專利名稱：用于擴增核酸的組合物、方法和試劑盒的制作方法
用于擴增核酸的組合物、方法和試劑盒本申請是申請日為2006年9月29日、申請?zhí)枮椤?00680043159.5”、題為“用于擴增核酸的組合物、方法和試劑盒”的中國專利申請的分案申請。領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及用于擴增核酸同時減少非特異性熒光和不需要的擴增產(chǎn)物的組合物、方法和試劑盒。介紹盡管聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及相關(guān)的技術(shù)對于各種應(yīng)用是高度有用的，但是由于不理想的副反應(yīng)而引起的非靶核酸的擴增可能存在顯著的問題。這樣的副反應(yīng)可以作為非靶核酸的錯誤引發(fā)和/或引物寡聚化(有時也叫作引物二聚體形成)，以及這些引發(fā)的假體(artifacts)的后續(xù)擴增的結(jié)果而發(fā)生。在使用具有顯著的背景核酸而靶核酸以低拷貝數(shù)存在的核酸混合物進(jìn)行PCR的應(yīng)用中，這是特別實際的(參見，例如，Chou等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)20:1717-1723(1992))。非特異性擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生已經(jīng)至少部分歸因于延長非特異性退火的引物 的環(huán)境溫度下的DNA聚合酶活性(參見，例如，id.；Li等，Proc.Natl.Acad.Sc1.(美國國家科學(xué)院學(xué)報)87:4580 (1990))。因此，在環(huán)境溫度下抑制DNA聚合酶的活性有利于控制次級擴增子的產(chǎn)生。已經(jīng)描述了一些技術(shù)，據(jù)說其減少不需要的次級擴增產(chǎn)物的形成。按照某些“手工熱啟動”技術(shù)，直到混合物的溫度足夠高足以防止非特異性引物退火時才加入對DNA聚合酶活性重要的成分(例如，二價離子和/或DNA聚合酶本身)到反應(yīng)混合物中(參見，例如，Chou 等,Nucl.Acids Res.(核酸研究)20:1717-1723 (1992);和 D’Aquila 等,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)19:3749 (1991))。較少勞動力-密集型技術(shù)應(yīng)用擴增反應(yīng)的至少一種成分的物理分離或可逆失活。例如，鎂或DNA聚合酶可以隔離在蠟珠中，當(dāng)反應(yīng)溫度升高時蠟珠熔化，只在升高的溫度釋放所隔離的成分。按照其它的技術(shù)，對DNA聚合酶進(jìn)行可逆地失活或修飾，例如，通過DNA聚合酶的可逆的化學(xué)修飾或與抗體的結(jié)合(參見，例如，Birch等，美國專利號5，677，152)。在升高的反應(yīng)溫度，所述化學(xué)修飾被逆轉(zhuǎn)，或者所述抗體分子變性，釋放出功能性DNA聚合酶。然而，一些這樣的技術(shù)似乎是有漏洞的，原因在于在更低的反應(yīng)溫度，一些DNA聚合酶活性是可檢測到的，或者它們需要將反應(yīng)混合物延長暴露于高溫才能完全使得DNA聚合酶失活。某些目前所用的核酸擴增技術(shù)包括檢測和/或定量擴增產(chǎn)物的步驟，其包括核酸染料，例如但不限于，SYBR Green I (分子探針(Molecular Probes), Eugene, OR),包括某些實時和/或終點檢測技術(shù)(參見，例如，Ririe等，Analyt.Biochem.(分析生物化學(xué))245 =154-60 (1997))。典型地，所述核酸染料與擴增產(chǎn)物的雙鏈片段和/或引物_模板雙鏈體締合，并且在特別的核酸染料所特有的波長發(fā)射可檢測的熒光信號。某些擴增方法包括評估擴增產(chǎn)物的純度的檢測步驟，其包括核酸染料，例如但不限于，PCR后解離曲線分析，其也叫作解鏈曲線分析。由于擴增子的解鏈曲線特別取決于它的長度和序列，所以擴增子通常可以通過它們的解鏈曲線而區(qū)分(參見，例如，Zhang等，Ifepatology(肝臟病學(xué))36:723-28(2002))。解離或解鏈曲線可以在特定的擴增反應(yīng)過程中當(dāng)反應(yīng)溫度經(jīng)過所述擴增子的解鏈溫度時通過檢測核酸染料的熒光而獲得。雙鏈擴增子的解離觀察為在所述核酸染料特征性發(fā)射波長的熒光的突然減少。按照某些解離曲線分析技術(shù)，當(dāng)解鏈曲線表現(xiàn)出單一的、一致的解鏈溫度時，有時在熒光強度的負(fù)導(dǎo)數(shù)相對溫度(-dF/dt相對T)的圖上繪圖性表示為一個峰，那么將擴增產(chǎn)物分類為“純的”。例如，在來自單叢擴增的這樣的解離曲線中出現(xiàn)多個峰典型地表明存在不需要的副反應(yīng)產(chǎn)物。當(dāng)應(yīng)用這樣的基于核酸染料的擴增產(chǎn)物檢測技術(shù)時，通常理想地:1)至少減少并且優(yōu)選地消除不需要的副反應(yīng)產(chǎn)物的形成，和2)至少減少并且優(yōu)選地消除由其它核酸，即非擴增產(chǎn)物的雙鏈片段的變性導(dǎo)致的熒光峰。除此之外，由于引物、連接探針、裂解探針、啟動子-引物等的非特異性退火，以及隨后在亞最佳溫度的酶活，某些其它擴增技術(shù)也可以產(chǎn)生不需要的擴增產(chǎn)物。例如，盡管反應(yīng)成分通常是室溫下結(jié)合，或者盡管反應(yīng)組合物被加熱到需要的反應(yīng)溫度。這些技術(shù)中至少有一些可以受益于背景熒光的減少。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于擴增靶核酸同時減少非特異性熒光和不需要的擴增產(chǎn)物的組合物、方法和試劑盒，所述不需要的擴增產(chǎn)物在本領(lǐng)域中有時叫作次級擴增子或假性副產(chǎn)物。本發(fā)明公開了包括核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。