專利名稱：氯化鎂在提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性上的應(yīng)用的制作方法
氯化鎂在提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性上的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥領(lǐng)域，具體涉及氯化鎂在提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性上的應(yīng)用；以及利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法；此外還涉及一種芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是土壤中一類比較重要的生防微生物群體，能夠防治多種植物病害(何禮遠(yuǎn).生物防治通報(bào)，1985，1(3):28-31 ；Yu G Y等，SoilBiology and Biochemistry.2002，34:955-963)。芽孢是芽孢桿菌在發(fā)酵后期產(chǎn)生的一類抗逆性較強(qiáng)的休眠體(沈萍等，微生物學(xué)，高等教育出版社.2006，55-60)，常被作為有效成分制作成微生物農(nóng)藥，但是相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥，以芽孢為有效成分的微生物農(nóng)藥貨架期相對(duì)較短，而芽孢的耐熱能力是影響其貨架期的主要因素之一。
芽孢的耐熱性能除了受相關(guān)基因的控制外，外界環(huán)境中金屬離子、溫度、酸堿度等均能影響芽孢的形 成與性能，其中金屬離子Ca2+、Mn2+、Fe2+對(duì)芽孢的耐熱性能有不同程度的提高效果(Granger A C等.Applied and EnvironmentalMicrobiology.2011，77(1):32-40)。因此，提高枯草芽孢桿菌芽孢的耐熱性是延長(zhǎng)相應(yīng)的微生物農(nóng)藥貨架期的有效途徑之一。發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)枯草芽孢桿菌微生物農(nóng)藥貨架期短的問題，本發(fā)明目的在于提供氯化鎂在提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性上的應(yīng)用。
本發(fā)明另一目的在于提供利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法。
本發(fā)明第三目的在于提供一種芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑。
本發(fā)明第四目的在于提供上述芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法。
本發(fā)明的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
氯化鎂在提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性上的應(yīng)用。
本發(fā)明利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法，包括向枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)前的發(fā)酵培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液中添加MgCl2，攪拌均勻。
上述利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法，按照每IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨0.1% 0.2%，NaN03l% 2%, K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余為水。
上述利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法，按照每IOOmL發(fā)酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵液中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的總菌數(shù)為1.0X IO9 1.0X IOltl個(gè)/mL，其中芽孢約占枯草芽孢桿菌總菌數(shù)的90%。
所述的枯草芽孢桿菌是指以芽孢作為微生物農(nóng)藥有效成分的枯草芽孢桿菌；如BAB-K2007年7月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.2099)ο
上述利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法中，其所述的發(fā)酵液按照如下方法制備:
(I)菌種活化
將低溫保存的枯草芽孢桿菌菌種在LB培養(yǎng)基固體平板上劃線，然后在28V 32°C下培養(yǎng)20 24小時(shí)，得活化菌種；
(2)種子液制備
按照將一接種環(huán)活化菌種接種于IOOmL種子液培養(yǎng)基的比例將活化菌種接種于種子液培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 15h，得種子液；
(3)發(fā)酵液制備
按照體積百分比為3% 5%的比例將步驟(2)所得的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、pH7.0 7.5、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)40 50h，得發(fā)酵液。
上述利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法中所述的LB培養(yǎng)基、種子液培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基按照常規(guī)方法制備。
上述利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法中所述的LB培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:酵母膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.2%，其余為水。
上述利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法中所述的種子液培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，其余為水。
上述利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨0.1% 0.2%，NaN03l% 2%, K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余為水。
本發(fā)明一種芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑，按照如下方法制備:向枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)前的發(fā)酵培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液中添加MgCl2，攪拌均勻。
上述枯草芽孢桿菌菌劑,按照每IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g 0.3gMgCl2的比例向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉 3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%, NaNO31% 2%, K2HPO40.2% 0.4%,MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余為水。
上述枯草芽孢桿菌菌劑，按照每IOOmL發(fā)酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵液中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的總菌數(shù)為1.0X IO9 1.0X 101°個(gè)/mL，其中芽孢約占枯草芽孢桿菌總菌數(shù)的90%。
