專利名稱：一種耐熱酸性普魯蘭酶生產菌株及其篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種普魯蘭酶生產菌株及其應用，特別是一株產耐熱酸性普魯蘭酶的芽胞桿菌及其應用。
背景技術：
淀粉脫支酶(E.C.3.2.1.41)是一類能夠水解支鏈淀粉、α _極限糊精等分子中α -1, 6葡萄糖苷鍵的淀粉水解酶。淀粉脫支酶通常和其它淀粉酶復配用于生產葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產品。淀粉脫支酶可以切斷淀粉中的分支點，加速后續酶的反應，縮短反應時間，提高淀粉的轉化率，降低其它糖化用酶制劑的使用量，從而達到增加產量、提高設備利用率、降低生產成本的目的。近年來國內外學者把淀粉脫支酶的開發研究作為非常重要的研究主題。BunzoMikami等對來源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脫支酶蛋白晶體結構進行解析,發現該酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(β/α)8桶狀結構。近年來國外學者從極端嗜熱微生物中分離出具有可以耐受接近100°C高溫的淀粉脫支酶，但是這些酶往往只有在ρΗ6.0以上才具有較高的活性。我國對淀粉脫支酶的研究雖晚于國外，但也有30多年的歷史。早期工作主要圍繞菌株的篩選。·至上世紀90年代，我國市場上開始出售進口淀粉脫支酶，繼而引發了對淀粉脫支酶在淀粉加工中的應用研究，并逐步推廣到淀粉糖、釀造及其它發酵行業，帶動了相關產業的技術提升。至2000年前后隨著我國淀粉加工行業的快速發展，對淀粉脫支酶的需求激增，淀粉脫支酶生產菌株的開發逐漸升溫。目前，我國科研人員先后在Bacillus、Thermotoga等微生物中篩選到一些性能優良的酶種，并開展了野生菌的誘變育種、酶的重組表達及發酵條件優化。朱夢等從海洋中分離出一株產普魯蘭酶不動桿菌，通過產酶條件優化，酶活達到2.3U/mL,該酶最適反應溫度和pH分別為50°C和8.2。張明炎等將來源于地衣芽孢桿菌的淀粉脫支酶編碼基因克隆大腸桿菌中進行表達，搖瓶發酵產酶最高達到6.5U/mL。蘇喆等實現了來源于Thermotoga maritima的淀粉脫支酶編碼基因在枯草芽孢桿菌中的成功表達,該酶最適溫度90°C，最適pH6.0，發酵酶活可達89.lU/mL。綜上所述，除了少數報道外，大多數微生物來源的普魯蘭酶在低pH、高溫條件下的酶活力水平一般不高。然而，淀粉加工過程通常在酸性高溫條件下進行，因此有必要篩選產新的耐熱酸性普魯蘭酶的生產菌株，以提高其在淀粉加工中應用效果。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種耐熱酸性普魯蘭酶生產菌株，于2013年I月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號CCTCC N0:M2013012，系從面粉廠土壤中分離得到的一株芽胞桿菌 WSH10-03 (Bacillus.Sp WSH10-03)。芽胞桿菌的篩選方法是從面粉廠土壤中經紅色普魯蘭平板篩選，挑取產生透明圈菌落進行搖瓶培養，經酶活測定，比較普魯蘭酶活力大小而得到。
酶活力測定方法:分別取Iml的底物(0.5%普魯蘭溶液)和0.9ml0.1M pH4.5的醋酸緩沖液于試管中，60°C水浴鍋預熱IOmin左右。加入0.1ml適當稀釋的酶液樣品，震蕩混勻，反應體系總體積為2ml，反應30min (準確計時)，加入3ml DNS混勻、并立刻放入冰水中終止反應,之后沸水浴7min，冰水中冷卻。上述反應體系中加入IOml的蒸餾水，混勻。在540nm下測量其吸光值。本發明解決的另一個技術問題是提供一種采用芽胞桿菌WSH10-03為出發菌株，經種子培養和搖瓶發酵制得普魯蘭酶。種子培養基(g/L)及培養條件:蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH5.0 ;培養條件為:搖床轉速200轉/分，培養時間為10小時，培養溫度37°C。 發酵培養基(g/L)及發酵條件:發酵培養基成分為(g/L):氯化銨1，十二水磷酸氫二鈉2.7，磷酸二氫鉀0.3，蛋白胨10，酵母粉3，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，可溶性淀粉10，pH5.0。發酵條件為:37°C，搖床轉速200轉/分，發酵時間56小時。本發明提供了一種耐熱酸性普魯蘭酶生產菌，用該菌株經搖瓶發酵可制備普魯蘭酶，該酶的最適溫度55°C,最適pH4.2。
具體實施例方式實施案例I菌株的篩選從3家面粉廠附近分別采集土樣5份，共15份樣品。分別稱取少量樣品，放入烘箱60°C熱處理30min，然后·稱取樣品Ig加入裝有50mL無菌水的小三角瓶中，靜置20min，取0.1mL上清液梯度稀釋(10_4，10_5，10_6)涂布于紅色普魯蘭篩選平板上，37°C培養箱中培養2天，觀察菌落周圍透明圈形成情況，挑選透明圈直徑與菌落直徑之比較大的單菌落進行初篩。首先，將上述單菌落進行平板劃線分類純化，并接種斜面保存備用。然后接種到發酵培養基中進行液體振蕩培養。培養溫度為37°C，搖床轉速為200rpm，培養時間為56h。培養液經過12000rpm離心5min，收集上清液，在酸性條件下進行酶活測定。選取酶活高的菌株進行劃線傳代培養，最終得到一株產酶穩定且有較高酶活的普魯蘭酶產生菌株。純化的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養基上，4°C保藏，于2013年I月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號CCTCC N0:M2013012，系從面粉廠土壤中分離得到的一株芽胞桿菌 WSH10-03 (Bacillus.Sp WSH10-03)。紅色普魯蘭篩選平板成分(g/L):氯化銨I，十二水磷酸氫二鈉2.7，磷酸二氫鉀0.3，酵母粉3，蛋白胨10，六水氯化鎂0.2，紅色普魯蘭2，瓊脂粉20，pH5.0,培養溫度為
