一種擬南芥花器官特異性啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種新發現的DNA序列，它可以作為啟動子調控目的基因特異性地表達在擬南芥的花器官中。本發明從模式植物擬南芥中克隆了AtcpSecY1基因的啟動子序列，隨后在轉基因擬南芥中證實，該啟動子能夠驅動GUS報告基因在擬南芥的花器官中特異性表達。應用本發明的啟動子，構建獲得“花器官特異性啟動子-待表達的目的基因”融合基因，將其轉化擬南芥可獲得花器官中特異性表達目的基因的轉基因植物。這不僅為深入研究植物花器官分化、形成、生長和發育的分子機制等理論研究提供重要的分子元件，還為植物基因工程育種，特別是名貴花卉的花形、花色、花香和觀賞壽命等調控的基因工程育種提供了重要的分子調控元件，具有廣泛的應用價值。
【專利說明】一種擬南芥花器官特異性啟動子及其應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于植物基因工程領域，具體說是利用分子生物學技術獲得一種擬南芥花器官特異性啟動子及其在轉基因植物中的應用。
【背景技術】
[0003]啟動子是位于結構基因上游一段特定的核酸序列，能夠控制其下游結構基因轉錄的起始時間和強度。啟動子就像“開關”，決定結構基因的活動。聞等植物基因的表達調控很多發生在轉錄水平上，并受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協調作用，植物基因啟動子是重要的順式作用元件(李杰等，2006)。
[0004]根據植物中啟動子啟動轉錄的模式和功能可將其分為三類:組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導型啟動子(王穎等，2003)。組成型啟動子在所有組織中都能啟動基因的表達，具有持續性，不表現時空特異性，RNA和蛋白質表達量也相對恒定；組織或器官特異性啟動子調控下的基因轉錄一般只發生在某些特定器官或組織中；誘導型啟動子是在某些物理或化學信號的誘導下，可以提高目的基因的表達水平(王穎等，2003 ;路靜等，2004)。
[0005]在組成型啟動子中，使用最廣泛的是花椰菜花葉病毒的dK 啟動子、來自根癌農桿菌Ti質粒T-DNA區域的胭脂堿合成酶基因Mxs啟動子和章魚堿合成酶基因Ocs啟動子等(王穎等，2003;李杰等，2006)。目前，雖然許多研究利用組成型啟動子驅動目的基因的表達對于基因的功能研究取得了一定的進展，但是由于利用組成型啟動子會導致所驅動的目的基因在植物所有組織中大量表達，過度消耗細胞內的物質和能量，并且不能從時空間上調控目的基因的表達，因此在應用中存在很多的弊端(Gittins et al., 2000)。如使用組成型啟動子會導致目的基因在整體植株中表達，產生大量的代謝產物使原有的代謝失衡，阻礙了植物的正常生長發育，甚至導致死亡(Gilmour et al., 2004; Qin et al.,2004; Savitch et al., 2005; Thomashow, 2010)。另外，重復使用組成型啟動子驅動多個外源基因的表達可能引起基因沉默(Kumpatla et al.，1998)。因此，亟待需要尋找更為有效的組織器官特異性啟動子代替組成型啟動子，以更好地調控植物基因的表達。組織器官特異性啟動子由于其驅動目的基因的表達發生在某些特定的器官或組織部位并具有發育的調節性，所以在很大程度上可以克服利用組成型啟動子在理論和應用研究中突顯的種種缺陷。目前在許多種植物中已經發現了這類組織器官特異性啟動子并得到了廣泛的應用。如毛自朝等(2002)將番茄果實特異性啟動子和目的基因構成的融合基因轉入番茄，獲得了無籽番茄果實，且果實采后的儲藏保鮮時間大大被延長。Mariani等(1990;1992)將煙草花藥絨氈層特異表達基因的啟動子TA29 gBsnrnse基因融合后轉化植物核酸酶基因在花藥中特異表達，獲得了煙草和油菜的雄性不育材料，隨后基于TA29-Barnase雄性不育的轉基因油菜獲得商業化應用。[0006]擬南芥屬于十字花科，由于其個體形態小、生長周期短、繁殖能力強、基因組小和生物信息資源豐富等特點，成為植物遺傳學、發育生物學和分子生物學研究的模式植物(張振楨等，2006)。花是種子植物的繁殖器官，一朵完全的花由花柄、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊等幾部分組成。在理論研究方面，花作為植物重要的生殖器官，在利用植物雜種優勢人工創建不育系、以花器官的表達元件研究參與花器官發育基因的功能等研究中起重要的作用；在應用方面，隨著人們對花卉的需求日益增加，在觀賞品質如花形、花色、花香和觀賞壽命等方面具有優良特性的高檔奇異花卉具有廣闊的市場前景(鄭少緣等，2011)。基因工程育種具有育種周期短、效率高、培育定向性等優點，在花卉基因工程研究中，植物花器官特異性啟動子可使目的基因在花中特異表達具有時空性，為改良和創造優、新、特花卉品種提供了一條新的途徑。