所述的枯草芽孢桿菌是指以芽孢作為微生物農(nóng)藥有效成分的枯草芽孢桿菌；如BAB-K2007年7月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.2099)ο
上述枯草芽孢桿菌菌劑中所述的發(fā)酵液，按照如下方法制備:
(I)菌種活化
將低溫保存的枯草芽孢桿菌菌種在LB培養(yǎng)基固體平板中劃線，然后在28 32°C下培養(yǎng)20 24小時(shí),得活化菌種；
(2)種子液制備
按照一接種環(huán)活化菌種接種于IOOmL種子液培養(yǎng)基的比例將活化菌種接種于種子液培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 15h，得種子液；
(3)發(fā)酵液制備
按照體積百分比為3% 5%的比例將步驟(2)所得的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、pH7.0 7.5、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)40 50h，得發(fā)酵液。
所述的枯草芽孢桿菌可以是BAB-1 (2007年7月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.2099)。
上述枯草芽孢桿菌菌劑中所述的LB培養(yǎng)基、種子液培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基按照常規(guī)方法制備。
上述枯草芽孢桿菌菌劑中所述的LB培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:酵母膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.2%，其余為水。
上述枯草芽孢 桿菌菌劑中所述的種子液培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，其余為水。
上述枯草芽孢桿菌菌劑中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉 3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%, NaNO31% 2%, K2HPO40.2% 0.4%,MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余為水。
上述芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括向枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)前的發(fā)酵培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液中添加MgCl2，攪拌均勻。
上述芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，按照每IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3 5%，蛋白胨0.1% 0.2%，NaN03l% 2%, K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余為水。
上述芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，按照每IOOmL發(fā)酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵液中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的總菌數(shù)為1.0X IO9 1.0X IOltl個(gè)/mL，其中芽孢約占枯草芽孢桿菌總菌數(shù)的90%。
上述制備方法中所述的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，按照如下方法制備:
(I)菌種活化:將低溫保存的枯草芽孢桿菌菌種在LB培養(yǎng)基固體平板中劃線，然后在28°C 32°C下培養(yǎng)20 24小時(shí)，得活化菌種；
(2)種子液制備:按照將一接種環(huán)活化菌種接種于IOOmL種子液培養(yǎng)基的比例將活化的菌種接種于種子液培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 15h，得種子液；
(3)發(fā)酵液制備:按照體積百分比為3% 5%的比例將步驟(2)所得的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C 32。。、ρΗ7.0 7.5、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)40 50h，得發(fā)酵液。
上述制備方法中所述的LB培養(yǎng)基、種子液培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基按照常規(guī)方法制備。
本發(fā)明芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式可以制備成懸浮劑、可濕性粉劑、泡騰片劑、顆粒劑等農(nóng)藥劑型。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為:與現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌菌劑相比，本發(fā)明通過向發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCl2所得的枯草芽孢桿菌菌劑中，其芽孢耐熱能力顯著提高；本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌劑貨架期長(zhǎng)。


圖1.發(fā)酵液中添加MgCl2的枯草芽孢桿菌菌劑的貨架期曲線圖。
圖2.發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCl2的枯草芽孢桿菌菌劑的貨架期曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但是不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1增強(qiáng)枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的金屬離子篩選試驗(yàn)
(I)將保存在_80°C冰箱的枯草芽孢桿菌BAB-1菌種(2007年7月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為:CGMCCN0.2099)在LB培養(yǎng)基固體平板中劃線，將平板置于30°C培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24h，得活化菌種。
(2)用接種環(huán)挑取一環(huán)活化菌種接種于IOOmL種子液培養(yǎng)基(種子液培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為:葡萄糖5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水IOOOmL)中，在31°C、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)12h,得到種子液。
(3)按照體積百分比為4%的比例將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為:葡萄糖20g，可溶性淀粉40g，蛋白胨lg，NaNO3IOg, K2HP043g,MgSO4.7H201g, CaCO3Ig,水 IOOOmL)中，在 31°C、180r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 48h，得發(fā)酵液。
(4)取樣10mL，做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察芽孢形成情況，在芽孢形成率大于90%時(shí)，停止發(fā)酵；
(5)取5份相同體積的發(fā)酵液，按照0.2g/100mL的比例向發(fā)酵液中分別添加金屬離子:NaCl、CaCl2、MgCl2、MnS04、FeSO4,以不添加任何金屬離子的處理作為對(duì)照(CK)。
(6)將各處理發(fā)酵液置于54°C培養(yǎng)箱中靜置14d。
(7)將各處理發(fā)酵液取出，分別取ImL樣品，用無菌水以10倍濃度梯度稀釋，將發(fā)酵液稀釋至10'將LB培養(yǎng)皿分為四個(gè)區(qū)，每區(qū)點(diǎn)20yL稀釋液。培養(yǎng)皿置于35°C培養(yǎng)8h，計(jì)數(shù)每區(qū)菌落，以10-40個(gè)菌落濃度為宜，并計(jì)算出每mL發(fā)酵液中芽孢的數(shù)量，比較不同金屬離子處理的發(fā)酵液芽孢存活數(shù)量
