專利名稱：一種篩選水產源氣單胞菌的簡便方法
技術領域：
:本發明屬于微生物領域，具體涉及一種篩選水產源氣單胞菌的簡便方法。
背景技術：
:氣單胞菌屬于氣單胞菌科，廣泛分布在水環境，也常在人體、水產動物和食物中檢出。水產動物源氣單胞菌主要有嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌等，同時也是常見的人魚共患病原菌，能引起人的食物中毒、腹瀉、敗血癥等。氣單胞菌具有廣泛的致病性，在高溫季節，容易單獨或者混合感染包括魚蝦類、貝類、爬行兩棲類等多種水產動物，是水產養殖中一種危害性較高的病原菌，容易引起水生動物多種細菌病的暴發，且危害程度高于其它細菌性疾病，成為我國淡水水產養殖業發展的主要威脅(唐江芳，氣單胞菌及其在水產中的危害，2007)。而臨床上的盲目用藥，使病原菌在大范圍藥物選擇壓力下，漸漸保留了氣單胞菌耐藥菌株，甚至是多重耐藥菌株，致使抗生素療效下降(蔡麗娟，等，水產致病性嗜水氣單胞菌耐藥性比較與分析，水產科學，2011)。這不僅導致藥物對水生動物疾病的防控能力大大減弱，同時也嚴重影響水產動物源性食品的質量安全，還存在將耐藥性傳播給人類致病菌的潛在風險。因此，監測養殖動物和養殖水體中氣單胞菌的存在及其耐藥性是防治相關水產動物疾病和保證食品安全的重要措施，而如何高效簡便的篩選出氣單胞菌是目前最需解決的問題。目前篩選氣單胞菌的技術有:1、通過普通培養基培養純化單菌落后利用細菌快速自動鑒定系統進行篩選，該法需要昂貴的儀器設備和技術熟練的操作人員；2、通過普通培養基培養純化單菌落后利用核酸的檢測技術，包括DNA和PCR技術(聚合酶鏈式反應技術)，雖然具有快速、簡潔和靈敏的特點，但該法需要昂貴的儀器設備和技術熟練的操作人員；3、經典的生理生化鑒定方法，該法不僅繁瑣、耗時，且要求操作人員有良好的專業素質。4、目前也有些商品化的氣單胞菌培養基，如RS培養基、AHM培養基和APM培養基等，但分離率和準確率不高(凌紅麗，等，嗜水氣單胞菌選擇性培養基鑒別效果的比較，1998)。 發明內容:本發明的目的是提供一種篩選水產源氣單胞菌的簡便方法，利用該方法能夠簡便分離出水產源氣單胞菌，且成本低，準確率高，不需特殊儀器，為篩選分離水產源氣單胞菌提供了極大的方便。本發明的非疾病診斷和治療目的的篩選水產源氣單胞菌的簡便方法，其特征在于，將待檢測樣品在無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件；然后將增菌液接種到RS培養基平板上進行培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件，如若在RS培養基平板上呈黃色且光滑的菌落，則為氣單胞菌疑似菌；將氣單胞菌疑似菌接種至胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上進行培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件，再測試培養好的菌落的氧化酶活性；如果菌落能夠在無鹽堿性蛋白胨水中生長良好，且菌落在RS培養基平板上呈黃色且光滑，氧化酶試驗呈陽性，則判斷菌落為水產源氣單胞菌，則待檢測樣品中含有水產源氣單胞菌。本發明的待檢測樣品可以為底泥、環境水樣或者動物的組織樣品，當是底泥的時候，可以取3g底泥加入到2ml的無菌水中混勻并靜止IOmin后取100 μ L上層液體，接種到3ml無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌培養；當是環境水樣的時候，可以取100 μ L水樣，接種到3ml無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌培養；當是動物組織樣品的時候，如是動物的鰓、肝臟或病灶，可以取綠豆大小的動物組織接種于3ml無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌培養。所述的水產源氣單胞菌的常規培養條件優選，當在無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌培養時，其為28°C振蕩培養18 20h，當在RS培養基平板或胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上進行培養時，其為28°C靜置培養18 20h。測試菌落的氧化酶活性，可以將菌落劃線于氧化酶試紙上，Imin內觀察，若劃線處呈紫色或紫紅色，則為氧化酶陽性，如果不是，則氧化酶陰性。本發明的無鹽堿性蛋白胨水、RS培養基和胰蛋白胨大豆瓊脂培養基都是現有技術中已知的培養基，可以從試劑公司購買到。本發明是在研究分析現有選擇性培養基特性和氣單胞菌不同生理生化特性的基礎上建立的。通過增加一個用無鹽堿性蛋白胨水將嗜鹽嗜酸性細菌排除掉，初篩后的細菌經RS培養基培養和氧化酶試驗后，如果細菌在無鹽堿性蛋白胨水生長，并在RS培養基上呈黃色且光滑，氧化酶試驗呈陽性，則可判斷該細菌為水產源氣單胞菌。利用該方法能簡便分離出水產源氣單胞菌，且成本低，不需特殊儀器，為篩選分離水產源氣單胞菌提供了極大的方便。
具體實施方式
