專利名稱：毛果楊中分離的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從植物中分離的啟動(dòng)子，尤其涉及從毛果楊(Populustrichocarpa Torr.& Gray)所分離的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子,本發(fā)明還涉及含有該花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體以及宿主細(xì)胞，本發(fā)明進(jìn)一步涉及它們在研究花器官基因表達(dá)模式或轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制、改良植物性狀、培育植物新品種等方面的應(yīng)用，屬于植物組織或器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子的分離及其應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列，是重要的順式作用元件，一般位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)。高等植物基因調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行，啟動(dòng)子控制著基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)程度，同時(shí)對所使用的RNA聚合酶類型也起著決定性作用，所以它是理解基因表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵，是植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式及功能，可將其分為三類:組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。目前，在植物基因工程中使用的大多數(shù)為組成型啟動(dòng)子，使外源目的基因在植物各組織部位高水平表達(dá)，但是，在此過程中會(huì)出現(xiàn)多種多樣的問題，例如不能從時(shí)間和空間上有效地調(diào)控目的基因的表達(dá)，過度消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量(Gittins JR, Pellny TK,Hiles ER, Rosa C, Biricolti S，et al.(2000)Transgeneexpression driven by heterologous ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small-subunit gene promoters in the vegetative tissues of apple(Maluspumila mill.).Planta210:232-240.);大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破植物的代謝平衡，不利于植物生長(Robinson DJ(1996)Environmental risk assessmentof releases of transgenic plants containing virus-derived inserts.Transgenicresearch5:359-362.);引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象(Kumpatla SP, ChandrasekharanMB,Iyer LM, Guofu L, Hall TC(1998)Genome intruder scanning and modulation systemsand transgene silencing.Trends in Plant Science3:97_104 ;Mette MF, Aufsatz ff, vander Winden J, Matzke MA, Matzke AJ(2000)Transcriptional silencing and promotermethylation triggered by double-stranded RNA.EMBO J19:5194-5201.);此外還存在轉(zhuǎn)基因植物安全性隱憂。因此，科學(xué)家們不斷尋找更為有效的組織或器官特異性啟動(dòng)子來代替組成型啟動(dòng)子，以期更精確的調(diào)控外源基因的表達(dá)。組織或器官特異性啟動(dòng)子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄過程一般只發(fā)生在某些特定的組織或者器官中。組織或器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子可以更加經(jīng)濟(jì)有效的調(diào)控外源基因的表達(dá)，特異地在特定需要的部位發(fā)揮作用，這樣不僅可以提高外源基因的表達(dá)豐度，而且將生物能耗降到最低，從而不影響植株的正常生長。另外，深入研究組織或器官特異性啟動(dòng)子有助于闡明植物形態(tài)、發(fā)育、代謝途徑等基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛地應(yīng)用價(jià)值。對組織或器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子進(jìn)行深入地研究已成為當(dāng)前植物基因工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前與植物開花相關(guān)的組織或器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子的研究主要集中在擬南芥(Arabidopsis thaliana) (Nitz I, Berkefeld Hj Puzio PSj Grundler FM(2001)Pykl0, aseedling and root specific gene and promoter from Arabidopsis thaliana.PlantScil61:337-346 ；Paul Wj Hodge Rj Smartt Sj Draper J，Scott R(1992)The isolationand characterisation of the tapetum—specific Arabidopsis thaliana A9gene.Plant Mol Bioll9:611_622 ;Bell_Lelong DA，Cusumano JCj Meyer K，Chappie C(1997)Cinnamate-4-hydroxylase expression in Arabidopsis.Regulation in response todevelopment and the environment.Plant Physiolll3:729_738.)、煙草(Nicotianatabacum)等草本模式植物(Borisjuk NVj Borisjuk LGj Logendra S，Petersen F，GlebaY，et al.(1999)Production of recombinant proteins in plant root exudates.Nat Biotechnoll7:466_469.)