所述公開的抑制劑設(shè)計成抑制酶的至少一種酶活性。在某些實施方案中，所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。在一些實施方案中，酶抑制劑包括能夠形成至少一個雙鏈片段的適體(參見，例如，Yakimovich 等,Biochem.(Mosc.)(生物化學(xué)(莫斯科))68(2):228-35(2003) ;Nickens 等,RNA9:1029-33(2003) ;Nishikawa 等，Oligonucleotides (寡核苷酸)14:114-29(2004);和Umehara等，J.Biochem.(生物化學(xué)雜志)137:339-74 (2005))。在一些實施方案中，酶抑制劑包括多樣的不同的猝滅劑。在某些實施方案中，所述酶抑制劑可以呈現(xiàn)出一種構(gòu)象，所述構(gòu)象在第一溫度包括至少一個雙鏈片段，但是當(dāng)加熱到第二溫度時，是單鏈的或基本上單鏈的。按照某些實施方案，包括至少一個雙鏈片段的酶抑制劑可以與下列各項中的至少一種形成復(fù)合體=DNA聚合酶 ，包括但不限于反轉(zhuǎn)錄酶；RNA聚合酶；裂解酶，包括但不限于，結(jié)構(gòu)-特異的核酸酶；解旋酶；和連接酶。在某些實施方案中，酶抑制劑是相對應(yīng)的酶的無效底物，原因在于所述抑制劑包括封閉基團、核苷酸類似物、不可裂解的核苷酸間連接或它們的組合。本發(fā)明公開了包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑。一些DNA聚合酶抑制劑包括兩種或多種猝滅劑，其可以是相同的猝滅劑或不同的猝滅劑。在某些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結(jié)合物，其在一些實施方案中包括猝滅劑。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列的3’-端不能被DNA聚合酶延伸，這典型地是由于封閉基團或非延伸核苷酸的存在。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括能夠形成至少一個雙鏈片段的適體(參見,例如,Yakimovich等,Biochem.(Mosc.)(生物化學(xué)(莫斯科))68(2):228-35(2003))。本發(fā)明提供包含酶和酶抑制劑的復(fù)合物。某些復(fù)合物包含:DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑；連接酶和連接酶抑制劑；RNA聚合酶和RNA聚合酶抑制劑；裂解酶和裂解酶抑制劑；或解旋酶和解旋酶抑制劑。某些復(fù)合物還包含脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，核苷酸類似物，輔助蛋白，例如但不限于單鏈結(jié)合蛋白(SSB)或增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，或它們的組合。典型地，所述酶-酶抑制劑復(fù)合物可以在第一溫度形成，并且當(dāng)與在所述復(fù)合物中的抑制劑締合時，所述酶的至少一種催化活性被抑制。當(dāng)將所述復(fù)合物加熱到第二溫度時，所述復(fù)合物解離，釋放所述酶。在某些實施方案中，酶-酶抑制劑復(fù)合物包括DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑。在某些實施方案中，DNA聚合酶-DNA聚合酶抑制劑復(fù)合物還包括核苷酸三磷酸(NTP)和/或核苷酸類似物。某些復(fù)合物實施方案包括與DNA聚合酶締合的以莖-環(huán)構(gòu)象存在的DNA聚合酶抑制劑，并且任選地，NTP和/或核苷酸類似物。某些復(fù)合物實施方案包括與DNA聚合酶抑制劑締合的DNA聚合酶，并且任選地，NTP和/或核苷酸類似物，所述DNA聚合酶抑制劑包括退火形成包含至少一個雙鏈片段的雙鏈體的至少兩個寡核苷酸。典型地，當(dāng)它與本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑，并且任選地，NTP和/或核苷酸類似物復(fù)合時，所述DNA聚合酶的DNA合成活性被抑制。本發(fā)明公開減少非特異性熒光的方法，其包括本發(fā)明的酶抑制劑。按照某些方法，在適合形成酶-酶抑制劑復(fù)合物的條件下，將酶與酶抑制劑接觸。當(dāng)所述酶存在于所述復(fù)合物中時，所述酶的至少一種酶促活性被抑制。當(dāng)將所述酶-酶抑制劑復(fù)合物加熱到適當(dāng)?shù)牡诙囟葧r，所述復(fù)合物解離，將所述酶釋放。一些減少非特異性熒光的方法包括本發(fā)明的DNA聚合酶抑制劑。按照某些這樣的方法，反應(yīng)組合物在第一溫度形成，其包括:DNA聚合酶，包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，NTP和/或核苷酸類似物，靶核酸，引物和核酸染料。在某些實施方案中，所述引物包括引物對。在第一溫度，所述DNA聚合酶抑制劑包括至少一個雙鏈片段，并且可以與所述DNA聚合酶形成復(fù)合物。DNA聚合酶抑制劑的猝滅劑可以吸收與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的至少一些熒光信號。將所述反應(yīng)組合物加熱到第二反應(yīng)溫度，所述第二反應(yīng)溫度典型地接近、處于或者高于所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度，這引起至少一些所述DNA聚 合酶抑制劑-DNA聚合酶復(fù)合物的解離。將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個擴增循環(huán)，并且產(chǎn)生擴增子的多樣性。由于與所述擴增子締合的核酸染料的熒光，在“實時”或在擴增反應(yīng)完成后，可以檢測到雙鏈擴增子，但是與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光至少被猝滅劑減少。