專利名稱：重組Tβ4-BP5融合肽、基因、工程菌及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種胸腺素β 4與法氏囊五肽ΒΡ5重組融合肽，同時還涉及編碼該重組融合肽的基因，表達該融合肽的工程菌及應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
胸腺是免疫系統中重要的中樞免疫器官，負責細胞的分化和成熟，胸腺素是胸腺分泌的具有生物活性的多種多肽類物質的統稱，亦稱胸腺肽。胸腺素β4 (Τβ4)是20世紀80年代從胸腺中分離得到、后來發現在許多組織中都廣泛存在的一種小肽類物質。胸腺素β4是一種重要的肌動蛋·白結合蛋白，含有43個氨基酸，分子量約5kD，等電點為5.1，其氨基酸序列如下:Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-1le-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-1le-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser胸腺素β 4作為一種小肽類物質，不但在胸腺依賴性淋巴細胞的調節與分化方面具有重要功能，可顯著增強胸腺細胞、骨髓細胞末端核苷酰轉移酶活性，抑制巨噬細胞游走活性，胸腺素β 4還可刺激下丘腦促黃體激素釋放激素以及黃體激素的分泌，誘導T細胞系分型轉變，在CD4細胞增殖抑制時激活CD8細胞。法氏囊(bursa of Fabricus,BF)是禽類獨有的中樞免疫器官,其功能類似于哺乳動物中的骨髓。法氏囊超濾物(IKD以下)中含有許多生物活性物質，特別是一些小肽對禽類具有免疫調節功能，能促進禽類、哺乳動物細胞的分化發育，促進免疫器官的成熟。其中的法氏囊活性五肽(BP5)是法氏囊中新分離出來的一種新的活性小肽，其氨基酸結構序列為:Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。研究發現，BP5可以促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖，不但具有提高機體體液免疫和細胞免疫功能，還具有平衡Thl和Th2類型免疫反應的功能。而法氏囊活性五肽的免疫平衡作用是一般免疫增強劑所不具備的。由于法氏囊五肽BP5只能從雞的法氏囊組織中提取，胸腺素β 4從胸腺組織中提取，來源受到很大的限制，而且其它雜蛋白含量高，純化難度大，其實際效果也受到很大程度的影響。而化學合成的胸腺素β 4或法氏囊活性五肽成本高，不適合田間推廣。

發明內容
本發明的目的是提供重組T β 4-ΒΡ5融合肽。為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是提供重組T β 4-ΒΡ5融合肽，該融合肽的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:5所示。本發明的目的還在于提供一種重組T β 4-ΒΡ5融合肽的基因。本發明所采用的技術方案還在于提供一種重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽的基因，該融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；該融合肽基因由胸腺素β 4基因和法氏囊五肽ΒΡ5基因通過柔性連接肽Linker基因串聯而成，并在5’端加有腸激酶識別位點基因序列。
本發明的目的還在于提供一種重組T β 4-ΒΡ5融合肽的工程菌。本發明所采用的技術方案還在于提供一種重組Τβ4_ΒΡ5融合肽的工程菌，該工程菌的構建方法包括以下步驟:I)重組T β 4-ΒΡ5融合肽基因S0E-PCR擴增根據豬大腸桿菌偏嗜密碼子設計重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽基因，并針對該融合肽基因設計引物Fp F2和F3,然后進行SOE-PCR擴增；將PCR擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶進行回收，回收產物中片段大小為159bp的為重組Τβ4-ΒΡ5融合肽基因；2)攜帶重組T β 4-ΒΡ5融合肽基因的工程菌的構建將重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽基因和質粒載體pET32a用EcoR1、XbaI雙酶切，并將酶切的重組T β 4-ΒΡ5融合肽基因和質粒載體pET32a連接，連接產物轉化E.coli DH5 α ;提取質粒，并將重組表達質粒進行HindIII缺失酶鑒定；酶切鑒定為陽性的質粒測序，命名為pET32a-T β 4-ΒΡ5 ;將重組質粒pET32a_T β 4-ΒΡ5轉化進入大腸桿菌BL21中，篩選陽性克隆，即為表達重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽的工程菌。