、或者馬鈴薯(Solanum tuberosum) (TrindadeLMj Horvath B，Bachem C，Jacobsen Ej Visser RG(2003)Isolation and functionalcharacterization of a stolon specific promoter from potato (Solanum tuberosumL ).Gene303:77_87.)、玉米(Zea mays) (Taniguchi Mj Izawa K，Ku MS, Lin JHj SaitoH，et al.(2000)The promoter for the maize C4pyruvate, orthophosphate dikinasegene directs cell—and tissue-specific transcription in transgenic maize plants.Plant Cell Physiol41:42-48.)、水稻(Oryza sativa) (Takaiwa F，Kikuchi S，OonoK(1986)The structure of rice storage protein glutelin precursor deduced fromcDNA.FEBS letters206:33-35 ；Wu HK，Chen T，Chung MC(1996)Analysis of5’region ofglutelin genes from wild rice species.Botanical Bulletin of Academia Sinica37 ；Yoshihara Tj Washida Hj Takaiwa F(1996) A45_bp proximal region containingAACA and GCN4motif is sufficient to confer endosperm-specific expressionof the rice storage protein glutelin gene, GluA-3.FEBS Lett383:213-218 ;Vasconcelos M，Datta Kj Oliva Nj Khalekuzzaman Mj Torrizo L，et al.(2003)Enhancediron and zinc accumulation in transgenic rice with the ferritin gene.PlantSciencel64:371-378 ；Datta Kj Baisakh Nj Oliva Nj Torrizo Lj Abrigo E，et al.(2003)Bioengineered’ golden’ indica rice cultivars with beta-carotene metabolism in the endosperm with hygromycin and mannose selection systems.Plant BiotechnolJl:81_90)、番煎(Solanum lycopersicum) (Sandhu JSj Krasnyanski SFj Domier LL，KorbanSS，Osadjan MD，et al.(2000)Oral immunization of mice with transgenic tomatofruit expressing respiratory syncytial virus-F protein induces a systemicimmune response.Transgenic research9:127-135.)、油菜(Brassica napus) (AlbaniD，Robert LS，Donaldson PA，Altosaar I，Arnison PGj et al.(1990)Characterization ofa pollen-specific gene family from Brassica napus which is activated duringearly microspore development.Plant Mol Bioll5:605_622 ;Ye Lj Li C，Song Y(2000)Construction of plant seed-specific expression vectors pSCB and pSCAB and theobtainment of transgenicBrassica napus H165expressing poly-3-hydroxybutyratesynthetic genes.Chinese Science Bulletin45:1206-1211 ；Zhang J，Li L，Song Y(2002)Identification of seed-specific promoter nap300and its comparison with7Spromoter.Progress in Natural Sciencel2:737-741.)等農(nóng)作物上，而對于多年生木本植物，尤其對于楊樹開花相關(guān)的組織或器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子的研究相對薄弱，鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供從毛果楊(Populus trichocarpa Torr.&Gray)中分離的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子。本發(fā)明目的之二是提供含有上述花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體以及含有該重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明目的之三是將所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子以及含有該花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體應(yīng)用于研究花器官的基因表達(dá)模式或轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物、改良植物性狀、培育植物新品種等。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種從毛果楊(Populus trichocarpaTorr.&Gray)中分離的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子PtAPl_2pro,其核苷酸序列為(a)或(b)所示:(a)、SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；(b)、與SEQ ID N0.1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸仍具有花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的功能或活性。優(yōu)選的,本發(fā)明所述的從毛果楊(Populus trichocarpa Torr.&Gray)中所分離的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子PtAPl-2pix)為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。