專利名稱：一種檢測活細胞內環二鳥苷酸含量的報告系統及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種檢測活細胞內環二鳥苷酸含量的報告系統及其應用。
背景技術：
環二鳥苷酸(cyclicbis (3，_5’)diguanylic acid, c-d1-GMP)是細菌體內普遍存在的第二信使分子，參與調節細菌的多種生理功能，尤其在細菌生物膜形成和致病因子產生中起著至關重要的調節 作用。細菌生物膜是細菌為抵抗外界不良環境，通過自身產生的胞外多糖等多聚物相互粘連形成的附著在細菌群落表面的膜狀物。細菌生物膜可以用于進行水質凈化，在維持生態環境特別是水生環境平衡中也占據重要位置，并且能夠促進有機物與無機物的相互轉化。細菌生物膜對人們的生產生活也具有一定的危害，如細菌生物膜對抗生素和宿主免疫防御機制的抗性很強，從而導致嚴重的臨床問題，尤其是慢性和難治的感染性疾病；細菌生物膜可污染與人類生活相關的設施，如空調系統、供水系統、食品加工設備，甚至醫療用具等，由此造成傳染病的流行；除健康問題外，細菌生物膜還可在工業、運輸、軍事等諸多領域給人類社會帶來嚴重危害，造成巨大經濟損失，比如固著在船舶底部造成行進阻力增大、腐蝕金屬，堵塞管道等。研究表明，細胞內c-d1-GMP作為一個重要信號分子，控制著大量分泌蛋白或細胞表面相關蛋白基因的表達，細胞內高水平的c-d1-GMP導致細胞從浮游的、運動的生活方式向固定的、生物被膜相關的生活方式轉變，從而易于形成細菌生物膜。c-d1-GMP通過與核糖開關(riboswitch)結合,從而達到對基因表達的精細調節。核糖開關被定義為一類位于mRNA3’ -或5’ -非翻譯區上，能夠結合小分子代謝物以調控基因的轉錄和翻譯的mRNA順式作用元件，多數核糖開關都可以分成2個結構域:適體結構域(aptamer domain, AD)和表達結構域(expression domain, EPD) AD 是一個高度折疊的結構，能選擇性地與特定的代謝產物結合。AD形成高度折疊的二級或者三級結構，選擇性地與靶代謝物結合，自身的構象發生變化，導致下游EPD的RNA折疊變化，形成選擇性的莖環結構，直接調節基因的表達。目前已證實多個與c-d1-GMP特異性結合的riboswitch,c-d1-GMP的兩個堿基G與核糖開關的特異位點的堿基C形成Watson-Crick配對,從而實現對下游基因表達的調節。不同濃度的c-d1-GMP通過對核糖體開關的調節，使信號級聯放大，對細胞的狀態產生重大影響。如何檢測出細胞內c-d1-GMP的含量顯得很重要，現有技術中還沒有一種方法能用于對活細胞中的c-d1-GMP進行檢測。

發明內容
本發明提供了一種檢測活細胞內環二鳥苷酸含量的報告系統，利用該報告系統能對活細胞中c-d1-GMP含量進行檢測。一種檢測活細胞內環二鳥苷酸含量的報告系統，該報告系統由依次連接的啟動子、核糖開關、SD序列和報告基因組成。啟動子-核糖開關-SD序列組成基因表達調控序列，核糖開關主要依據其表達結構域的構象變化，在轉錄和翻譯兩個水平上調節報告基因的表達。就轉錄水平調控而言，核糖開關的適體結構域特異結合細胞內的c-d1-GMP，促使表達結構域中形成轉錄終止子，導致RNA聚合酶從poly U末端脫落，轉錄終止；G+菌的核糖開關傾向于利用此機制。就翻譯水平調控而言，核糖開關的適體結構域特異結合細胞內的c-d1-GMP，形成特定的二級結構妨礙核糖體識別SD序列，從而阻斷翻譯起始；G—菌的核糖開關傾向于利用此機制。最終，通過檢測報告基因編碼的蛋白的表達量，即可獲得細胞內c-d1-GMP含量。組成基因表達調控序列的三個片段(啟動子、核糖開關、SD序列)可分別經擴增得到再融合到同一序列上，也可從同時包含有這三個片段(即含有啟動子-核糖開關-SD序列)的基因組中經一次擴增得到。在一個具體實施方式