本發(fā)明還公開了擴增靶核酸的方法，其使用本發(fā)明的酶抑制劑。按照某些這樣的方法，反應(yīng)組合物在第一溫度形成，其包括:DNA聚合酶，包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，NTP，靶核酸，引物，和核酸染料。在某些實施方案中，所述引物包括引物對。在第一溫度，所述DNA聚合酶抑制劑包含至少一個雙鏈片段，并且可以與DNA聚合酶形成形成復(fù)合物。所述DNA聚合酶抑制劑的猝滅劑可以吸收由與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料發(fā)射的至少一些熒光。將所述反應(yīng)組合物加熱到第二反應(yīng)溫度，所述第二反應(yīng)溫度典型地接近、處于或者高于所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度，這引起至少一些所述DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶復(fù)合物的解離。將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個擴增循環(huán)，并且產(chǎn)生擴增子的多樣性。在某些實施方案中，由于在所述反應(yīng)組合物中存在DNA聚合酶抑制劑，所產(chǎn)生的擴增子的量增加。按照某些方法，反應(yīng)組合物包括靶核酸，酶，酶抑制劑，核酸染料和下列各項中的至少一種:NTP，核苷酸類似物，引物，連接探針對，裂解探針對，啟動子-引物，輔因子，例如但不限于包含NAD+的物質(zhì)，和輔助蛋白，其包括但不限于PCNA和/或SSB。按照某些方法，將連接酶與連接酶抑制劑接觸，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成連接酶-連接酶抑制劑復(fù)合物。按照某些方法，將裂解酶與裂解酶抑制劑接觸，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成裂解酶-裂解酶抑制劑復(fù)合物。按照某些方法，將解旋酶與解旋酶抑制劑接觸，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成解旋酶-解旋酶抑制劑復(fù)合物。按照一些方法，將RNA聚合酶與RNA聚合酶抑制劑接觸，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成RNA聚合酶-RNA聚合酶抑制劑復(fù)合物。本發(fā)明還公開用于進(jìn)行某些本發(fā)明方法的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包括包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。在某些實施方案中，試劑盒包括兩種或多種不同的酶抑制劑。在一些實施方案中，酶抑制劑可以與RNA聚合酶、解旋酶、裂解酶或連接酶形成復(fù)合物。某些試劑盒實施方案還包括裂解探針組、連接探針組、引物、啟動子-引物或它們的組合。某些試劑盒實施方案包括包含核苷酸序列和猝滅劑的至少一種DNA聚合酶抑制齊U。在一些實施方案中，試劑盒包括兩種或多種DNA聚合酶抑制劑。在某些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑包括小溝結(jié)合物。某些試劑盒實施方案還包括下列各項中的至少一種:引物，引物對，核酸染料，DNA聚合酶，和報道探針。在一些實施方案中，試劑盒包括DNA-依賴型DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。在本文中描述了本發(fā)明的這些和其它特征。附圖 熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解下文所述的附圖只是舉例說明的目的。這些附圖并不意欲以任何方式限制本發(fā)明的范圍。凰丄^示意性描述包含單一寡核苷酸的某些代表性酶抑制劑的示例實施方案。示意性描述包含多樣性寡核苷酸的某些代表性酶抑制劑的示例實施方案。描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線，其作為熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)(-dF/dt)相對于溫度。C繪圖。描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線，其作為熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)相對于溫度。C繪圖。描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線，其作為熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)相對于溫度。C繪圖。描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線，其作為熒光的負(fù)導(dǎo)數(shù)相對于溫度。C繪圖。描述瓊脂糖凝膠的照片。將包含在不同濃度的代表性酶抑制劑中產(chǎn)生的擴增子的系列熱循環(huán)反應(yīng)組合物的等分試樣在非變性瓊脂糖凝膠的分開泳道中進(jìn)行電泳，并且用溴化乙錠顯現(xiàn)，如在實施例2中所述。泳道A和J:大小梯度，包括1200堿基對，800堿基對，400堿基對，200堿基對，和100堿基對大小標(biāo)準(zhǔn)物；泳道B-G:分別為包含5，10，25，50，75或IOOnM DNA聚合酶抑制劑E的熱循環(huán)反應(yīng)組合物的等分試樣；泳道H:包含50nMDNA聚合酶抑制劑E的無模板對照反應(yīng)組合物；泳道1:空白。描述瓊脂糖凝膠的照片。將包含在不同濃度的代表性DNA聚合酶抑制劑中產(chǎn)生的擴增子的系列熱循環(huán)反應(yīng)組合物的等分試樣在非變性瓊脂糖凝膠的分開泳道中進(jìn)行電泳，并且用溴化乙錠顯現(xiàn)，如在實施例3中所述。泳道A和J:大小梯度，包括1200堿基對，800堿基對，400堿基對，200堿基對，和100堿基對大小標(biāo)準(zhǔn)物；泳道B-H:分別為包含0,5,10，25，50，75或IOOnM DNA聚合酶抑制劑E的熱循環(huán)反應(yīng)組合物的等分試樣；泳道1:包含50nM DNA聚合酶抑制劑E的無模板對照反應(yīng)組合物。描述非變性瓊脂糖凝膠的照片，表現(xiàn)出由干存在代表性的DNA聚合酶抑制劑而導(dǎo)致的次級擴增子的減少，如在實施例4中所述。