所述引物F1:5，-CCGGAATTCACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGACTGA-3，；

F2:5’ -TCTCCTGCTCGATCGTCTCCTTCGATGGTAGTGGATTCTTCTCTTGAGTCTCAGTCTTCTTG-3，；F3:5’ -TCGAGCAGGAGAAGCAAGCTGGCGAGTCCGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAATCTAGATCG-3，。本發明的目的還在于提供一種重組T β 4-ΒΡ5融合肽的制備方法。本發明所采用的技術方案還在于提供一種重組Τβ4_ΒΡ5融合肽的制備方法，包括以下步驟:I)將攜帶重組T β 4-ΒΡ5融合肽基因的工程菌接種到LB液體培養基培養，當菌體濃度OD6qq=0.4-0.6時，加入IPTG進行誘導表達4 6h，IPTG終濃度為ImM ；2)將誘導表達的菌液12000rmp離心IOmin,收集沉淀,用洗漆液重懸沉淀,并超聲波裂解IOmin ;然后12000rmp離心lOmin，收集上清液；3 )將上清液用Ni柱親和層析進行純化，得到N端連有硫氧還蛋白的重組T β 4-ΒΡ5融合肽的純化產物；4)將步驟3)的純化產物通過N端帶有His標簽的腸激酶切去除硫氧還蛋白后，再進行Ni柱親和層析，收集穿透峰，并用PBS進行透析，得到重組T β 4-ΒΡ5融合肽。本發明的目的還在于提供一種重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽在作為免疫佐劑方面的應用。本發明所采用的技術方案還在于提供一種重組T β 4-ΒΡ5融合肽在作為免疫佐劑方面的應用。本發明將重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽基因插入表達載體，轉化大腸桿菌，獲得高效表達重組T β 4-ΒΡ5融合肽的基因工程菌，通過液體培養、純化制得的重組T β 4-ΒΡ5融合肽，該融合肽經N端帶有His標簽的腸激酶去除硫氧還蛋白，再經親和層析純化，可獲得單一的重組T β 4-ΒΡ5融合肽。將重組T β 4-ΒΡ5融合肽與單獨胸腺素β 4或法氏囊五肽ΒΡ5進行免疫活性比較，結果顯示，重組的重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽在體外淋巴細胞增殖試驗中表現出比單獨的胸腺素β 4和法氏囊五肽ΒΡ5更高的刺激淋巴細胞增殖的活性。本發明的重組T β 4-ΒΡ5融合肽可作為配合疫苗使用的新型多肽免疫佐劑，與疫苗配合單一胸腺素β 4或疫苗配合單一法氏囊五肽ΒΡ5相比，具有更好的免疫佐劑效果，能夠有效增強機體細胞免疫和體液免疫水平，具有廣闊的應用前景。本發明的重組T β4_ΒΡ5融合肽還可以與抗病毒、抗感染及抗腫瘤的藥物進行混合，從而達到防治相應疾病的目的。本發明的重組Τβ4-ΒΡ5融合肽與疫苗進行混合，可以制成疫苗復合物，提高疫苗的免疫作用。


圖1為重組T β 4-ΒΡ5融合肽的表達設計圖；圖2為重組表達質 粒pET32a_T β 4-ΒΡ5的缺失酶鑒定圖；圖中，I:DL2000DNA Marker ；2 =HindIII 酶切重組質粒 pET32a_T β 4-BP5 ；3:重組質粒 pET32a-T β 4-ΒΡ5圖3為重組T β 4-ΒΡ5融合肽表達載體的構建示意圖；圖4為重組T β 4-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌中的SDS-PAGE電泳圖；圖中，1:低分子量蛋白質Marker ；2:0.25mmol/L IPTG誘導的重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET32a-T β 4-BP5 ；3:0.5mmol/L IPTG 誘導的重組大腸桿菌 BL21(DE3) /pET32a-T β 4-BP5 ；4:0.75mmol/L IPTG 誘導的重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET32a-T β 4-BP5 ；5:lmmol/L IPTG 誘導的重組大腸桿菌 BL21(DE3)/pET32a_T β 4-BP5 ；6:
1.25mmol/L IPTG 誘導的重組大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET32a-T β 4-BP5 ；7:1.5mmol/L IPTG誘導的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T β 4-ΒΡ5圖5為重組T β 4-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌BL21中的表達的SDS-PAGE分析圖；圖中，1:低分子量蛋白質Marker ;2:誘導的大腸桿菌BL21(DE3)的超聲波裂解上清；3:誘導大腸桿菌BL21 (DE3)的超聲波裂解沉淀；4:誘導的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T β 4-ΒΡ5的超聲波裂解上清；5:誘導的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T β 4-ΒΡ5的超聲波裂解沉淀圖6為豬PRRSV GP5抗體的檢測結果；圖7為豬PRRSV抗體亞型IgGl的檢測結果；圖8為豬PRRSV抗體亞型IgG2a的檢測結果；圖9為小鼠脾臟淋巴細胞增殖分析結果；圖10為小鼠血清中細胞因子IFN- Y含量測定；圖11為小鼠血清中細胞因子IL-4含量測定。
具體實施例方式實施例11、設計引物
根據豬大腸桿菌偏嗜密碼子設計重組T β 4-ΒΡ5融合肽基因，如下:5’ -ACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGACTGAGACTCAAGAGAAGAATCCACTACCATCGAAGGAGACGATCGAGCAGGAGAAGCAAGCTGGCGAGTCCGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTAT-3’(SEQ ID NO:1)并針對該融合肽基因設計引物FpF2和F3，其中在引物F1中加上EcoRI酶切位點，引物F3中加上終止密碼子和XbaI酶切位點。重組T β 4-ΒΡ5融合肽的表達設計圖見圖1，引物由上海Invitrongen公司合成，如下:F1:5’ -CCGG AATTCACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGACTGA-3’ (SEQ ID NO:2)，其中下劃線部分為EcoRI酶切位點;F2:5’ -TCTCCTGCTCGATCGTCTCCTTCGATGGTAGTGGATTCTTCTCTTGAGTCTCAGTCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO:3)；F3:5’ -TCGAGCAGGAGAAGCAAGCTGGCGAGTCCGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAATCTAGATCG-3，(SEQ ID NO:4)，其中下劃線部分為XbaI酶切位點。2、SOE-PCR 擴增PCR 反應體系:10 X PCR Buffer5 μ L, MgC123 μ L, IOmmoI/L 的 dNTPl μ L，終濃度為20pmol/L的引物FpF2和F3各2 μ L，TaKaRa ExTaq0.5 μ L,滅菌超純水34.5 μ L,反應總體積 50 μ L0PCR反應程序:94°C預變性2min，進入PCR循環:94°C變性30s，55 °C退火lmin，72°C延伸6min，其中變性和退火共30個循環。將PCR產物經含有溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB) 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶，隨后按膠回收試劑盒(大連TaKaRa公司)使用說明進行回收，并對回收產物進行電泳鑒定，片段大小為159bp的即為重組Τβ4-ΒΡ5融合肽基因，對基因序列測定后，推導其編碼的重組T β 4-ΒΡ5融合肽為53個氨基酸。