專利名稱：用于檢測火雞出血性腸炎病毒的lamp引物的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業生物技術領域，特別涉及一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒(HEV)的 LAMP 引物。
背景技術：
LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)技術是由 Notomi 等在 2000年發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法采用特異地識別靶序列上六個區域的四條引物(兩條外引物，兩條內引物)及具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在60 65°C進行核酸的指數級擴增，其擴增效率可達到IO9 IOltl個拷貝數量級；整個反應僅需50min，在擴增反應中副產物焦磷酸鎂沉淀與SYBR Green I或鈣黃綠素結合，產生黃綠色熒光，不需要借助其他儀器便可辨別實驗結果。LAMP技術具有簡便、快速、準確、廉價、易檢測等特點。目前，國內外尚未見采用LAMP引物檢測HEV的報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物。本發明的目的通過下述技術方案實現:一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物，其核苷酸序列如下所示:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATTGTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3，。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:(I)本發明以4條精確設計的引物嚴格識別靶核苷酸序列上的6個獨立區域，從而避免反應混合物中存在的非靶序列的影響，特異性高。(2)本發明的擴增模板量為100拷貝，比常規PCR檢測高I 2數量級，靈敏性比較聞。(3)本發明的LAMP不需通過溫度循環變化來擴增，免除變溫過程耗費的時間，使反應在30 60min就能將幾個拷貝的靶基因高效擴增，反應時間短。(4)本發明的設備簡單，不需凝膠成像系統，只需一臺普通水浴鍋或者濁度儀，且檢測結果可肉眼直接觀察，易于判定。


圖1是實施例1的火雞出血性腸炎病毒的LAMP濁度檢測結果。圖2是實施例1的火雞出血性腸炎病毒的LAMP可視化檢測結果；其中:A為SYBRgreen I的可視化檢測結果；B為鈣黃綠素可視化檢測結果；C為SYBR green I反應后在紫外燈下的熒光效應結果；代表陰性反應，“+”代表陽性反應。圖3是實施例2的酶切電泳鑒定LAMP反應產物的結果圖；其中:M為DNA分子質量標準DL2000的電泳鑒定結果圖；NC為陰性對照的電泳鑒定結果圖；1為HEV LAMP陽性擴增產物的電泳鑒定結果圖；2為HEV LAMP陽性擴增產物經Tsp45I酶切產物的電泳鑒定結果圖。圖4是實施例3的不同濃度的火雞出血性腸炎病毒的LAMP濁度檢測結果；其中:A為IO5拷貝/管的陽性質粒的LAMP濁度檢測結果；B為IO4拷貝/管的陽性質粒的LAMP濁度檢測結果；C為IO3拷貝/管的陽性質粒的LAMP濁度檢測結果；D為IO2拷貝/管的陽性質粒的LAMP濁度檢測結果。圖5是實施例3的不同濃度的火雞出血性腸炎病毒的LAMP在SYBR green I反應后于可見光下的熒光效應結果；其中:A為IO5拷貝/管的陽性質粒的LAMP在SYBR greenI反應后于可見光下的熒光效應結果；B為IO4拷貝/管的陽性質粒的LAMP在SYBR greenI反應后于可見光下的熒光效應結果；C為IO3拷貝/管的陽性質粒的LAMP在SYBR greenI反應后于可見光下的熒光效應結果；D為IO2拷貝/管的陽性質粒的LAMP在SYBR greenI反應后于可見光下的熒光效應結果；E為IO1拷貝/管的陽性質粒的LAMP在SYBR greenI反應后于可見光下的熒光效應結果；F為10°拷貝/管的陽性質粒的LAMP在SYBR greenI反應后于可見光下的熒光效應結果；G為陰性反應的LAMP在SYBR green I反應后于可見光下不出現熒光效應結果；H為陰性反應的LAMP在SYBR green I反應后于可見光下的不出現熒光效應結果。圖6是效果實施例的火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物濁度特異性檢測結果；其中:A為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對EDSV毒株DNA的濁度特異性檢測結果；B為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對IBDV毒株cDNA的濁度特異性檢測結果；C為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對ALV-J毒株cDNA的濁度特異性檢測結果；D為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對AIV毒株cDNA 的濁度特異性檢測結果；E為火雞出血性腸炎病毒的LAMP弓I物對ARV毒株cDNA的濁度特異性檢測結果；F為火雞出血性腸炎病毒的LAMP弓丨物對HEV毒株DNA的濁度特異性檢測結果。