圖10:描述按照本發(fā)明的代表性方法產(chǎn)生的代表性解離曲線，如在實施例5中所述。示例性實施方案的描述應(yīng)該理解，前文的概括描述和下述詳細(xì)描述都只是示例性的和解釋性的，并不是意欲限制本發(fā)明的范圍。當(dāng)用于本說明書中時，詞語“a(—個)”或“an(—種)”意指至少一個，除非特別另外闡明。在本說明書中，單數(shù)的應(yīng)用包括復(fù)數(shù)，除非特別另外闡明。例如但不是作為限制，“一種靶核酸”意指可存在不止一種靶核酸；例如，一個或多個拷貝的特別的靶核酸種類，以及兩種或多種不同種類的靶核酸。此外，使用“comprise (包括)”，“comprises (包括)”, “comprising (包括)”, “contain (含有)”, “contains (含有)”，“containing (含有)，，,“ include (包含)，，,“ includes (包含)”,和“ including (包含)，，并不意欲限制。術(shù)語“和/或”意指前和后的術(shù)語可以一起或分開采用。出于舉例說明的目的，而不是作為限制，“X和/或Y”可以意指“X”或“Y”或者“X和Y”。本文所用的部分標(biāo)題只是出于組織的目的，并不是解釋為以任何方式限制所述的主題。在本說明書中引用的所有文獻(xiàn)，包括但不限于專利、專利申請、論文、書和論述都通過引用完全清楚地結(jié)合用于任何目的。在任何所結(jié)合的文獻(xiàn)與本說明書中定義的任何術(shù)語相抵觸的事件中，由本說明書控制。盡管本發(fā)明與許多實施方案結(jié)合進(jìn)行描述，但是并不傾向于本發(fā)明應(yīng)該被所述的實施方案所限制。相反，本發(fā)明包括各種備選方案、修改和等價物，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的。John ff.Brandis 的美國專利申請系列號 10/762, 222,題目為 “CompetitiveKinetic Nucleic Acid DN A polymerase inhibitors (競爭性動力學(xué)核酸 DNA 聚合酶抑制齊U)”，其與2004年I月11日提交，通過引用完全清楚地結(jié)合于此用于任何目的。一些定義當(dāng)參考從核酸染料發(fā)射的熒光信號應(yīng)用時，術(shù)語“吸收至少一些”是指由于酶抑制劑的一種或多種猝滅劑的存在而導(dǎo)致的可檢測的熒光的減少。吸收由與酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料發(fā)射的熒光中的至少一些，意指相對于在除了所述酶抑制劑不包括猝滅劑之外包括相同的成分的反應(yīng)組合物中的可檢測的熒光，在所述核酸染料特有的發(fā)射波長處的可檢測的熒光中存在可測量的減少。在一些實施方案中，在可檢測的熒光中的可測量的減少意指在熒光中的 30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，97 %，98 %，99 % 或大于99 %的相對減少。在某些實施方案中，其中所述至少一種猝滅劑包括熒光猝滅劑，在所述核酸染料特有的波長處的可檢測的熒光中可存在可測量的減少，并且在所述酶抑制劑的至少一種熒光猝滅劑的特征發(fā)射波長處的可檢測的熒光中可存在可測量的減少。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“擴增子”和“擴增產(chǎn)物”通常是指擴增反應(yīng)的產(chǎn)物。擴增子可以是雙鏈的或單鏈的，并且可以包括通過將雙鏈的擴增產(chǎn)物變性而獲得的分開的組成鏈。在一些實施方案中，擴增子包括連接產(chǎn)物(例如但不限于連接的探針)，連接產(chǎn)物的至少部分的補體，或二者。在某些實施方案中，一個擴增循環(huán)的擴增子可以作為后續(xù)擴增循環(huán)的模板。
術(shù)語“退火(annealing) ”和“雜交(hybridizing) ”,包括但不限于源單詞雜交(hybridize)和退火(anneal)的變化,是可以互換地使用的，并且意指一種核酸與另一種核酸的核苷酸堿基-配對的相互作用，其導(dǎo)致形成雙鏈體、三鏈體或其它更高級的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一些實施方案中，退火或雜交是指在相同的酶抑制劑的至少兩個區(qū)域中的至少一些核苷酸之間的相互作用，以形成發(fā)夾或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，有時稱為自我退火。一級相互作用典型地是核苷酸堿基特異性的，例如，A:T, A:U，和G:C，通過沃森-克里克和Hoogsteen-型氫鍵作用。在某些實施方案中，堿基-堆積和疏水相互作用還可以有助于雙鏈體穩(wěn)定性。引物和探針退火成為互補序列的條件是本領(lǐng)域公知的，例如，如在Nucleic AcidHybridization, A Practical Approach (核酸雜交，實用方法)，Hames 和 Higgins,編，IRL出版，Washington, D.C.(1985)和 Wetmur 和 Davidson, Mol.Biol.(分子生物學(xué))31:349,1968中所述。通常，這樣的退火是否發(fā)生特別受下列各項的影響:某些酶抑制劑的相對應(yīng)的第一和第三區(qū)域和/或第四和第六區(qū)域的互補部分的長度，引物與它們在靶旁側(cè)序列和/或擴增子中的相對應(yīng)的結(jié)合位點的互補部分的長度，裂解探針或連接探針和靶核酸或擴增子的相對應(yīng)的結(jié)合部分的互補部分的長度，或者報道探針與其結(jié)合位點的相對應(yīng)的互補部分的長度；pH ;溫度；單價和二價陽離子的存在；在雜交區(qū)域的G和C核苷酸的比例；介質(zhì)的粘度；以及變性劑的存在。