實施例2將實施例1的重組T β 4-ΒΡ5融合肽基因和質粒載體pET32a用EcoR1、XbaI雙酶切，并置于37°C水浴2h，將酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收試劑盒進行回收鑒定。經過酶切的重組Τβ4-ΒΡ5融合肽基因和質粒載體pET32a按摩爾比1:3的比例在4°C過夜連接。取連接產物加入含有100 μ L感受態DH5a的聚丙烯離心管中，輕輕混勻后冰浴30min。將聚丙烯離心管從冰中取出后42°C熱休克90s，然后立即冰浴2min。取出加入37°C預熱的LB培養基800 μ L中，于37°C振搖(120rpm) 45min。取100 μ L菌液均勻涂布在含氨芐青霉素(Amp) 50 μ g/mL的瓊脂LB平板上，37°C放置20min后，倒置培養18h。按《分子克隆實驗指南》上的堿裂解法提取質粒。對提取的質粒用HindIII對質粒進行缺失酶鑒定，即將酶切產物進行DNA電泳鑒定，DNA電泳結果顯示質粒沒有被HindIII切出相應條帶，表明重組質粒已經缺失HindIII酶切位點，如圖2所示。并將重組陽性質粒命名為pET32a-T β 4-ΒΡ5，如圖3所示。將重組質粒pET32a_T β 4-ΒΡ5送上海Invitrongen公司測序。實施例3取實施例2得到的陽性的重組原核表達載體pET32a_T β 4-ΒΡ5接到含有200 μ L感受態細胞BL21的聚丙烯離心管中，輕輕混勻后冰浴30min。取出放置在42°C水浴中，熱休克90s，然后立即冰浴2min。加入37°C預熱的LB培養基800 μ L，于37°C振搖45min。取100 μ L菌液均勻涂布在瓊脂LB平板(I μ g/mL氨芐青霉素)上，在37°C正置20min后，倒置培養18h。從瓊脂LB平板(I μ g/mL氨芐青霉素)上挑取單個菌落，接種到3mL LB培養基(I μ g/mL氨芐青霉素)中，37°C振蕩培養過夜，次日轉入5mL LB培養基(I μ g/mL氨芐青霉素)中37°C振蕩培養3h，取菌液3mL，參照質粒快速提取試劑盒說明書提取質粒。篩選陽性克隆，即為表達Τβ 4-BP5融合肽的工程菌，命名為BL21 (DE3) /pET32a_T β 4-ΒΡ5。實施例41、將表達重組T β 4-ΒΡ5融合肽的工程菌接種到3mL LB液體培養基(50 μ g/mL氨芐青霉素)中，于37°C振搖培養過夜；第二天從中取出菌液加到3mL LB液體培養基中，使菌體濃度達到OD6tltl 0.1后，37°C振搖培養，當菌體濃度OD6tltl 0.4-0.6時，加入IPTG進行誘導表達4h，IPTG的終濃度為ImM ;每隔I小時收集100 μ L菌液，對重組T β 4-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌中不同IPTG終濃度的表達量進行SDS-PAGE分析，如圖4所示。將菌液4000rpm離心lOmin，收集菌體，將收集的菌體用100 μ L PBS重懸后，加等體積的2X SDS凝膠加樣緩沖液(100mmol/L Tris.Cl (ρΗ6.8)、200mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)、4%SDS(電泳級)、0.2%溴酚藍及20%甘油)，100°C煮沸5min以使蛋白質變形，然后取10 μ L進行SDS-PAGE凝膠電泳，SDS-PAGE電泳凝膠的配制及電泳條件參照分子克隆手冊，具體步驟如下:I)分離膠(15%)的配制:水 3.4mL ;30% 丙烯酰胺溶液 4.0mL ；1.5M Tris.HCl(pH8.8) 2.5mL ；10%SDS0.1OmL ；10% 過硫酸銨 0.05mL ；TEMED0.0lmL0按以上順序加樣后快速灌膠，小心地在液面上覆蓋一層去離子水。在室溫下放置IOmin待膠凝固后棄取水,用吸水紙吸干。2)濃縮膠(5%)的配制:水 5.7mL ;30% 丙烯酰胺溶液 1.7mL ；1.5M Tris.HCl(ρΗ6.8) 2.5mL ；10%SDS 0.1mL ；10% 過硫酸銨 0.05mL ；TEMED0.0lmL0將濃縮膠液體混勻后覆蓋在分離膠之上，隨后插入梳子，于室溫下放置IOmin待膠凝固后，拔去梳子，向電泳槽內倒入Tris-甘氨酸電泳緩沖液(25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(電泳級)(pH8.3)、0.1%SDS)，加樣結束后接通電源。