為研究PtAPl-2啟動(dòng)子的功能，本發(fā)明將PtAPl-2啟動(dòng)子與⑶S可操作的連接，構(gòu)建得到PtAPl-2pro::⑶S植物表達(dá)載體；此外，將CaMV35S啟動(dòng)子與⑶S可操作的連接，構(gòu)建得到CaMV35Spro::GUS植物表達(dá)載體作為陽性對照；以煙草的根、莖、葉及花為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法對PtAPl-2啟動(dòng)子進(jìn)行功能驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明PtAPl-2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因僅在煙草萼片和花瓣中特異表達(dá)，在根、莖、葉、雄蕊和心皮等其它組織部位里沒有⑶S表達(dá)活性；CaMV35S驅(qū)動(dòng)的⑶S基因(陽性對照CaMV35Spro::⑶S)在根、莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊、心皮等各個(gè)組織部位均有⑶S表達(dá)活性。陰性對照(未轉(zhuǎn)化材料)無⑶S表達(dá)活性。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),本發(fā)明從毛果楊(Populus trichocarpa Torr.&Gray)中所分離的啟動(dòng)子PtAPl-2pix)為花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有所述花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體以及含有該重組植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。將本發(fā)明所述花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子與待轉(zhuǎn)錄的異源性DNA序列進(jìn)行可操作的連接，即得到在植物的花器官的特定部位中(例如:萼片和花瓣)轉(zhuǎn)錄或表達(dá)所述異源性DNA序列的重組植物表達(dá)載體。所述的重組植物表達(dá)載體中還可含有選擇標(biāo)記基因。另外，可以將本發(fā)明的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子與標(biāo)記序列可操作的連接以確定標(biāo)記序列的活性，所述的標(biāo)記序列通常包括提供抗生素抗性或除草劑抗性的基因，諸如:四環(huán)素抗性基因、潮霉素抗性基因；草苷膦或草丁膦抗性基因等。可以采用任何植物轉(zhuǎn)化方法將本發(fā)明所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體引入到目標(biāo)植物(所述的目標(biāo)植物包括被子植物、裸子植物；單子葉植物和雙子葉植物；草本植物、木本植物和藤本植物；一年生植物和多年生植物；水生植物和陸生植物等)的細(xì)胞、組織或器官中，得到轉(zhuǎn)化體；再由轉(zhuǎn)化體通過植物組織培養(yǎng)方法再生得到完整的植株及其無性系或其后代；所述的轉(zhuǎn)化方法包括:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化以及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、顯微注射、電穿孔法、微粒轟擊等。本發(fā)明花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子在研究花器官的基因表達(dá)模式或轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物、改良植物性狀、培育植物新品種等方面有廣泛的應(yīng)用。將本發(fā)明的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子可操作的與待轉(zhuǎn)錄的異源性DNA序列相連接，可以指導(dǎo)或調(diào)控待轉(zhuǎn)錄的異源基因在植物花器官中的特定部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，得到具有預(yù)期性狀的轉(zhuǎn)基因植物或植物新品種。例如，將本發(fā)明的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子可操作的與待轉(zhuǎn)錄的異源DNA序列相連接(其中，該待轉(zhuǎn)錄的異源DNA序列還與3'非編碼區(qū)可操作的連接，所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。)得到可以在植物花瓣或萼片中表達(dá)該待轉(zhuǎn)錄的異源DNA序列的植物表達(dá)載體。待轉(zhuǎn)錄的異源DNA序列不受限制，可以是調(diào)節(jié)基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA等；所述的待轉(zhuǎn)錄的異源DNA序列可以是來自非靶基因物種的核酸分子或基因，或者是起源于或存在于相同的物種中 經(jīng)過人工改造或修飾的核酸分子或基因。通常來說，待轉(zhuǎn)錄的異源DNA序列多為提供與下列期望特征有關(guān)的DNA序列，包括:植物形態(tài)、生理、生長和發(fā)育、產(chǎn)量、營養(yǎng)強(qiáng)化、病蟲害抗性、環(huán)境或化學(xué)耐受性等，為植物體提供有益的性狀。該待轉(zhuǎn)錄的異源DNA序列可以包括具有RNA活性的序列或產(chǎn)生多肽產(chǎn)物的序列等，例如，可以是反義序列、RNAi序列、核酶序列、剪接體、氨基酸編碼序列以及它們的片段。更具體的，本發(fā)明所述的花器官特異啟動(dòng)子可以應(yīng)用于研究相關(guān)基因在花器官發(fā)育中的功能、調(diào)控植物花器官的發(fā)育或改良植物花器官的性狀(包括改良花色、花香等)。本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高(例如超過本底至少2倍。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會(huì)不同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗滌條件可鑒定與探針100%互補(bǔ)的祀序列。對于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn)(Ti jssen, Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度pH下的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度(在指定離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)(因?yàn)槟繕?biāo)序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件:其中在PH7.0到8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子濃度，通常為約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)而言為至少約30°C，而對于長探針(包括(但不限于)大于50個(gè)核苷酸)而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下:50%甲酰胺，5XSSC和1%SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5父33(:，1%303，在651:下培養(yǎng)，在0.2 X SSC中洗滌和在65 °C下于0.1%SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長時(shí)間。