37。。。發酵培養基成分為(g/L):氯化銨1，十二水磷酸氫二鈉2.7，磷酸二氫鉀0.3，蛋白胨10，酵母粉3，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，可溶性淀粉10，PH5.0。發酵條件為:37°C，搖床轉速200轉/分，發酵時間56小時。實施案例2發酵產酶從斜面上刮取一環菌種，置于裝有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，在37°C，200rpm條件下振蕩培養10h。以2.5%接種量接入裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中進行發酵培養。條件為培養時間56h，溫度37°C，搖床轉速200rpm。經過活力測定，胞外酶活為 21.7U/mL。種子培養基(g/L)及培養條件:蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH5.0 ;培養條件為:搖床轉速200轉/分，培養時間為10小時，培養溫度37°C。發酵培養基成分為(g/L):氯化銨1，十二水磷酸氫二鈉2.7，磷酸二氫鉀0.3，蛋白胨10，酵母粉3，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，可溶性淀粉10，pH5.0。發酵條件為:37°C，搖床轉速200轉/分，發酵時間56小時。實施例3:普魯蘭酶的純化和酶學性質將發酵上清液于4°C, 12000rpm離心5min除去細胞。向上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4°C, 12000rpm離心20min,取沉淀物用適量pH4.5, 20mM磷酸-朽1檬酸緩沖液溶解，通過0.4 μ m膜過濾后制成上樣樣品。經過DEAE-Sepharose陰離子交換樹脂純化后得到電泳純的普魯蘭酶。將純化普魯蘭酶以普魯蘭多糖多糖為底物進行酶學性質測定。結果表明改普魯蘭酶的最適溫度為55°C ,最適pH4.2,在60°C條件下半衰期可達20h。
權利要求
1.一種耐熱酸性普魯蘭酶生產菌株，分類命名為芽胞桿菌(Bacillus. Sp)WSH10-03，于2013年I月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號CCTCC N0:M2013012。
2.一種篩選權利要求I所述普魯蘭酶生產菌株的方法，其特征是從面粉廠土壤中經紅色普魯蘭平板菌落特征初篩，挑取其中透明圈較大的菌株進行搖瓶發酵，測定胞外普魯蘭酶活力，根據發酵產酶活力的大小而篩選得到普魯蘭酶生產菌株。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述紅色普魯蘭篩選平板成分為(g/L):氯化銨1，十二水磷酸氫二鈉2. 7,磷酸二氫鉀O. 3,酵母粉3,蛋白胨10,六水氯化鎂O. 2,紅色普魯蘭2，瓊脂粉20，pH5. O。
4.應用權利要求I所述普魯蘭酶生產菌株生產普魯蘭酶的方法，其特征是采用芽胞桿菌WSH10-03為出發菌株，經種子培養和搖瓶發酵制得普魯蘭酶；所述種子培養條件為37°C，搖床轉速200轉/分，培養時間為10小時；所述搖瓶發酵條件為37°C，搖床轉速200轉/分，發酵時間56小時。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征是所述種子培養中，種子培養基成分為(g/L)蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH5. O。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征是所述搖瓶發酵中，發酵培養基成分為(g/L)氯化銨I，十二水磷酸氫二鈉2. 7，磷酸二氫鉀O. 3，蛋白胨10，酵母粉3，七水硫酸鎂O. 3，無水氯化鈣O. 2，可溶性淀粉10，pH5. O。
7.根據權利要求4-6任一所述的方法，其特征在于所述芽胞桿菌WSH10-03在發酵工業和淀粉糖生產中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種耐熱酸性普魯蘭酶生產菌株，分類命名為芽胞桿菌(Bacillus.Sp)WSH10-03，于2013年1月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號CCTCC NO:M2013012。是從面粉廠土壤中經過在紅色普魯蘭平板上具有菌落透明圈初篩，采用搖瓶復篩，測定酶活力，比較普魯蘭酶活性大小而得到。該酶的酶學性質為最適溫度55℃，最適pH4.2，該酶的在60℃半衰期為20小時。該普魯蘭酶可以用于發酵工業和淀粉糖生產中淀粉中分支鏈的脫支反應。
文檔編號C12N9/44GK103255079SQ20131007933
公開日2013年8月21日 申請日期2013年3月13日 優先權日2013年3月13日
發明者吳敬, 段緒果, 吳丹, 陳晟, 陳堅 申請人:江南大學