電源負極端接上槽，正極端接下槽。在濃縮膠中電壓為80V，進入分離膠中電壓調整為120V。直到樣品到達分離膠底部后關閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍染色lh，隨后在脫色搖床上脫色l_2h，觀察SDS-PAGE電泳蛋白染色結果。2、將誘導表達的菌液12000rmp離心lOmin，收集菌體，用洗滌液(5mM咪唑，0.5MNaCl, 20mM Tris-HCl，pH7.9)重懸菌體，后經超聲波裂解lOmin，12000rmp離心lOmin，收獲包涵體沉淀和上清液。SDS-PAGE電泳鑒定表達產物主要以可溶性表達，如圖5所示。將此上清液用Ni柱親和層析進行純化，具體操作過程如下:將樹脂搖勻后，向柱子里加入5.0mL樹脂懸液，置于室溫下使其自然沉降，確保柱床體積為2.5mL,隨后分別加入3倍體積的純水、5倍體積IXCharge buffer、3倍體積I XBindingbuffer。當IXBinding buffer流到柱床底部時，向柱子里加入上清液，控制流速，以每小時25mL的流量過柱，確保蛋白能充分地結合到柱子上。接著加入25mLl XBingding buffer 進行洗漆，隨后用 15mLl XWash buffer 洗漆，最終用 15mL 的I XElute buffer洗脫蛋白，即得到重組T β 4-ΒΡ5融合肽的純化產物，分子量約26KDa。該融合蛋白在重組T β 4-ΒΡ5融合肽N端連有硫氧還蛋白。3、將重組T β 4-ΒΡ5融合肽的純化產物通過N端帶有His標簽的腸激酶切去除硫氧還蛋白，可獲得保持天然N端的重組T β 4-ΒΡ5融合肽。再次進行Ni柱親和層析，收集穿透峰，將純化的蛋白用PBS進行透析，得到純度極高的重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽。將得到的重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽在蛋白核酸測定儀(型號GeneQuant pro RNA/DNA Calculator)定量后冷凍干燥。實驗例、重組Τβ 4-BP5融合肽作為豬繁殖與呼吸綜合癥疫苗的免疫佐劑的效果分析將本發明的重組Τβ4_ΒΡ5融合肽配合豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)疫苗聯合免疫，分析其免疫增強效果。豬繁殖與呼吸綜合癥滅活疫苗(NVDC-JXAI株)購自杭州薦里獸用生物制品有限公司。將6周齡雌性BALB/c小鼠分為5組，分別為滅活疫苗組、滅活疫苗+單獨法氏囊五肽BP5組、滅活疫苗+單獨胸腺素β 4組、滅活疫苗+重組T β 4-ΒΡ5融合肽組及PBS對照組，每組10只，重組T β 4-ΒΡ5融合肽、單獨胸腺素β 4和單獨法氏囊活性肽ΒΡ5使用劑量均為IOyg/鼠。采用腹膜內注射，間隔兩周免疫一次，共免疫三次，最后一次免疫一周后尾靜脈采血。分別測定不同組中豬PRRS病毒抗體亞型、血清中IL-4和IFN- y的含量，并同時分離小鼠脾臟淋巴細胞檢測脾淋巴細胞增殖，結果如下:(I)通過間接ELISA試驗檢測各組小鼠血清的豬PRRSV GP5抗體的OD值，結果顯示，豬PRRS商用疫苗組和豬PRRS疫苗+T β 4-ΒΡ5試驗組小鼠在首免后7d、14d、21d均有明顯的豬PRRSV GP5抗體產生，隨著免疫天數的增加，在首免后28d、35d，豬PRRS疫苗+T β 4-ΒΡ5試驗組的抗體滴度與豬PRRS疫苗+胸腺素β 4組和豬PRRS疫苗+法氏囊五肽ΒΡ5組相比差異顯著(ρ〈0.05)，如圖6所示。而豬PRRSV抗體亞型IgGl和IgG2a水平，在一次、二次加強免疫后7d，豬PRRS疫苗+T β 4-ΒΡ5試驗組豬PRRSV IgG2a抗體的滴度顯著地高于豬PRRS疫苗+胸腺素β 4組和豬PRRS疫苗+法氏囊五肽ΒΡ5組(ρ〈0.05)。重組T β 4-ΒΡ5融合肽在二次加強免疫后能明顯促進IgGl抗體的分泌，如圖7、8。(2)第三次免疫豬PRRS疫苗后7d處死小鼠，分離脾臟淋巴細胞，檢測淋巴細胞的增殖情況。