術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。術(shù)語“核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。術(shù)語“花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子”:在所述花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的調(diào)控下，異源基因的表達(dá)只限于花器官的特定部位，例如花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊或心皮等，并表現(xiàn)發(fā)育調(diào)控的特性。術(shù)語“異源性DNA序列”指該DNA序列對該特定的宿主細(xì)胞而言屬于外來的來源，或若來自相同的原始來源但對該原始序列進(jìn)行了修飾或改造。術(shù)語“內(nèi)源基因”來自宿主本身的基因，包括DNA或RNA序列。
·
術(shù)語“選擇標(biāo)記基因”:該基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)給予該細(xì)胞選擇優(yōu)勢，用這些選擇性標(biāo)記基因所轉(zhuǎn)化的這些細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢可以是由于它們與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長相比具有在陰性選擇劑(如:抗菌素或除草劑)的存在下生長的能力。選擇標(biāo)記基因還指多種基因的組合，它們在植物細(xì)胞中的表達(dá)給予該細(xì)胞陰性以及陽性的選擇優(yōu)勢。“可操作的連接”指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”:將異源性DNA序列引入到宿主細(xì)胞或有機(jī)體的方法。術(shù)語“表達(dá)”:內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。術(shù)語“編碼序列”:轉(zhuǎn)錄成RNA的核酸序列。術(shù)語“植物表達(dá)載體”:一種或多種用于實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化的DNA載體；本領(lǐng)域中這些載體常被稱為二元載體。二元載體連同具有輔助質(zhì)粒的載體是大多常用于土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的。二元載體通常包括=T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的順式作用序列、經(jīng)工程化處理以便能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記物，待轉(zhuǎn)錄的異源性DNA序列等。


圖1 pProtest質(zhì)粒載體圖譜。
圖2毛果楊PtAPl-2基因啟動(dòng)子克隆及酶切鑒定；(a):PtAP1-2啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增，
(b):重組質(zhì)粒雙酶切鑒定；M:lkb DNA ladder, 1: PCR產(chǎn)物，2:重組質(zhì)粒的Sac I和Kpn I雙酶切產(chǎn)物。圖3毛果楊PtAPl-2基因啟動(dòng)子序列分析。圖4毛果楊PtAPl_2pro: AUS植物表達(dá)載體構(gòu)建；a:PtAPl-2pro: AUS植物表達(dá)載體PCR鑒定及雙酶切鑒定；b:PtAPl_2pro::⑶S植物表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；M:1kb DNA ladder, 1: PCR產(chǎn)物,2:植物表達(dá)載體Sac I和Kpn I雙酶切產(chǎn)物。圖5煙草根、莖、葉及花組織的⑶S組織化學(xué)染色；A-E:根、莖、莖橫切、葉、花，PtAPl-2pro::GUS:轉(zhuǎn)化 PtAPl_2pro::GUS 載體的煙草，CaMV35Spro::GUS:轉(zhuǎn)化CaMV35Spro::⑶S載體的煙草(陽性對照)，WT:野生型煙草(陰性對照)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。生物材料與試劑1.1實(shí)驗(yàn)材料

用于提取植物基因組DNA的毛果楊(P.trichocarpa)無性系和遺傳轉(zhuǎn)化受體植物野生型煙草W38 (N.tabacum cv.W38)均取自林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌(Escherichia coli)菌株 DH5 α、根癌農(nóng)桿菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)GV3101由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存；pProtest質(zhì)粒載體由美國俄勒網(wǎng)州立大學(xué)Steven H.Strauss教授饋贈(zèng)，其示意圖見圖1 ;克隆載體PMD19-T購自TaKaRa公司。1.2主要試劑植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒以及普通質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根公司，LA Taq酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker Ladder)、T4-DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Sac I和Kpn I等購自TaKaRa公司；GUS ( β -葡萄糖苷酶，β -glucuronidase)組織化學(xué)染色底物5-溴-4-氯-3- H引哚-β -D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)購自Sigma公司。實(shí)施例1毛果楊PtAPl-2基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析按照北京天根公司植物基因組DNA提取試劑盒的操作流程，以毛果楊無性系葉片為材料提取基因組DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。根據(jù)毛果楊A(yù)P1-2基因5’側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物:上游引物5 ’ -AGAGCTCTGCAACACTATTAAT CAATTTATC-3 ’，下游引物5’ -AGGTACCCT CTCTCTCTCTCTCTAAATG-3，；在上下游引物的5’端分別加入Sac I和Kpn I酶切位點(diǎn)。20 μ L PCR反應(yīng)體系包括:2 μ L(IOOng)毛果楊基因組 DNA，2 μ LlOXLA PCR 緩沖液，1.6 μ L (2.5mmol/L) dNTP,