這樣的變量影響雜交所需要的時間。在某些酶抑制劑實施方案中，在所述抑制劑、探針和/或引物中存在特定的核苷酸類似物或小溝結(jié)合物還可以影響雜交條件。因此，優(yōu)選的退火條件將取決于具體的應(yīng)用。然而，這樣的反應(yīng)條件可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常規(guī)確定，無需過度實驗。優(yōu)選地，選擇退火條件，以在第二反應(yīng)溫度允許所述引物和/或探針選擇性地與反應(yīng)組合物中相對應(yīng)的靶旁側(cè)序列或擴增子中的互補序列雜交，而不以任何顯著的程度與反應(yīng)組合物中的不同的靶核酸或非靶序列雜交。術(shù)語“選擇性雜交”及其變化意指，在適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件下，給定的序列(例如但不限于引物)與包含核苷酸的互補片段(string)(例如但不限于，靶旁側(cè)序列或擴增子的引物-結(jié)合位點)的第二種序列退火，但是不與不需要的序列如非靶核酸、探針或其它引物退火。典型地，當(dāng)反應(yīng)溫度升高到特別的雙鏈序列的解鏈溫度時，選擇性雜交的相對量通常增力口，并且錯位引發(fā)(mispriming)通常減少。在本說明書中，一種序列與另一種序列雜交或選擇性雜交的敘述包括兩種所述序列完全彼此雜交或選擇性雜交的情形，以及只有所述序列中的一種或兩種的部分與完 整的另一種序列或其它序列的部分雜交或選擇性雜交的情形。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“嚴(yán)格性”用來定義在將形成包括兩個互補核苷酸序列的雜合體的雜交和后續(xù)處理步驟中存在的溫度和溶劑組成。嚴(yán)格性還定義同源性的量，需要的條件，和在兩種核苷酸序列之間形成的雜合體的穩(wěn)定性。當(dāng)嚴(yán)格性條件升高時，對選擇性雜交是有利的，并且對非特異性交叉雜交是不利的。相對于更低的嚴(yán)格性條件，其中更可能發(fā)生錯誤的引發(fā)，包括但不限于，連接探針和/或裂解探針的錯誤退火，增加的嚴(yán)格性條件典型地對應(yīng)更高的溫育溫度，更低的鹽濃度，和/或更高的pH。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員理解，能夠使得引物或引物對、連接探針對和/或裂解探針對與相對應(yīng)的靶旁側(cè)序列和/或擴增子選擇性雜交的適當(dāng)?shù)膰?yán)格性條件可以使用已知的技術(shù)無需不必要的實驗而常規(guī)確定(參見，例如，PCR:The Basics from background to bench(PCR:從后臺到工作臺的基礎(chǔ))，McPherson 和 Moller, Bios Scientific Publishers (生物科學(xué)出版社)(2000 ；以下為 “McPherson” ))。在本說明書中，一種核酸序列與另一種核苷酸序列相同或基本上相同的敘述包括兩種核苷酸序列與另一種序列完全相同或者基本上相同的情形，以及所述核苷酸序列中的一種只有部分與完整的另一種序列的部分相同或基本上相同的情形。同樣地，一種核酸序列與另一種核苷酸序列互補或基本上互補的敘述包括兩種核苷酸序列彼此完全互補或基本上互補的情形，以及所述序列中的一種只有部分與完整的另一種序列的部分互補或基本上互補的情形。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“適體”是指DNA或RNA寡核苷酸，其:1)使用體外選擇方法，例如但不限于“通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands byexponential enrichment) (SELEX) ”方法或其變化,典型地首先得到鑒定,并且2)以高特異性、構(gòu)象-依賴性方式識別并且結(jié)合配偶體，例如但不限于酶。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“或它們的組合”是指在先術(shù)語所列條目的所有排列和組合。例如，“A，B，C或它們的組合”意欲包括下述的至少一種:A，B，C，AB, AC，BC,或ABC，并且如果在特別的情形中順序是重要的，還包括BA，CA，CB,ACB, CBA, BCA, BAC,或CAB。繼續(xù)使用這一實例，清楚地包括包含一個或多個條目或項目的重復(fù)，諸如BB，AAA, AAB, BBC, AAABCCCC,CBBAAA, CABABB等的組合。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，典型地，在任何組合中對條目或項目的數(shù)目沒有限制，除非另外從上下文中顯而易見。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“互補(complementary) ”和“互補性(complementarity) ”參考通過堿基-配對法則而相關(guān)的至少兩種核酸而應(yīng)用。例如但不限于，序列“A-C-T”與序列“T-G-A”互補。互補可以是部分的，在這種情形中只有一些核苷酸按照堿基-配對法則而匹配。或者，在核酸之間可以存在完全的或全部的互補性。核酸鏈之間的互補性的程度對所述核酸鏈之間的雜交的效率和強度有顯著的影響。對于穩(wěn)定的雙鏈體的形成，互補性不必是全部的，即，穩(wěn)定的雙鏈體可以包含錯配的堿基對或不匹配的堿基。根據(jù)經(jīng)驗考慮許多變量，包括但不限于，核酸的長度、堿基組成和核酸的序列、離子強度和錯配堿基對的發(fā)生率，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定雙鏈體的穩(wěn)定性。核酸雙鏈體的穩(wěn)定性典型地通過其解鏈溫度而測量。