圖7是效果實施例的火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物熒光顯色特異性檢測結果；其中:A為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對EDSV毒株DNA在SYBR green I反應后于可見光下不出現熒光效應結果；B為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對IBDV毒株cDNA在SYBR green I反應后于可見光下不出現熒光效應結果；C為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對ALV-J毒株cDNA在SYBR green I反應后于可見光下不出現熒光效應結果；D為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對AIV毒株cDNA在SYBR green I反應后于可見光下不出現熒光效應結果；E為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對ARV毒株cDNA在SYBR green I反應后于可見光下不出現熒光效應結果；F為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對HEV毒株DNA在SYBR green I反應后于可見光下的熒光效應結果。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
實施例1(I)材料:Bst DNA 聚合酶(Bst DNA ploymerse large fragment, New EnglandBiolab公司);甜菜堿(Betaine, Sigma公司);病毒DNA提取試劑盒(OMEGA公司，D3892-01);電泳用SYBR Green I (Invitrogen公司)；|丐黃綠素(Calcein, Sigma公司)；三聯水浴鍋(溫度可達70°C即可)。(2)用于檢測火雞出血性腸炎病毒(HEV)的LAMP引物的制備:I)通過NCBI (美國國立生物信息中心)上已公布的HEV (Hemorrhagic EnteritisVirus)的Virginia Avirulent Strain (AY849321)的病毒全基因序列，與國外其他幾株(AC_000016, NC_001958, AF074946) HEV全基因序列進行同源性比較，確定火雞出血性腸炎病毒基因組的特異序列區，特異序列區為240bp ；2)特異序列在線提交 Primer Explorer (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)生成LAMP弓丨物，得到如下引物:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATTGTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3’ ；3)生成的LAMP引物(F3和B3，BIP和FIP)，送上海英俊生物技術有限公司合成；(3) LAMP反應體系:引物稀釋成25pmol/μ L ;25 μ L反應體系中，各成分的量如表I和表2 ；
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運用上述引物檢測火雞出血性腸炎病毒的方法，包括如下步驟:I)實驗條件參考 Notomi 等建立的 LAMP 方法(Notomi T, Okayama H, MasubuchiH, et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic AcidsRes.，2000，28(12):E63)加以改進，以制備的病毒DNA為模板，LAMP的反應體系25μ L，添加各組分的體積見表I和表2 ;反應在62°C水浴鍋中進行，反應時間為50min，反應結束后于85°C滅活8min ；2)反應結果的判定:A、實時濁度判定:用LA-320C濁度儀對LAMP副產物焦磷酸鎂的形成每6s進行實時監測，當濁度超過閾值(0.1)形成明顯擴增時判斷為陽性反應，否則為陰性反應；結果如圖1所示，陽性反應濁度在超過30分鐘時曲線呈明顯擴增狀態；B:反應前，在體系中加入SYBR green I或者鈣黃綠素，若反應為陽性，則可見光下反應管呈現黃綠色；若反應為陰性，則可見光下反應管呈現橘紅色；且陽性反應在紫外燈下會產生熒光效應。結果如圖2所示，A為體系中加入SYBR green I陽性反應在可見光下反應管呈現黃綠色，陰性反應在可見光下反應管呈現橘紅色；B為體系中加入鈣黃綠素(Calcein)陽性反應在可見光下反應管呈現黃綠色，陰性反應在可見光下反應管呈現橘紅色；C為加入SYBR green I陽性反應在紫外燈下會產生熒光效應，而陰性反應管則無熒光效應。表I環介導等溫擴增技術反應體系I
權利要求
1.一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物，其特征在于核苷酸序列如下所示:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATT·GTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3’。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物。該LAMP引物由一對外圍引物和一對內引物組成，其核苷酸序列如SEQ NO.1～4所示。該引物特異性強，能嚴格識別靶核苷酸序列上的6個獨立區域，從而避免反應混合物中存在的非靶序列的影響；擴增模板量低至10拷貝，靈敏性高。本發明的LAMP不需通過溫度循環變化來擴增，反應在30～60min就能將幾個拷貝的靶基因高效擴增，反應時間短；而且設備簡單，檢測結果可肉眼直接觀察，易于判定。
文檔編號C12Q1/70GK103243173SQ20131007906
公開日2013年8月14日 申請日期2013年3月12日 優先權日2013年3月12日
發明者曹偉勝, 劉雪美, 廖明, 徐成剛 申請人:華南農業大學