中，所述的基因表達調控序列即是經一次擴增從shewanellaoneidensis的基因組得到的。所述的啟動子為shewanella oneidensis中S0-1072基因(GenBank號為NP_716 699)的強啟動子區域，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。核糖開關(在該基因組中的位置為1112520-1112568)的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。SD序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。所述的報告基因可選用Lac Z基因、熒光素酶基因或熒光蛋白基因；優選為Lac Z基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。Lac Z基因編碼P半乳糖苷酶，以鄰硝基苯-3-D半乳吡喃糖苷(ONPG)為底物，利用比色法即可檢測酶活性，操作簡便，且檢測動力學范圍可達六個數量級。利用c-d1-GMP的結構類似物c-d1-AMP分析發現，本發明的報告系統對c-d1-GMP具有極高的特異性，c-d1-AMP的加入對檢測結果無影響。本發明還提供了含有所述報告系統的重組載體或表達系統。所述重組載體的原始載體可選用pHGROl或pHGR03。本發明還提供了所述的報告系統在檢測活細胞內環二鳥苷酸含量中的應用，包括:將所述的報告系統轉入待測細胞，將重組細胞置于培養液中培養，至培養液0D_值為0.4-0.6，測定重組細胞中報告基因的表達量，根據以下公式計算待測細胞內環二鳥苷酸的含量:環二鳥苷酸含量=_10721n(miller unit-CK)+793.35 ;其中，miller unit為重組細胞中報告基因的表達量；CK為待測細胞中報告基因的本底水平表達量。報告基因(以Lac Z基因為例)的表達量的測定方法為:將V1體積的0D_值為0.4-0.6的重組細胞培養液離心，去上清；加入V2體積的裂解液，裂解完成后，對細胞裂解液離心、取V3體積的上清與V4體積的ONPG反應；反應完成后，測定反應液的OD42。值；即miller unit的計算公式為:miller unit= (1000XOD420) / (TXVXOD600)；其中
權利要求
1.一種檢測活細胞內環二鳥苷酸含量的報告系統，其特征在于，該報告系統由依次連接的啟動子、核糖開關、SD序列和報告基因組成。
2.如權利要求1所述的報告系統，其特征在于，所述的啟動子為S0-1072基因的強啟動子區域，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如權利要求1所述的報告系統，其特征在于，核糖開關的核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.如權利要求1所述的報告系統，其特征在于，所述的報告基因為LacZ基因、熒光素酶基因或熒光蛋白基因。
5.如權利要求4所述的報告系統，其特征在于，所述的報告基因為LacZ基因。
6.含有如權利要求1 5任一所述的報告系統的重組載體。
7.含有如權利要求1 5任一所述的報告系統的表達系統。
8.如權利要求1 5任一所述的報告系統在檢測活細胞內環二鳥苷酸含量中的應用，包括: 將所述的報告系統轉入待測細胞，將重組細胞置于培養液中培養，至培養液OD6tltl值為·0.4-0.6，測定重組細胞中報告基因的表達量，根據以下公式計算待測細胞內環二鳥苷酸的含量: 環二鳥苷酸含量=_10721n (miller unit-CK) +793.35 ； 其中，miller unit為重組細胞中報告基因的表達量；CK為待測細胞中報告基因的本底水平表達量。
全文摘要
本發明公開了一種檢測活細胞內環二鳥苷酸含量的報告系統及其應用。該報告系統由依次連接的啟動子、核糖開關、SD序列和報告基因組成。所述的應用包括將所述的報告系統轉入待測細胞，將重組細胞置于培養液中培養，至培養液OD600值為0.4-0.6，測定重組細胞中報告基因的表達量，根據以下公式計算待測細胞內環二鳥苷酸的含量環二鳥苷酸含量=-1072ln(miller unit-CK)+793.35；其中，miller unit為重組細胞中報告基因的表達量；CK為待測細胞中報告基因的本底水平表達量。利用本發明報告系統能方便地對活細胞內的c-di-GMP含量進行檢測，操作方法簡便易行，檢測結果真實可信。
文檔編號C12Q1/02GK103173547SQ201310078510
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月12日 優先權日2013年3月12日
發明者高海春, 張海燕 申請人:浙江大學