0.4μ LlOpm/μ L上游引物，0.4μ LlOpm/μ L下游引物，0.2μ L LA Taq DNA聚合酶(5U/UL)，13.4μ L ddH20。PCR 反應(yīng)循環(huán)條件為 94°C 預(yù)變性 3min，94°C 變性 30s，55。。退火 30s, 68 °C延伸2.5min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后68°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切下目的條帶，使用凝膠回收試劑盒(天根公司)回收、純化目的片段。將純化產(chǎn)物與PMD19-T載體連接，再轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，接種到含氨芐(100mg/L)的LB平板上37°C培養(yǎng)14h_16h，挑取單菌落進(jìn)行PCR，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶(Sac I和Kpn I )酶切鑒定，獲得陽性克隆，命名為PtAPl-2pro_T。以毛果楊基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到大小約為2.1kb的片段(圖2a)，與預(yù)期基本一致，將此片段回收與PMD19-T載體連接，經(jīng)菌落PCR和雙酶切(Sac I和Kpn I )(圖2b)驗(yàn)證后，證明該啟動(dòng)子片段已克隆到PMD19-T載體上。陽性克隆測序結(jié)果表明，該序列長度為2117bp。使用TSSP-TCM 在線軟件(Shahmuradov A, Solovyev V V, Gammerman AJ (2005)Plant promoter prediction with confidence estimation.Nucleic AcidsRes33:1069-1076)對測序結(jié)果進(jìn)行分析，預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；聯(lián)合運(yùn)用PLACE (HigoK,Ugawa Y, Iwamoto M,Korenaga T (1999)Plant cis-acting regulatory DNAelements(PLACE)database:1999.Nucleic Acids Res27:297-300 ;Higo K,UgawaY, Iwamoto M, Higo H(1998)PLACE:a database of plant cis-acting regulatory DNAelements.Nucleic Acids Res26:358-359.)及 PlantCARE (Lescot M, Dehais P, ThijsG, Marchal K, Moreau Y, et al.(2002)PlantCARE, a database of plant cis-actingregulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promotersequences.Nucleic Acids Res30:325-327 ；Rombauts S,Dehais P, Van Montagu M, RouzeP (1999)PlantCARE, a plant cis-acting regulatory element database.Nucleic AcidsRes27:295-296.)在線軟件對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行分析。使用TSSP-TCM在線軟件對PtAPl-2基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，預(yù)測其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為G，位于起始密碼子上游672bp處。聯(lián)合使用PLACE和PlantCARE在線軟件分析序列，預(yù)測其含有的主要啟動(dòng)子基本轉(zhuǎn)`錄元件(圖3)包括:TATA-box位于-50bp處，CAAT-box 分別位于-160bp、-206bp、-235bp 處，ARE 位于 _187bp 處，ELI_box3 位于 _414bp處，MRE 位于 _493bp 處，Skn-l_motif 位于 _509bp 處，GTl-motif 位于 _536bp 處，AE-box位于-568bp 處,3_AF3binding site 位于 _704bp 處，ATCT-motif 位于 _826bp 處，GCN4_motif 位于-767bp 和 _916bp 處，TC-rich repeats 位于 _1364bp 和 _1380bp 處，Box4 位于-519bp、-580bp、_945bp、_1168bp 和 _1432bp 處。其中，TATA-box為啟動(dòng)子核心元件,保證轉(zhuǎn)錄精確開始；CAAT_box可以控制轉(zhuǎn)錄的效率和頻率；ARE為厭氧誘導(dǎo)反應(yīng)過程中必不可少的順式作用元件；EL1-box3為激發(fā)子響應(yīng)元件；MRE為光響應(yīng)過程中MYB結(jié)合位點(diǎn)；Skn-l_motif和GCN4_motif為胚乳表達(dá)所需的相關(guān)順式作用元件；GTl-motif和AE-box為光響應(yīng)元件；3_AF3binding site為保守的DNA模塊陣列的一部分；ATCT-motif和Box4為光響應(yīng)過程中保守DNA模塊的一部分；TC-rich repeats為抗病和逆境脅迫響應(yīng)作用元件。試驗(yàn)例lPtAPl-2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在煙草花器官中特異表達(dá)試驗(yàn)1.PtAPl-2pro: AUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌制備為研究從毛果楊(Populus trichocarpa Torr.&Gray)中所分離的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子PtAPl-2(SEQ ID N0.1)的功能，將pProtest質(zhì)粒進(jìn)行Sac I和Kpn I雙酶切，同時(shí)將PtAPl-2pro-T重組質(zhì)粒進(jìn)行Sac I和Kpn I雙酶切，回收純化目的片段，通過T4-DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，新的重組質(zhì)粒經(jīng)氨芐霉素(Ampicillin, 100mg/L)和PCR篩選后，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，經(jīng)菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證(圖4a)，獲得重組植物表達(dá)載體PtAPl-2pro::⑶S ;同時(shí)，按照同樣的方法構(gòu)建CaMV35Spro::⑶S植物表達(dá)載體作為陽性對照(圖4b)。