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以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。無菌水:將去離子水121°C高壓滅菌15min，置冰箱4°C保存備用。無鹽堿性蛋白胨水,配方:每升含有蛋白胨20g,硝酸鉀0.1g,結晶碳酸鈉0.2g,蒸餾水1000ml，將蛋白胨、硝酸鉀、結晶碳酸鈉稱量好之后，使其溶于IOOOml蒸餾水中，121°C高壓滅菌15min，或從試劑公司購買，按照其說明書配制，4°C保存備用。胰蛋白胨大豆瓊脂培養基,配方:每升含有胰蛋白胨15g，植物蛋白胨5g，氯化鈉5g,瓊脂15g，蒸餾水1000ml，將胰蛋白胨，植物蛋白胨,氯化鈉,瓊脂稱量好之后,使其溶于IOOOml蒸餾水中，121°C高壓滅菌15min，或從試劑公司購買，按照其說明書配制。然后倒平板，4°C保存備用。RS培養基，可以從試劑公司購買，按照其說明書配制，121°C高壓滅菌15min。然后倒平板，4°C保存備用。實施例1:對本實驗室分離保存的已鑒定的細菌進行篩選鑒定。實驗步驟:1、打開菌株凍干保存管，接種至3ml無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌，28°C振蕩培養18 20h，獲得增菌液。2、用接種環蘸取增菌液，接種于RS培養基平板上，28°C靜置培養18 20h。若菌落在RS培養基平板上呈黃色且光滑，則初步判斷為氣單胞菌疑似菌。3、挑取RS培養基平板上氣單胞菌疑似菌菌落,接種至胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上進行純化培養，28°C靜置培養18 20h，然后將長出的菌落劃于氧化酶試紙條，Imin內觀察，若劃線處呈紫色或者紫紅色，為氧化酶陽性，否則則氧化酶陰性。4、結果記錄若菌株在無鹽堿性蛋白胨水生長良好，記為“ + ”，不生長記為菌落在RS培養基平板上呈黃色且光滑記為“ + ”，不生長或菌落為綠色或綠黃色記為;氧化酶試驗結果陽性記為“ + ”，陰性記為三個實驗結果均為“ + ”則可判斷該試驗菌株為水產源氣單胞菌。試驗所使用的90株細菌中，有77株為水產源氣單胞菌，其中嗜水氣單胞菌43株，溫和氣單胞菌5株,維氏氣單胞菌10株,脆弱氣單胞菌3株,豚鼠氣單胞菌6株,簡達氣單胞菌3株,中間氣單胞菌I株,A.aquariorum (氣單胞菌屬的國內暫無譯文的菌株)5株,其他未定種的氣單胞菌屬菌株I株；金黃色葡萄球菌等非水產源氣單胞菌14株。實驗結果顯示,除了 2株A.aquariorum和I株脆弱氣單胞菌、I株維氏氣單胞菌在無鹽堿性蛋白胨水不生長外，其他73株水產源氣單胞菌均能篩選出來，分離準確率為94.80% ;其他13株非水產源氣單胞菌的實驗結果均不符合本發明所判定的水產源氣單胞菌。結果見表1:表1:實驗室分離保存的已鑒定的細菌篩選鑒定結果
權利要求
1.一種非疾病診斷和治療目的的篩選水產源氣單胞菌的簡便方法，其特征在于，將待檢測樣品在無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件；然后將增菌液接種到RS培養基平板上進行培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件，如若在RS培養基平板上呈黃色且光滑的菌落，則為氣單胞菌疑似菌；將氣單胞菌疑似菌接種至胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上進行培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件，再測試培養好的菌落的氧化酶活性； 如果菌落能夠在無鹽堿性蛋白胨水中生長良好，且菌落在RS培養基平板上呈黃色且光滑，氧化酶試驗呈陽性，則判斷菌落為水產源氣單胞菌，則待檢測樣品中含有水產源氣單胞菌。
2.根據權利要求1所述的簡便方法，其特征在于，所述的待檢測樣品為底泥、環境水樣或者動物的組織樣品。
3.根據權利要求1所述的簡便方法，其特征在于，所述的水產源氣單胞菌的常規培養條件，當在無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌培養時，其為28°C振蕩培養18 20h，當在RS培養基平板或胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上進行培養時，其為28°C靜置培養18 20h。
4.根據權利要求1所述的簡便方法，其特征在于，測試菌落的氧化酶活性，是將菌落劃線于氧化酶試紙上，Imin內觀察，若劃線處呈紫色或紫紅色，則為氧化酶陽性，如果不是，則氧化酶陰性。 ·
全文摘要
本發明公開了一種篩選水產源氣單胞菌的簡便方法。它是將待檢測樣品在無鹽堿性蛋白胨水中進行增菌培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件；然后將增菌液接種到RS培養基平板上進行培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件，如若在RS培養基平板上呈黃色且光滑的菌落，則為氣單胞菌疑似菌；將氣單胞菌疑似菌接種至胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上進行培養，培養條件為水產源氣單胞菌的常規培養條件，再測試培養好的菌落的氧化酶活性；如果菌落能夠在無鹽堿性蛋白胨水中生長良好，且菌落在RS培養基平板上呈黃色且光滑，氧化酶試驗呈陽性，則判斷菌落為水產源氣單胞菌，則待檢測樣品中含有水產源氣單胞菌。
文檔編號C12R1/01GK103194404SQ20131007338
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者鄧玉婷, 吳雅麗, 譚愛萍, 姜蘭, 羅理, 王偉利, 趙飛, 梁愛玲 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所