芽孢數(shù)量=(A1+A2+A3+A4)/ 4X10nX50 (單位:f/mL)。
其中A1、A2、A3、A4為培養(yǎng)皿各區(qū)的菌落數(shù)，η為稀釋倍數(shù)。
(8)結(jié)果(見表I) 54°C處理7d后對(duì)照的芽孢數(shù)量為6.1XlO9, NaCl、CaCl2、MnSO4和 FeSO4 處理的芽孢數(shù)量分別為 6.0 X 109，5.5 X IO9,6.0 X IO9,6.2 X IO9,6.2 X 109，而 MgCl2處理的芽孢數(shù)量為8.4X 109，顯著高于對(duì)照和其他金屬離子處理的芽孢數(shù)量，說明NaCl，CaCl2, MnSO4和FeSO4對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性基本沒有影響，而MgCl2能夠顯著提高枯草芽孢桿菌芽孢的耐熱能力。
表I不同金屬離子對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢耐熱能力的影響的試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.氯化鎂在提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性上的應(yīng)用。
2.利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法，其特征在于向枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)前的發(fā)酵培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液中添加MgCl2，攪拌均勻。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于按照每IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨0.1% 0.2%, NaNO31% 2%，K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%,其余為水。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于按照每IOOmL發(fā)酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵液中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的總菌數(shù)為1.0X109 1.0X 101°個(gè)/mL，其中芽孢約占枯草芽孢桿菌總菌數(shù)的90%。
5.按照權(quán)利要求2或4所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵液按照如下方法制備: (1)、將低溫保存的枯草芽孢桿菌菌種在LB培養(yǎng)基固體平板上劃線，然后在28°C 32°C下培養(yǎng)20 24小時(shí)，得活化菌種； (2)、按照將一接種環(huán)活化菌種接種于IOOmL種子液培養(yǎng)基的比例將活化菌種接種于種子液培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 15h，得種子液； (3)、按照體積百分比為3% 5%的比例將步驟(2)所得的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、pH7.0 7.5、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)40 50h，得發(fā)酵液。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的LB培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:酵母膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.2%，其余為水；所述的種子液培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，其余為水；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%，NaNO31% 2%，K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余為水。
7.—種芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑，其特征在于按照如下方法制備:向枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)前的發(fā)酵培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液中添加MgCl2，攪拌均勻。
8.按照權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌菌劑，其特征在于按照每IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及質(zhì)量百分比為: 葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨0.1% 0.2%，NaN03l% 2%, K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余為水。
9.按照權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌菌劑，其特征在于按照每IOOmL發(fā)酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向發(fā)酵液中添加MgCl2 ;其中所述的發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的總菌數(shù)為1.0X IO9 1.0X IOltl個(gè)/mL，其中芽孢約占枯草芽孢桿菌總菌數(shù)的90%。
10.按照權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌菌劑，其特征在于所述的發(fā)酵液，按照如下方法制備: (1)、將低溫保存的枯草芽孢桿菌菌種在LB培養(yǎng)基固體平板中劃線，然后在28 32°C下培養(yǎng)20 24小時(shí),得活化菌種； (2)、按照一接種環(huán)活化菌種接種于IOOmL種子液培養(yǎng)基的比例將活化菌種接種于種子液培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 15h，得種子液；(3)、按照體積百分比為3% 5%的比例將步驟(2)所得的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C 32°C、 pH7.0 7.5、170 210r/min條件下振蕩培養(yǎng)40 50h，得發(fā)酵液。
全文摘要
本發(fā)明公開了氯化鎂在提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性上的應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥領(lǐng)域。本發(fā)明還公開了利用氯化鎂提高枯草芽孢桿菌芽孢耐熱性的方法，以及一種芽孢耐熱性強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌劑，主要是向枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)前的發(fā)酵培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液中添加MgCl2，添加比例為每100mL發(fā)酵培養(yǎng)基或發(fā)酵液中添加0.1g～0.3g MgCl2。本發(fā)明添加MgCl2所得的枯草芽孢桿菌菌劑中，其芽孢耐熱能力顯著提高；其次，本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌劑的貨架期長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N1/38GK103146634SQ20131007907
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者馬平, 李社增, 鹿秀云, 郭慶港, 張曉云 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所