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“復(fù)合物”和“酶抑制劑-酶復(fù)合物”是指在本發(fā)明的酶抑制劑和相對應(yīng)的酶之間的締合。在一些實施方案中，酶抑制劑-酶復(fù)合物包括DNA聚合酶，RNA聚合酶,連接酶,裂解酶,或解旋酶。術(shù)語抑制(inhibit),抑制(inhibits)或其變化，當(dāng)參考酶應(yīng)用時，是相對的術(shù)語，并且是指與所述酶在相同的擴增條件但是不存在酶抑制劑時的活性相比，酶活性的可測量的減少。在某些實施方案中，當(dāng)與酶抑制劑復(fù)合時，通過在存在和不存在酶抑制劑的平行的擴增反應(yīng)中產(chǎn)生的需要的擴增子的量而確定，所述酶的酶活性減少約40%，約50%，約60%，約70%，約80%，約85%，約90%，約95%，約96%，約97 %，約98 %，約99 %，或大于99 %。在某些實施方案中，當(dāng)所述復(fù)合物還包含輔助蛋白、NTP、核苷酸類似物、包含NAD+的物質(zhì)、或它們的組合時，獲得最佳抑制。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“相對應(yīng)”是指在所述術(shù)語涉及的要素之間的至少一種具體的關(guān)系。出于舉例說明的目的而不是作為限制，特定引物對的至少一種正向引物對應(yīng)同一引物對的至少一種反向引物；將至少一種引物設(shè)計成與相對應(yīng)的靶核酸的旁側(cè)區(qū)域和/或至少一種相對應(yīng)的擴增子的引物 -結(jié)合部分退火；連接探針組的第一探針與靶核酸和/或連接位點上游、以及典型地鄰近連接位點的擴增子退火，并且相對應(yīng)的第二連接探針與靶核酸和/或連接位點的下游、以及典型地鄰近連接位點的擴增子退火；在特定的酶抑制劑實施方案中，第一寡核苷酸與相對應(yīng)的第二寡核苷酸退火，形成包含至少一個雙鏈片段的雙鏈體；等等。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“使變性(denaturing) ”和“變性(denaturation) ”是指這樣的任何過程，其中適當(dāng)?shù)貙㈦p鏈多核苷酸轉(zhuǎn)化成兩個單鏈多核苷酸或者單鏈的或基本上單鏈的多核苷酸，所述雙鏈多核苷酸包括但不限于，包括至少一種靶核酸的gDNA片段，雙鏈擴增子，或包括至少一個雙鏈片段的多核苷酸，例如但不限于在第一溫度的酶抑制劑。使雙鏈多核苷酸或酶抑制劑的雙鏈片段變性包括但不限于，各種熱和化學(xué)技術(shù)，其使得雙鏈核酸或酶抑制劑的雙鏈片段成為單鏈的或基本上單鏈的，例如但不限于，釋放雙鏈多核苷酸或者包含兩個寡核苷酸的雙鏈體的兩個個體單鏈成分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，所用的變性技術(shù)通常沒有限制，除非它顯著妨礙后續(xù)的擴增反應(yīng)的退火或酶促步驟，或者在某些方法中，干擾熒光信號的檢測。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“雙鏈的”是指沿著至少它們的長度的部分雜交的一個或兩個核酸鏈。因此，在某些情形中，“雙鏈的”可以指這樣的單一寡核苷酸的部分，即，其可以折疊，以致所述寡核苷酸的第一區(qū)域的至少一個片段與同一寡核苷酸的第三區(qū)域的至少一個片段雜交，所述寡核苷酸的第四區(qū)域的至少一個片段與所述寡核苷酸的第六區(qū)域的至少一個片段雜交，或者二者，由此形成一個或多個雙鏈片段和一個或多個單鏈的部分。因此，單一的核酸鏈可以形成具有雙鏈和單鏈片段的發(fā)夾或莖-環(huán)構(gòu)象(參見，例如，圖1)。類似地，兩個互補的寡核苷酸可以彼此雜交，以形成雙鏈體(參見，例如，圖2)。因此，“雙鏈的”并不意味著核酸必須是完全雙鏈的。相反，雙鏈的核酸可以具有一個或多個單鏈片段和一個或多個雙鏈片段。術(shù)語“第一溫度”是指可以形成酶-酶抑制劑復(fù)合物的溫度，通常是溫度范圍。術(shù)語“第二溫度”是指酶-酶抑制劑復(fù)合物解離或不形成的溫度，通常是溫度范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，第二溫度典型地處于或者接近所述酶抑制劑的Tm，而第一溫度典型地低于所述酶抑 制劑的Tm，以允許所述酶抑制劑呈現(xiàn)包括至少一個雙鏈片段的構(gòu)象。一種示例性的第一溫度可以是環(huán)境溫度或“室溫”。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“Tm”參考解鏈溫度應(yīng)用。解鏈溫度是大量的雙鏈核酸分子半解離成單鏈的溫度。“微觀流體裝置”是一種反應(yīng)容器，其包括至少一個微通道，所述微通道通常包括I毫米或更小的內(nèi)部尺寸。微觀流體裝置典型地應(yīng)用非常小的反應(yīng)體積，通常在一個或幾個微升(UL)、毫微升(nanoliter)或兆分之一升(picoliter)的數(shù)量級。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，微觀流體裝置的大小、形成和組成通常不限于本發(fā)明。相反，可以應(yīng)用任何適當(dāng)?shù)奈⒂^流體裝置進(jìn)行所公開的方法的一個或多個步驟。除其它地方之外，示例性的微觀流體裝置及其應(yīng)用的描述可以特別見于在Fiorini和Chiu, BioTechniques (生物技術(shù))38:429-46(2005) ；Kelly 和 Woolley, Analyt.Chem.(分析化學(xué))77(5):96A_102A(2005)；Cheuk-Wai Kan 等，Electrophoresis (電泳)25:3564-88 (2004);和 Yeun 等，Genome Res.(基因組研究)11:405-12 (2001)。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“小溝結(jié)合物”是指匹配雙鏈DNA中的小溝的小分子，有時以序列特異的方式匹配。通常，小溝結(jié)合物是長的、平的分子，其可以采用月牙樣的形狀，并且因此貼切地匹配到雙螺旋的小溝中，通常替代水。