采用液氮凍融法，將表達(dá)載體PtAPl-2pix)::⑶S轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR鑒定，獲得陽性克隆，完成工程菌制備。2.PtAPl-2啟動(dòng)子在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)通過液氮凍融法將PtAPl_2pro::⑶S表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中。將煙草的根、莖、葉及花分別剪下，形成切口，浸泡于0D_ ^ 0.6的農(nóng)桿菌菌液中，真空抽濾20min。用無菌濾紙吸除材料表面多余的菌液，平鋪于MS固體培養(yǎng)基上，28 V暗培養(yǎng)2d。將共培養(yǎng)后的材料用含頭孢霉素(Cefotaxime，250mg/L)的溶液洗漆數(shù)次待用。按照 Jefferson 等(Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW(1987)GUSfusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker inhigher plants.EMBO J6:3901.)的方法對材料進(jìn)行⑶S組織化學(xué)染色分析，將材料浸泡于⑶S活性檢測液，37°C過夜，然后用70%乙醇脫色，觀察并拍照，其中⑶S活性檢測液包含:0.lmol/L K4Fe (CN)6,0.lmol/L K3Fe (CN) 6、50mmol/L 磷酸鈉緩沖液(ρΗ7.0)、10mmol/LNa2EDTA^0.001%(v/v)Triton X_100、0.5mg/ml X-Gluc 和 20% 甲醇。檢測結(jié)果表明，PtAPl-2啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因僅在煙草萼片和花瓣中特異表達(dá)，在根、莖、葉、雄蕊和心皮等其它組織部位里沒有⑶S表達(dá)活性；陰性對照(未轉(zhuǎn)化材料)無⑶S表達(dá)活性；陽性對照(CaMV35Spro::⑶S)在煙草的根、莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊、心皮等各個(gè)組織部位均有⑶S表達(dá)活性(圖5)。
權(quán)利要求
1.從毛果楊(Populustrichocarpa Torr.&Gray)中分離的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子,其特征在于，其核苷酸序列為(a)或(b)所示: (a)、SEQID N0.1所示的核苷酸序列； (b)、與SEQID NO:1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能夠進(jìn)行雜交的核苷酸序列，該核苷酸序列仍具有花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子活性。
2.一種表達(dá)盒，其特征在于，包括:含有權(quán)利要求1所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄的異源基因序列。
3.含有權(quán)利要求1所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體。
4.按照權(quán)利要求3所述的重組植物表達(dá)載體，其特征在于，包含:權(quán)利要求1所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄的異源基因序列；其中，花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄的異源基因序列可操作的相連接，待轉(zhuǎn)錄的異源基因序列位于所述花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的下游。
5.按照權(quán)利要求4所述的重組植物表達(dá)載體，其特征在于:所述的待轉(zhuǎn)錄的異源基因包括:結(jié)構(gòu)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA。
6.含有權(quán)利要求3-5任何一項(xiàng)重組植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物或培育植物新品種中的應(yīng)用，包括:將權(quán)利要求1所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄的異源基因序列可操作的連接后轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中得到轉(zhuǎn)化體；將轉(zhuǎn)化體通過組織培養(yǎng)再生得到完整的植株或無性系。·
8.權(quán)利要求1所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子在改良植物性狀中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子在分析花器官的基因表達(dá)模式或轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子在分析基因功能或構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了從毛果楊(Populus trichocarpa Torr.&Gray)中分離的花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用，屬于啟動(dòng)子的分離和應(yīng)用。所述啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還公開了含有所述花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體以及重組宿主細(xì)胞。功能驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因僅在煙草萼片和花瓣中特異表達(dá)，在煙草的根、莖、葉、雄蕊和心皮等其它組織部位里沒有GUS表達(dá)活性，說明本發(fā)明從毛果楊分離的啟動(dòng)子為花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步公開了所述花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子在改良植物性狀、培育植物新品種以及研究植物花器官的發(fā)育及調(diào)控機(jī)制等方面的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/113GK103243097SQ201310071708
公開日2013年8月14日 申請日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者安新民, 陳仲, 王佳, 李英, 葉梅霞, 季樂翔 申請人:北京林業(yè)大學(xué)