過19F-NMR技術來檢測3，5- 二氟代酪氨酸的磷酸化，從而鑒定所述酪氨酸位點是否是酪氨酸磷酸化位點。
[0052]例如，已知原核蛋白酪氨酸激酶具有較低程度的自身磷酸化能力，目前尚沒有合適的技術能夠檢測并且量化其自身磷酸化水平。但是，利用本發明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統將原核蛋白酪氨酸激酶活性中心574位酪氨酸殘基替換為3，5-二氟代酪氨酸，得到含有3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，再通過19F-NMR技術來檢測并且量化該原核蛋白酪氨酸激酶突變體的自身酪氨酸磷酸化水平。該原核蛋白酪氨酸激酶突變體的酪氨酸磷酸化水平在一定程度上可以代表野生型原核蛋白酪氨酸激酶的自身磷酸化水平。此外，這個檢測結果也證明原核蛋白酪氨酸激酶活性中心574位酪氨酸是其自身酪氨酸磷酸化位點。
[0053]因此，本發明提供下述:
[0054]1.一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
[0055]2.一種3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統，所述系統包含:
[0056](i) 3，5-二氟代酪氨酸；
[0057](ii)第I項所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0058](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0059](iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。
[0060]3.如第2項所述的翻譯系統，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述選擇密碼子是琥珀密碼子，并且所述翻譯系統還包含編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0061]4.一種宿主細胞，其包含編碼第I項所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相對應的正交tRNA序列。
[0062]5.如第4項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真細菌細胞，優選大腸桿菌細胞。
[0063]6.一種產生在至少一個所選位置定點特異性插入3，5- 二氟代酪氨酸的突變蛋白質的方法，所述方法包括下述步驟:
[0064](a)提供第2項所述的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統，該系統包含:
[0065](i) 3，5- 二氟代酪氨酸；
[0066](ii)第I項所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0067](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0068](iv)編碼所述目標蛋白質的核酸，其中所述核酸在所選的位置包含所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子；和
[0069](b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標蛋白質的核酸序列克隆并轉化到適當的宿主細胞中，在培養基中加入3，5- 二氟代酪氨酸，在所述目標蛋白質的翻譯期間，3，5- 二氟代酪氨酸氨酰化的正交tRNA識別編碼所述目標蛋白質的mRNA上的選擇密碼子以及3，5- 二氟代酪氨酸，從而介導3，5- 二氟代酪氨酸定點特異性插入所述選擇密碼子對應的氨基酸位置，從而產生在所選位置含3，5- 二氟代酪氨酸的所述目標蛋白質。
[0070]7.如第6項所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。
[0071]8.生產含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體的方法，其利用第6項所述的方法，其中所用的編碼原核蛋白酪氨酸激酶突變體的核酸序列在選定的位置包含所述正交tRNA特異性識別的選擇密碼子，在激酶的翻譯期間，3，5- 二氟代酪氨酸定點插入到所述選擇密碼子對應的氨基酸位置，從而產生在選定位置含有3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體。
[0072]9.由第8項所述的方法獲得的含有3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:8。