小溝結(jié)合分子典型地包括通過具有扭轉(zhuǎn)自由度的鍵連接的一些芳香環(huán)，例如但不限于，呋喃、苯或吡咯環(huán)。“錯誤引發(fā)”或“錯誤引發(fā)的”，當(dāng)用于本文時，是指引物或探針與非靶核酸的雜交。如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，引物(不包括隨機引物)通常設(shè)計成與側(cè)連靶核酸的選擇序列雜交或與擴增子的引物-結(jié)合位點雜交，并且設(shè)計成引導(dǎo)DNA合成或在所述位點的引物延伸起始。當(dāng)引物或探針與非靶核酸雜交，這通常在低或減少的嚴(yán)格性條件下發(fā)生，并且然后作為引物從所述非靶位點延伸的起始點時，可以發(fā)生錯誤-引發(fā)，產(chǎn)生某些不需要的次級擴增產(chǎn)物的合成。連接探針對和裂解探針對還可以與非靶核酸錯誤退火，這通常在低或減少的嚴(yán)格性條件下發(fā)生，這還可以導(dǎo)致不需要的擴增產(chǎn)物的形成。術(shù)語“不可延伸的核苷酸”，當(dāng)用于本文時，是指基本上沒有其它核苷酸可以通過聚合酶添加到其上的核苷酸。在一些實施方案中，所述不可延伸的核苷酸是不具有與另一個核苷酸形成磷酸二酯連接的最適官能團的核苷酸類似物。在某些實施方案中，所述不可延伸的核苷酸是本質(zhì)上不允許引物延伸的鏈-終止核苷酸，例如二脫氧核苷酸(ddNs)，諸如ddA，ddC，ddG，ddl，ddT，和ddU。在一些實施方案中，聚合酶可以將其它核苷酸連接到不可延伸的核苷酸上，但是以緩慢的速率進(jìn)行。術(shù)語“非特異性的”或“背景”，當(dāng)參考熒光應(yīng)用時，是指從與雙鏈核酸締合的核酸染料分子而不是需要的擴增子發(fā)射的可檢測的信號。需要的擴增子包括靶核酸的擴增產(chǎn)物，在一些實施方案中包括內(nèi)標(biāo)或?qū)φ招蛄校鰞?nèi)標(biāo)或?qū)φ招蛄锌梢园诒景l(fā)明的特定反應(yīng)組合物中，特別用于標(biāo)準(zhǔn)化和/或定量目的。因此，由核酸染料分子與假的、次級擴增子的締合產(chǎn)生的熒光信號是非特異性熒光的一個來源，所述假的、次級擴增子通常是錯誤引發(fā)、錯誤連接和/或引物二聚體形成的結(jié)果。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，當(dāng)本發(fā)明的酶抑制劑在第一溫度包括核酸染料分子可以締合的至少一種雙鏈片段時，所述抑制劑的猝滅劑部分可以吸收來自 締合的核酸染料，背景的次級來源的可檢測的熒光信號中的至少一些，由此減少所述反應(yīng)組合物的非特異性熒光。術(shù)語“核苷酸堿基”，有時叫作含氮堿基或氮雜環(huán)堿基，是指可以作為核苷酸成分的取代的或未取代的一個或多個芳香環(huán)。在某些實施方案中，所述一個或多個芳香環(huán)包含氮原子。在某些實施方案中，所述核苷酸堿基能夠與互補的核苷酸堿基形成沃森-克里克或Hoogsteen-型氫鍵。示例性的核苷酸堿基及其類似物包括天然存在的核苷酸堿基:腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5甲基胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，以及天然存在的核苷酸堿基的類似物，其包括7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、N6- A 2-異戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6- A 2-異戊烯基_2_甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、N2_ 二甲基鳥嘌呤(dmG)、7_甲基鳥嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6- 二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、2-硫嘧啶、6-硫鳥嘌呤、4-硫胸腺嘧啶、4-硫尿嘧啶、O6-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧啶、吡唑并[3，4-D]嘧啶(參見，例如，美國專利號6，143，877和6，127，121和PCT公布申請WO 01/38584)、亞乙烯腺嘌呤、吲哚如硝基吲哚和4-甲基吲哚，和吡咯如硝基吡咯。例如，核苷酸堿基的非限制性實例可以在Fasman,Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology(生物化學(xué)和分子生物學(xué)實踐手冊)，第385-394頁，CRC出版社，Boca Raton,Fla.(1989)及其中引用的參考文獻(xiàn)中找到。術(shù)語“核苷酸”，當(dāng)用于本文時，是指核苷的磷酸酯，例如，三磷酸酯，其中最常見的酯化位點是附著在戊糖C-5位置的羥基。術(shù)語“核苷酸”還通常用來指一組包括核苷和核苷酸的化合物，除非另外從上下文顯而易見。術(shù)語“核苷”，當(dāng)用于本文時，是指包括連接到糖如核糖、阿拉伯糖、木糖、和吡喃糖以及它們的糖類似物的c-r碳上的核苷酸堿基的化合物。所述糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖糖包括，但不限于，其中的一個或多個碳原子，例如，2 ’ -碳原子，被一個或多個相同的或不同的，-R, -OR, -NR2疊氮化物，氰化物或鹵素基團取代的那些核糖，其中每個R獨立地是H，C1-C6烷基，C2-C7酰基，或C5-C14芳基。