專利名稱：降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種融合蛋白及其編碼基因。
背景技術(shù)：
Rosenfeld等于1983年發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是ー種生物活性肽，它與降鈣素(CT)均來(lái)源于位于11號(hào)染色體的CT/CGRP基因，但是由于CT/CGRP基因不同的RNA編碼而翻譯成CGRP和CT，CGRP是應(yīng)DNA基因重組和分子生物技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的ー種由37個(gè)氨基酸組成的生物活性多肽，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性擴(kuò)血管肽類物質(zhì)，對(duì)神經(jīng)、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系統(tǒng)具有重要作用。CGRP的舒張冠狀血管的作用遠(yuǎn)強(qiáng)于P物質(zhì)，心鈉素和去甲腎上腺素(NE)，比こ酰膽堿(Ach)、5-羥色胺(5-HT)等強(qiáng)10000倍左右，比異丙腎上腺素強(qiáng)10-100倍。犬鉤蟲(chóng)吸血時(shí)，其頭腺 能分泌ー種抗凝血活性物質(zhì)，被稱作犬鉤蟲(chóng)抗凝血肽(anticoagulant peptide, AcAPs)。該物質(zhì)本質(zhì)是ー種蛋白水解酶,具有延長(zhǎng)血衆(zhòng)凝血酶原時(shí)間(Pt)、抑制血液凝固以及促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用。目前發(fā)現(xiàn)的AcAPs有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三種重組蛋白，其中AcAPc2(10KD)是Xa因子的高效特異抑制劑，其抗血栓效果明顯優(yōu)于凝血酶抑制劑，AcAPc2作為Xa因子的高效特異抑制劑對(duì)血小板聚集功能影響甚小，用于抗血栓治療時(shí)引發(fā)出血的危險(xiǎn)性小。1998年，Donnelly等報(bào)道AcAPc2在體內(nèi)還具有抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成為臨床上ー種新的抗凝劑和抗血栓治療藥物。然而目前這兩種蛋白単獨(dú)作用，效果單一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白及其編碼基因，以期獲得ー種能同時(shí)具有治療高血壓和抗血栓雙重作用的融合蛋白，兩種蛋白之間作用互補(bǔ)且協(xié)同增效。本發(fā)明降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。上述降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白編碼基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，將降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合，兩者之間作用互補(bǔ)且協(xié)同增效，所得融合蛋白經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有很好的抗血栓和治療高血壓的作用。本發(fā)明的融合蛋白可由于制備抗血栓及預(yù)防和治療高血壓疾病的藥物，為抗凝血及預(yù)防和治療高血壓疾病的研究打下基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白的制備方法，按以下步驟進(jìn)行一、融合蛋白CGRP/AcAPc2基因的合成CGRP和AcAPc2融合基因內(nèi)設(shè)計(jì)ー個(gè)Kpn I酶切位點(diǎn)，由上海生エ公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因兩端分別添加BamHI和EcoR I酶切位點(diǎn)，然后克隆在PUC57載體上，獲得pUC (CGRP/AcAPc2)載體；ニ、重組表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟一獲得的pUC (CGRP/AcAPc2)載體用BamHI和EcoR I雙酶切，再與同樣經(jīng)BamHI和EcoR I雙酶切的表達(dá)載體pGEX_6P_l連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重組表達(dá)載體pGEX-CGRP/AcAPc2 ；三、基因工程菌株的構(gòu)建然后將載體pGEX-CGRP/AcAPc2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌37°C過(guò)夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)買自北京艾德萊生物科技有限公司)提取質(zhì)粒DNA，用Kpn I單酶切，并用相應(yīng)的空白質(zhì)粒pGEX-6P-l作為對(duì)照，將含有Kpn I酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的即為陽(yáng)性重組菌；其中大腸桿菌BL21 (DE3)為購(gòu)買得到； 四、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將陽(yáng)性重組菌置于LB培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)15h，然后采用GST標(biāo)簽融合蛋白方法進(jìn)行蛋白的分離純化，本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白的純度為98%，融合蛋白表達(dá)量為38. 1%。步驟ニ中pUC (CGRP/AcAPc2)載體用BamHI和EcoR I雙酶切的體系如下
權(quán)利要求
1.降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.如權(quán)利要求1所述降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白的編碼基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
全文摘要
降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白及其編碼基因，涉及一種融合蛋白及其編碼基因。本發(fā)明的目的在于提供降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合蛋白及其編碼基因，以期獲得一種能同時(shí)具有治療高血壓和抗血栓雙重作用的融合蛋白，兩種蛋白之間作用互補(bǔ)且協(xié)同增效。融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明將降鈣素基因相關(guān)肽和犬鉤蟲(chóng)抗凝肽AcAPc2融合，兩者之間作用互補(bǔ)且協(xié)同增效，所得融合蛋白經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有很好的治療高血壓及抗血栓的作用。本發(fā)明的融合蛋白可由于制備抗血栓及預(yù)防和治療高血壓疾病的藥物。
文檔編號(hào)C12N9/64GK103031293SQ20121058536
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者余瓊 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)