[0073]10.一種鑒定目標蛋白的酪氨酸磷酸化位點的方法，所述方法包括利用第6項的方法將所述目標蛋白中推定進行磷酸化的酪氨酸取代為3，5-二氟代酪氨酸，由此得到含有3，5-二氟代酪氨酸的目標蛋白突變體，利用該目標蛋白突變體作為氟代指示劑，通過19F-NMR技術來檢測3，5- 二氟代酪氨酸的磷酸化，從而鑒定所述酪氨酸位點是否是酪氨酸磷酸化位點。
[0074]11.編碼第I項的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0075]13.如第11項所述的核苷酸序列，其為SEQ ID NO:3。
[0076]3、有益效果
[0077]本研究通過篩選得到了一種正交氨酰基-tRNA合成酶，并且，在此基礎上研發了3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統。通過該系統可以在目標蛋白一例如，原核蛋白酪氨酸激酶Etk中定點特異性插入3，5- 二氟代酪氨酸，產生574位含有3，5- 二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突變體，將其作為氟代指示劑，從而可以通過19F-NMR技術來檢測及量化酪氨酸磷酸化水平。
[0078]我們這種探測酪氨酸磷酸化水平的新方法與傳統方法相比有許多的優勢。首先，可以直接檢測及量化目標蛋白質某一特定位點的酪氨酸磷酸化水平。其次，樣品可以隨時凍存，接著再進行19FNMR光譜分析，這樣，可以最大限度地縮短樣品的制備時間，以便更精確地定量蛋白質樣品的磷酸化水平。第三，由于19F的高靈敏度，相對于環境的化學位移各向異性以及19F-19F直接耦合的缺乏，單位點整合19F結合NMR分析可以更有效地用來闡明蛋白的動態特性。最后，NM R研究可能有助于揭示真核和原核蛋白酪氨酸激酶活性狀態和非活性狀態的運動特性，以及這些狀態之間的動態交換。這些獨特的優勢使我們能夠獲得直接證據來證明并且量化原核蛋白酪氨酸激酶Etk活性中心磷酸化水平，而這在以前是無法實現的。并且，這種監測酪氨酸激酶激活及活性的方法靈敏度高，選擇性強，可以為酪氨酸激酶/底物蛋白相互作用的新型抑制劑篩選提供有效的途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0079]從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特征和優點將更明顯，其中:
[0080]圖1是本發明的正交3，5- 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)的晶體結構圖；
[0081 ] 圖2:圖2A是體外氨酰化作用的酸性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，圖2B是F2Y-綠色熒光蛋白的SDS-PAGE電泳圖，圖2C和圖2D是F2Y-綠色熒光蛋白的質譜圖；
[0082]圖3是3，5- 二氟代酪氨酸(F2Y)(下圖)和o_磷酸_3，5_ 二氟代酪氨酸(pF2Y)(上圖)的19F-NMR譜圖；
[0083]圖4:圖4A是野生型原核蛋白酪氨酸激酶(Etk，泳道I)和Etk_574_F2Y (泳道2)的SDS-PAGE電泳圖，圖4B是Etk_574_F2Y和酪氨酸磷酸酶PTPlB的Western檢測圖(上圖是PTyr抗體，下圖是His抗體)，圖4C是Etk_574_F2Y磷酸化的19F-NMR譜圖，圖4D是Etk-574-F2Y脫磷酸化的19F-NMR譜圖；
[0084]圖5是正交tRNA、野生型酪氨酰tRNA合成酶、本發明的正交氨酰基-tRNA合成酶、綠色熒光蛋白突變體、原核蛋白酪氨酸激酶突變體和蛋白酪氨酸磷酸酶的序列。【具體實施方式】
[0085]以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發明的范圍和精神。
[0086]本領域技術人員應該理解，除非特別說明，下述實施例中所用的化學試劑均為可通過商業途徑購得的分析純級別的試劑。
[0087]實施例1:0_磷酸-3，5- 二氟代酪氨酸(pF2Y)的化學合成
[0088]取IOOmM三氯氧磷、100mM3，5-二氟代酪氨酸(購自上海吉爾生化公司)和500mM氫氧化鈉，溶解至5mL，然后室溫攪拌lh。收集水相，通過HPLC分離純化得到白色粉末，產率10%。(YMC AA12S052503WT column, 12ml/min flow rate, froml0% to90% CH3CN,0.1%TFA (w/v) in water, over the course of 30 min).MS:m/z:298 [M+H] + ； IH-NMR (600MHz,D20):7.03 (d, 2H) 4.01 (dd, 1H) 3.21 (m, 2H)。
[0089]以上合成反應所需化學試劑如無特別說明，均購自北京化工廠，均為分析純以上級別。