[0007]目前還沒有一種在分子生物學模式植物擬南芥花器官特異性表達的啟動子，因此本領域迫切需要篩選和開發有利于擬南芥或其他植物花器官特異性表達的啟動子。獲得并有效利用植物花器官特異性啟動子不僅有助于闡明植物花器官發育的基礎理論問題，更可以有針對性地調控名貴花卉的花形、花色、花香和觀賞壽命，勢必將成為花卉性狀改良和新品種培育的強有力工具，具有廣泛的應用價值。

【發明內容】

[0008]本發明目的是解決現有植物基因工程技術技術中，因使用組成型啟動子，外源基因在轉基因植物中過量表達異源蛋白或代謝產物，使植物原有的代謝失衡，阻礙了植物的正常生長發育，甚至導致死亡，以及重復使用同一種組成型啟動子驅動多個外源基因的表達可能引起基因沉默的問題。同時為深入研究參與植物花器官發育基因的功能，有效調控花卉的花形、花色、花香和觀賞壽命等觀賞品質，提供一種分子生物學模式植物擬南芥花器官特異性的啟動子及其在轉基因植物中的應用。
[0009]本發明提供了一種新的、2085bp的擬南芥花器官特異性啟動子，該啟動子核酸序列選自:
(a)如序列表1所示的核酸序列；
(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有80%以上的同源性的核酸序列。作為具體應用的實例，本發明提供了一種擬南芥花器官特異性啟動子的克隆方法，具體操作步驟如下:
第一、以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴增花器官特異性啟動子；
第二、回收PCR擴增產物；
第三、將上述第二步回收的擴增產物，與pMD-18載體(購自TaKaRa公司)在連接酶催化下進行連接反應；
第四、將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞；
第五、通過氨芐霉素抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。
[0010]本發明同時提供了擬南芥花器官特異性啟動子的應用，即:利用獲得的花器官特異性啟動子，構建“啟動子-目的基因”的融合基因，進行植物轉化，從而獲得基因組中含有以上所述啟動子核酸序列的、可在擬南芥花器官特異性表達目的基因的轉基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何針對基礎研究、轉化技術、花卉或者農作物性狀改良需要的目的基因。[0011 ] 作為具體應用的實例，本發明提供了一種“啟動子-GUS報告基因”融合基因的構建及其在轉基因擬南芥花器官中進行特異性表達。具體操作過程如下:
第一、用油<3 I /Nco I雙酶切含有擬南芥花器官特異性啟動子的TA克隆質粒，回收花器官特異性啟動子片段；
第二、用I /Nco I雙酶切pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司)質粒，回收大的載體片段(其中含有報告基因的編碼序列)；
第三、混合上述第一步得到的花器官特異性啟動子片段和第二步得到的pCAMBIA 1301載體大片段，在連接酶催化下進行連接反應，完成在pCAMBIA 1301載體上的“花器官特異性啟動子-GUS”融合基因的構建。
[0012]其中所設計的擬南芥花器官特異性表達啟動子的PCR擴增引物如下，其中上游引物引入了^?a I酶切位點，下游引物引入了 Afco I酶切位點:
上游引物:5 ’ -TCTAGAGAACCATTGGCCATGTCGCTCA-3，
下游引物:5’ -CCATGGCCTTATCCTTCTTCTCCTTC-3’。
[0013]所述應用中的“花器官特異性啟動子報告基因”在轉基因擬南芥花器官中特異表達，操作過程如下:
擬南芥轉化的具體方法，采用農桿菌介導的Floral dip的方法(Clough and Bent,1998)，獲得的種子經過50 mg 1潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉土培養，利用組織化學染色的方法(Blume and Grierson, 1997),檢測轉基因擬南芥整個生長發育過程中各個組織器官中報告基因表達的花器官特異性。