結果顯示，PBS空白對照組小鼠的脾淋巴細胞的增殖情況不明顯；豬PRRS商用疫苗組小鼠脾淋巴細胞的增殖情況明顯好于PBP5空白對照組；而重組Τβ 4-BP5融合肽作為佐劑配合豬PRRS疫苗的聯合免疫組小鼠脾淋巴細胞的增殖能力最強，明顯高于豬PRRS疫苗+胸腺素β 4組和豬PRRS疫苗+法氏囊五肽ΒΡ5組，如圖9所示，表明重組T β 4-ΒΡ5融合肽具有促進免疫小鼠脾淋巴細胞增殖的功能。(3)應用定量ELISA對血清中的IL_4和IFN- Y進行定量分析發現重組T β 4-ΒΡ5融合肽作為佐劑對豬PRRS疫苗免疫小鼠血清中的IL-4和IFN- y的分泌均有明顯的促進作用，尤其是促進IFN- Y的分泌；而且豬PRRS疫苗+重組T β 4-ΒΡ5融合肽促進小鼠血清中分泌IL-4和IFN- Y的能力好于豬PRRS疫苗+胸腺素β 4組和豬PRRS疫苗+法氏囊五肽ΒΡ5組，如圖10、11所示。
權利要求
1.重組Tβ 4-ΒΡ5融合肽，其特征在于，該融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
2.一種編碼權利要求1所述的重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽的基因，其特征在于，該融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據權利要求2所述的一種編碼重組Τβ4-ΒΡ5融合肽的基因，其特征在于，所述融合肽基因由胸腺素β 4基因和法氏囊五肽ΒΡ5基因通過柔性連接肽Linker基因串聯而成，并在5’端加有腸激酶識別位點基因序列。
4.一種表達權利要求1所述的重組Τβ 4-BP5融合肽的工程菌，其特征在于，該工程菌的構建方法包括以下步驟: 1)重組Tβ 4-ΒΡ5融合肽基因SOE-PCR擴增 根據豬大腸桿菌偏嗜密碼子設計重組T β 4-ΒΡ5融合肽基因，并針對該融合肽基因設計引物Fp F2和F3,然后進行SOE-PCR擴增；將PCR擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶進行回收，回收產物中片段大小為159bp的為重組Τβ4-ΒΡ5融合肽基因； 2)攜帶重組Tβ 4-ΒΡ5融合肽基因的工程菌的構建 將重組Τβ4-ΒΡ5融合肽基因和質粒載體pET32a用EcoR1、XbaI雙酶切，并將酶切的重組Τβ4-ΒΡ5融合肽基因和質粒載體pET32a連接，連接產物轉化E.coli DH5 α ;提取質粒，并將重組表達質粒進行HindIII缺失酶鑒定；酶切鑒定為陽性的質粒測序，命名為pET32a-T β 4-ΒΡ5 ;將重組質粒pET32a_T β 4-ΒΡ5轉化進入大腸桿菌BL21中，篩選陽性克隆，即為表達重組Τβ 4-ΒΡ5融合肽的工程菌。
5.根據權利要求4所述的重組Τβ4-ΒΡ5融合肽基因的工程菌，其特征在于，所述引物F1:5 ’ -CCGGAATTCACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGA CTGA-3’ ；F2:5’ -TCTCCTGCTCGATCGTCTCCTTCGATGGTAGTGGATTCTTCTCTTGAGTCTCAGTCTTCTTG-3’ ；F3:5 ’ -TCGAGCAGGAGAAGCAAGCTGGCGAGTCCGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAATCTAGATCG-3，。
6.—種如權利要求1所述的重組Τβ 4-BP5融合肽在作為免疫佐劑方面的應用。
全文摘要
本發明公開了重組Tβ4-BP5融合肽、基因、工程菌及應用。該重組融合肽為胸腺素β4和法氏囊五肽BP5通過柔性Linker融合而成。本發明將重組Tβ4-BP5融合肽基因插入表達載體，轉化大腸桿菌，獲得高效表達重組Tβ4-BP5融合肽的基因工程菌，通過液體培養、純化制得的重組Tβ4-BP5融合肽，該融合肽經N端帶有His標簽的腸激酶去除硫氧還蛋白，再經親和層析純化，可獲得單一的重組Tβ4-BP5融合肽。本發明的重組Tβ4-BP5融合肽可作為配合疫苗使用的新型多肽免疫佐劑，能夠有效增強機體細胞免疫和體液免疫水平，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/62GK103145854SQ20131007109
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者王臣, 張才, 馮書營, 牛明媚, 李振華, 郭香玲, 李小康, 劉一塵, 張春杰 申請人:河南科技大學