[0090]實施例2:進化F2Y特異性氨酰基-tRNA合成酶
[0091]為了在基因中位點特異性插入F2Y，需要在所用的E.coli宿主細胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交對，這個正交對來源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)琥拍抑制酪氨酰 tRNA (MjtRNAaj/) / 酪氨酰 tRNA 合成酶(MjYRS，野生型，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2)對。MjYRS突變庫構建在卡納霉素抗性pBK質粒(購自美國scr ipps研究所Peter G.Schultz實驗室)中，位于該質粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的啟動子和終止子之間。所使用的合成酶突變庫為pBk-lib-jwl庫，該突變庫的構建方法為:在MjYRS基因上挑選6個位點(Y32，Leu65，Phel08, Glnl09，Aspl58，和 Leul62)引入 NNK 突變(N = A+T+C+G ;K = T+G)，另外 6 個位點(Ile63, Ala67,His70, Y114，Ilel59，Val 164)或隨機突變為 Gly 或保持不變(參見 Xie，J.；Liu, ff.S.；Schultz, P.G.Angew.Chem.，Int.Ed.2007，46，9239-9242 ；Wang, JY.；Zhang W.；Song WJ ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010，132，14812-14818)。
[0092]通過正負篩選來進化特異性識別F2Y的氨酰基-tRNA合成酶。正篩選質粒包含MjtRNAcu/, TAG突變的氯霉素乙酰轉移酶基因，啟動表達綠色熒光蛋白的琥珀突變的T7RNA聚合酶，四環素抗性基因。負篩選質粒包含MjtRNAa/，在阿拉伯糖操縱子下的琥珀突變芽孢桿菌RNA酶基因，以及氨芐青霉素抗性基因。進行3輪正負篩選:包含有正篩選質粒的E.coli DH10B細胞作為正篩選寄主細胞。細胞電轉pbk-lib-jwl庫，SOC培養基(2%(W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母粉，0.05% (W/V)NaCl,2.5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM 葡萄糖)在37°C培養I小時。之后換用極限培養基(GMML極限培養基的配方:M9鹽/甘油:764gNa2HP04.7H20或者 30g Na2HPO4,15g KH2PO4, 2.5g NaCl，5g NH4Cl, 50ml 甘油，高壓滅菌，pH7.0 ；1M MgSO4:高壓滅菌；50mM CaCl2:高壓滅菌；25mM FeCl2:過濾滅菌;0.3Μ亮氨酸:溶解于0.3Μ NaOH中，過濾滅菌；1L液體GMML培養基:200ml M9鹽/甘油，2ml MgSO4, 2mlCaCl2, 2ml FeCl2, Iml亮氨酸)洗兩次，鋪板固體極限培養基(在液體GMML培養基中加入500ml3%瓊脂粉，ImM F2Y，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四環素)，37°C培養60小時。收取細胞，提取質粒DNA，電泳分離，膠回收。然后，將經過正篩選的pBK-lib-jwl轉化到包含負篩選質粒的DHlOB感受態細胞中。SOC培養基中恢復I小時。之后涂板包含
0.2%阿拉伯糖(購自sigma公司)的LB固體培養基(每升培養基含IOg胰蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl)。37°C培養8-12小時。共重復3輪。
[0093]最后一輪正篩選挑384個克隆，分別點板在含有ImM F2Y、氯霉素60，80，120，160 μ g/mL的GMML固體培養基上，及不包含F2Y、但包含氯霉素0，20，40，60 μ g/mL的GMML固體培養基。挑選在在ImM F2Y160 μ g/mL氯霉素的培養基上生長，而在OmM F2Y，濃度大于20 μ g/mL氯霉素培養基中不生長的克隆進行進一步驗證。最終挑出I個克隆，插入3，5- 二氟代酪氨酸效率最高，測序表明，克隆所包含的氨酰基-tRNA合成酶突變體(F2YRS)的氨基酸序列為 SEQ ID NO:4 所示，其中突變位點為 Tyr32Arg，Leu65Tyr, His70Gly, Phel08Asn,Glnl09Cys, Aspl58Asn 和 Leul62Ser。