[0014]本發明的優點和積極效果:
本發明利用有效的擬南芥花器官特異性啟動子代替組成型啟動子，可以用于構建在分子生物學模式植物擬南芥花器官特異性表達目的基因的融合基因。利用遺傳轉化技術將其轉入擬南芥或其他植物的基因組中，可以實現對目的基因的定向操作，獲得花器官特異性表達目的基因的轉基因植物。這種擬南芥花器官特異性表達啟動子不僅有助于闡明植物花器官發育的基礎理論問題，更可以有針對性地調控名貴花卉的花形、花色、花香和觀賞壽命，勢必將成為花卉或者農作物性狀改良和新品種培育的強有力工具，具有廣泛的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是擬南芥花器官特異性啟動子克隆的電泳檢測圖。
[0016]圖2是擬南芥“花器官特異性啟動子”轉基因擬南芥植株的PCR鑒定。
[0017]圖3是“花器官特異性啟動子轉基因擬南芥植株的GUS染色結果。
【具體實施方式】
[0018]實施例1:擬南芥花器官特異性的啟動子克隆
第一、以擬南芥基因組DNA為模板，利用PCR方法擴增2085bp的花器官特異性啟動子，回收擴增產物并進行TA克隆。
[0019](I) PCR擴增目的片段:
①根據已知的擬南芥JteASfecZ/基因啟動子區的序列設計特異引物，在上游引物中引KXba I酶切位點，在下游引物中引入Afco I酶切位點。
[0020]h游引物:5’ -TCTAGAGAACCATTGGCCATGTCGCTCA-3’ (引入油a I 酶切位點)
下游引物:5 ’ -CCATGGCCTTATCCTTCTTCTCCTTC-3，(引入 Afco I 酶切位點)
②按常規方法提取擬南芥基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，制備花器官特異性啟動子片段。
[0021]PCR反應程序:
94 °C 3分鐘；
940C 30 秒，56 0C 30 秒，72 °C 2 分 30 秒，32 個循環；
72 V 10分鐘；
4 C保溫。
[0022]PCR反應體系:
【權利要求】
1.一種擬南芥花器官特異性啟動子，其特征在于該核酸序列選自: (a)如序列表1所示的核酸序列； (b)在(a)限定的核酸序列中至少具有80%以上的同源性的核酸序列。
2.根據權利要求1所述的擬南芥花器官特異性啟動子，其特征在于，所設計的擬南芥花器官特異性啟動子的PCR擴增引物如下，其中上游引物中引入了 Xba I酶切位點，下游引物中引入了 Nco I酶切位點；
上游引物:5 ’ -TCTAGAGAACCATTGGCCATGTCGCTCA-3，
下游引物:5’ -CCATGGCCTTATCCTTCTTCTCCTTC-3’。
3.根據權利要求1所述的擬南芥花器官特異性啟動子，其特征在于，從擬南芥基因組DNA中克隆獲得花器官特異性啟動子，具體操作步驟如下: (1)以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴增花器官特異性啟動子； (2)回收PCR擴增產物； (3)將上述⑵步回收的擴增產物，與PMD-18T在連接酶催化下進行連接反應； (4)將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞； (5)通過抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。·
4.一種權利要求1所述的擬南芥花器官特異性啟動子的應用，其特征在于，利用該啟動子構建獲得花器官特異性啟動子-待表達的目的基因的融合基因，將其轉化擬南芥或其他植物，從而獲得基因組中含有權利要求1所述啟動子核酸序列的、可在擬南芥或其他植物花器官特異性表達相應目的基因的轉基因植物。
5.一種權利要求1所述的擬南芥花器官特異性啟動子的應用，其特征在于，利用該啟動子構建獲得花器官特異性啟動子-GUS融合基因，在轉基因擬南芥或其他植物中驅動GUS報告基因在花器官中特異性表達。
【文檔編號】C12N15/113GK103589726SQ201310540694
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】劉棟, 李衛春, 馬利霞, 程建峰, 候玲 申請人:江西農業大學