示例性的核糖包括，但不限于，2’ -(C1-C6)烷氧基核糖，2’ -(C5-C14)芳氧基核糖，2’，3’ - 二脫氫核糖，2’ -脫氧-3’ -齒核糖，2’ -脫氧-3’ -氟核糖，2’ -脫氧-3’ -氯核糖，2’ -脫氧_3’ -氨基核糖，2’ -脫氧-3’ - (C1-C6)燒基核糖，2’ -脫氧-3’ - (C1-C6)燒氧基核糖和2’ -脫氧-3’ - (C5-C14)芳氧基核糖，核糖，2’ -脫氧核糖，2’，3’ -雙脫氧核糖，2’ -齒核糖，2’ -氟核糖，2’ -氯核糖，和2’ -烷基核糖，例如，2’ -0-甲基，4’ -a-異頭核苷酸，I’ -a-異頭核苷酸，2’ -4’ -和3’ -4’ -連接的以及其它“鎖定的(locked)”或“LNA”，二環(huán)糖修飾(參見，例如，PC T公布申請?zhí)朩O 98/22489，WO 98/39352，和WO 99/14226 ;和Braasch 和 Corey，Chem.Biol.(化學(xué)生物)8:1_7，2001 ;和美國專利號 6，268，490)。“LNA”或“鎖定核酸”是這樣的核苷酸類似物，即，其構(gòu)象被鎖定，以致所述核糖環(huán)受到例如但不限于2’ -氧和3’ -或4’ -碳或具有2’ -5’主鏈的3’ -4’ LNA之間的亞甲基連接的限制(參見，例如，Imanishi和Obika,美國專利號6, 268, 490 ;和Wengel和Nielsen,美國專利號6，670，461)。由所述連接施加的構(gòu)象限制通常提高互補序列的結(jié)合親和性，并且提高這樣的雙鏈體的熱穩(wěn)定性。在多核苷酸內(nèi)的示例性LNA糖類似物包括下述結(jié)構(gòu):
權(quán)利要求
1.一種酶抑制劑，所述酶抑制劑包含核苷酸序列和至少兩種不同的猝滅劑，其中所述核苷酸序列包含至少一個雙鏈片段。
2.一種包含酶和權(quán)利要求1的酶抑制劑的復(fù)合物。
3.權(quán)利要求2的復(fù)合物，其中所述酶包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，連接酶，解旋酶，裂解酶，或它們的組合。
4.權(quán)利要求3的復(fù)合物，其中所述酶是聚合酶并且所述酶抑制劑是聚合酶抑制劑。
5.權(quán)利要求4的復(fù)合物，所述復(fù)合物還包含NTP，核苷酸類似物，或NTP和核苷酸類似物。
6.權(quán)利要求5的復(fù)合物，其中所述聚合酶抑制劑不可通過所述聚合酶延伸。
7.權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中所述聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。
8.權(quán)利要求1或2的酶抑制劑或復(fù)合物，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包含核苷酸類似物。
9.權(quán)利要求1或2的酶抑制劑或復(fù)合物，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包含第一區(qū)域、第二區(qū)域、第三區(qū)域和任選第四區(qū)域；并且其中所述第一區(qū)域與所述第三區(qū)域互補。
10.權(quán)利要求9的酶抑制劑或復(fù)合物，其中所述第一區(qū)域、所述第三區(qū)域或所述第一區(qū)域和第三區(qū)域包含至少一個核苷酸類似物；并且其中所述第一區(qū)域包含第一猝滅劑而所述第二區(qū)域包含第二猝滅劑，并且任選地，所述第一猝滅劑和第二猝滅劑是不同的。
11.權(quán)利要求1或2的酶抑制劑或復(fù)合物，其還包括小溝結(jié)合物。
12.權(quán)利要求8的酶抑制劑或復(fù)合物，其中所述核苷酸類似物包括脫氮-dA、脫氮-dG、ddN、PNA, LNA或它們的組合。
13.權(quán)利要求1或2的酶抑制劑或復(fù)合物，其中所述核苷酸序列包括5’-TCTGGGATA(脫氮-dA) TT (脫氮-dA) TGGTA (脫氮-dA) ATATG (Tn) C (脫氮-dA) TATTTATT (脫氮-dA) TA (脫氮-dA) TTATC-3’，并且其中所述 Tn 包括 TT、ITT、TTTT, TTTTT 或 TmTT。
14.權(quán)利要求11的酶抑制劑或復(fù)合物，其中所述第一猝滅劑包括DABCYL、DABSYL、TAMRA, TET和ROX中的至少一種；并且所述小溝結(jié)合物還包括第二猝滅劑。
15.一種減少非特異性熒光的方法，該方法包括: (a)在第一溫度，形成包含權(quán)利要求1的酶抑制劑、酶、靶核酸、引物和核酸染料的反應(yīng)組合物，其中所述酶抑制劑和所述酶締合形成復(fù)合物，并且其中所述至少兩種不同的猝滅劑抑制與所述酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光； (b)將所述反應(yīng)組合物加熱到第二溫度，以使所述復(fù)合物解離； (c)將所述反應(yīng)組合物進(jìn)行至少一個擴增循環(huán)，以產(chǎn)生多種擴增子；和 (d)在反應(yīng)組合物中檢測與所述多種擴增子締合的核酸染料的熒光，其中所述猝滅劑抑制與所述酶抑制劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的熒光。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于擴增靶核酸同時減少非特異性熒光和不需要的擴增產(chǎn)物，有時叫作次級擴增產(chǎn)物或假的副產(chǎn)物，的組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明公開的酶抑制劑包括核苷酸序列和至少一種猝滅劑。本發(fā)明還提供包括與酶締合的酶抑制劑的復(fù)合物，其中所述酶的至少一種酶促活性被抑制。本發(fā)明公開了用于擴增靶核酸同時減少不需要的擴增產(chǎn)物的方法，其是減少非特異性熒光的方法。本發(fā)明還提供了迅速進(jìn)行某些公開的方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/48GK103215248SQ20131007645
公開日2013年7月24日 申請日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月3日
發(fā)明者董守連, 瓊科·史蒂文斯, 丹尼·H·李 申請人:應(yīng)用生物系統(tǒng)有限責(zé)任公司