[0094]本領域技術人員應該理解，在本發明中，除了 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之外，術語“正交氨酰基-tRNA合成酶”或“正交3，5- 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”還包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的保守性變體，只要所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且還包括將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0095]同時，本發明人還解析了 F2YRS的晶體結構(圖1)，為F2YRS特異性整合F2Y提供了結構基礎。
[0096]實施例3:體外氨基酰化作用分析
[0097]為了驗證F2YRS在目標蛋白中整合F2Y的高效性和保真度，我們進行了體外氨基酰化作用分析。取50mM氯化鈉，20mM氯化鎂，4mM 二硫蘇糖醇，2mM ATP, 10 μ M Tyr tRNA,3μΜ F2YRS和2mM酪氨酸或者F2Y，溶解于20mM，pH8.0的Tris緩沖液中，37°C孵育lh。反應液進行24h酸性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結果如圖2A所示，F2YRS只能整合F2Y，而無法整合酪氨酸。
[0098]實施例4:表達F2Y-綠色熒光蛋白及質譜鑒定
[0099]將正交tRNA (SEQ ID NO:1)和篩選出來的編碼F2YRS的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)構建到pEVOL載體(購自美國scripps研究所Peter G.Schultz實驗室)上，編碼綠色熒光蛋白的核苷酸序列(151TAG) (SEQ ID NO:5)構建到pET載體(購自美國scripps研究所Peter G.Schultz實驗室)上，然后共轉化到DHlOB細胞(購自全式金公司)中。挑取單個克隆在37°C培養到0D_約等于1.2時，向LB培養基中加入ImM IPTG，0.02%阿拉伯糖(購自sigma公司)及0.5mM F2Y培養細胞，對照不加入F2Y。8小時之后，收菌，N1-NTA純化蛋白，并用SDS-PAGE電泳分析(圖2B)。
[0100]我們發現，只有在存在F2Y的培養基中才能純化出全長的綠色熒光蛋白，這說明篩選出來的F2YRS可以特異性的識別F2Y。在LB培養基中F2Y-綠色熒光蛋白的產率為60mg/L，而野生型綠色熒光蛋白的產率為100mg/L。為了檢測F2Y僅僅插入到綠色熒光蛋白的151位琥珀突變位點，我們對151-F2Y-綠色蛋白進行了 ES1-TOF質譜檢測，檢測結果分子量為27746Da(圖2C，D)，與計算的分子量27746Da吻合。
[0101]實施例5:表達F2Y-原核蛋白酪氨酸激酶突變體及酪氨酸磷酸化檢測
[0102] 我們選取原核蛋白酪氨酸激酶Etk的C末端胞漿區片段(451位-726位，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，用基因工程方法構建了 Etk突變體，其中574位突變為TAG終止密碼子，然后用實施例4中的相同方法在Etk突變體的574位定點特異性插入F2Y，表達產生突變蛋白Etk-574-F2Y(氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)，產率為12.5mg/L，而野生型Etk的產率為20mg/L(圖4A)。
[0103]為了驗證Etk活性中心的574位酪氨酸能否進行自磷酸化，我們取突變蛋白Etk-574-F2Y，于 ρΗ8.5 的緩沖液(含有:20mM Tris, 20mM NaCl,2mM ATP 和 5mM MgC12)中25°C孵育30min。作為對照，我們往突變蛋白Etk_574_F2Y中加入0.125mg/mL蛋白酪氨酸磷酸酶PTPlB (通過常規分子生物學方法克隆表達而得到，或者也可以商購獲得，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)進行脫磷酸化，然后于ρΗ8.5的緩沖液(含有:20mMTris，20mMNaCl和ImM EDTA)中25°C孵育30min。孵育結束后，分別取少量混合液進行Western驗證，剩余樣品立刻凍干后進行19F-NMR分析。同時，我們取F2Y和實施例1中新合成的pF2Y進行19F-NMR分析，作為驗證F2Y是否磷酸化的對照。結果如圖3和圖4C，D所示，F2Y的19F化學位移為-133.lppm，而pF2Y為-126.7ppm(圖3)。圖4C和D顯示，僅含有Etk_574_F2Y的混合液分別在-122.3ppm和-134.5ppm處都出現了信號峰，而加入PTPlB的混合液，僅在-134.5ppm處出現信號峰，說明Etk_574_F2Y的574位二氟代酪氨酸在緩沖液中發生了自磷酸化，這一結論與western的檢測結果完全一致(圖4B)。同時，通過信號強度對比分析發現，僅有3.8%的二氟代酪氨酸發生了磷酸化，這與先前報道中所稱的原核蛋白酪氨酸激酶活性中心的磷酸化水平很低也是一致的。
[0104]應該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經對本發明進行具體地顯示和描述，但是本領域的普通技術人員應該理解，在不背離由權利要求書所定義的本發明的精神和范圍的條件下，可以在其中 進行各種形式和細節的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。
【權利要求】
1.一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQID NO:4所示氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
2.—種3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統，所述系統包含: (i)3，5-二氟代酪氨酸； (?)權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。
3.如權利要求2所述的翻譯系統，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述選擇密碼子是琥珀密碼子，并且所述翻譯系統還包含編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
4.一種宿主細胞,其包含編碼權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相對應的正交tRNA序列。
5.如權利要求4所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真細菌細胞，優選大腸桿菌細 胞。
6.一種產生在至少一個所選位置定點特異性插入3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質的方法，所述方法包括下述步驟: (a)提供權利要求2所述的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統，該系統包含: (i)3，5-二氟代酪氨酸； (?)權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv)編碼所述目標蛋白質的核酸，其中所述核酸在所選的位置包含所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子；和 (b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標蛋白質的核酸序列克隆并轉化到適當的宿主細胞中，在培養基中加入3，5_ 二氟代酪氨酸，在所述目標蛋白質的翻譯期間，3，5- 二氟代酪氨酸氨酰化的正交tRNA識別編碼所述目標蛋白質的mRNA上的選擇密碼子以及3，5- 二氟代酪氨酸，從而介導3，5- 二氟代酪氨酸定點特異性插入所述選擇密碼子對應的氨基酸位置，產生在所選位置含3，5- 二氟代酪氨酸的所述目標蛋白質。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。
8.生產含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體的方法，其利用權利要求6所述的方法，其中所用的編碼原核蛋白酪氨酸激酶突變體的核酸序列在選定的位置包含所述正交tRNA特異性識別的選擇密碼子，在激酶的翻譯期間，3，5- 二氟代酪氨酸定點插入到所述選擇密碼子對應的氨基酸位置，從而產生在選定位置含有3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體。
9.由權利要求8所述的方法獲得的含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:8。
10.一種鑒定目標蛋白的酪氨酸磷酸化位點的方法，所述方法包括利用權利要求6的方法將所述目標蛋白中推定進行磷酸化的酪氨酸取代為3，5_ 二氟代酪氨酸，由此得到含有3，5-二氟代酪氨酸的目標蛋白突變體，利用該目標蛋白突變體作為氟代指示劑，通過19F-NMR技術來檢測3，5- 二氟 代酪氨酸的磷酸化，從而鑒定所述酪氨酸位點是否是酪氨酸磷酸化位點。
【文檔編號】C12N9/12GK104004723SQ201310056306
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月22日 優先權日:2013年2月22日
【發明者】王江云, 李發慧, 李家松, 龔為民, 江歡歡 申請人:中國科學院生物物理研究所