新的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)及其應(yīng)用，短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001，序列如SEQ?ID?NO.:1所示，用于制備(a)用于遺傳關(guān)系分析的試劑或試劑盒；(b)用于個(gè)體識別的試劑或試劑盒；(c)用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒；(d)用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或(e)用于檢測骨髓移植后受體中的白細(xì)胞是否被供體細(xì)胞取代的試劑盒。短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001區(qū)分度高，能夠有效地分析遺傳關(guān)系。
【專利說明】新的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]短串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandem Repeat.STR),又稱微衛(wèi)星 DNA (microsatelliteDNA)，是一類重復(fù)單位2-6bp，重復(fù)次數(shù)10-60，片段長度在400bp以下的DNA串聯(lián)重復(fù)序列；其產(chǎn)生原因是DNA復(fù)制過程中滑動(dòng)，或在復(fù)制和修復(fù)時(shí)滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位的缺失或插入。STR具有在基因組中分布廣泛、等位基因多、雜合度高、分型結(jié)果穩(wěn)定，STR遺傳符合孟得爾遺傳定律(Koreth, J.，et al.1996.Microsatellitesand PCR ge-nomic analysis.J.Pathol.178:239-248.)等特點(diǎn)，并且多個(gè) STR 基因座聯(lián)合檢測時(shí)，個(gè)體識別力和非父排除率高。因而STR以其遺傳多態(tài)性等特征，已被作為第二代遺傳標(biāo)記廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)個(gè)體識別、人類遺傳圖譜繪制、親子鑒定、法醫(yī)物證檢驗(yàn)等領(lǐng)域，有效地推動(dòng)了法醫(yī)鑒定學(xué)從以往物證樣本的個(gè)體排除向個(gè)體識別全面轉(zhuǎn)換。
[0003]目前，個(gè)體識別的技術(shù)主要采用STR-PCR檢測，對多個(gè)STR基因座聯(lián)合分型，以確定未權(quán)關(guān)系或個(gè)體識別等，在實(shí)驗(yàn)方法都相對成熟，但在STR基因座的選擇上，沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)外生產(chǎn)商提供的檢測試劑盒中所用的位點(diǎn)不盡相同。早期歐美選用10個(gè)STR基因座加 I 個(gè)性別決定基因(E.A.Cotton, R.F.Allsop, J.F.Guest, R.R.E.Frazier, P.Koumi, 1.P.Callow, A.Seager, R.L.Sparkes, Validat1n of the AmpFISTR"SGM Plus? systemfor use in forensic casework, Forensic Sc1.1nt.112 (2000) 151 - 161.)。后來隨著技術(shù)發(fā)展、數(shù)據(jù)庫增多 ，比對信息難度加大，STR基因座的選擇也在不斷改進(jìn)。現(xiàn)在比較有影響力的數(shù)據(jù)庫CODIS (Combined DNA Index System)是由美國FBI基于13個(gè)STR基因座(D3S1358,vWA,D16S539,D5S818,D7S820,CSF1P0,D13S317,TP0X,D8S1179,D21S11,D18S51，THOI, FGA.)構(gòu)建，因而現(xiàn)在大多數(shù)STR檢測試劑盒生產(chǎn)商也在這13個(gè)核心基因座的基礎(chǔ)上增加或刪減一些位點(diǎn)以提高檢測效率及準(zhǔn)確率(D.J.French, R.L.Howard, N.Gale, T.Brown, D.G.McDowell, P.G.Debenhan, Interrogat1n of short tandem repeats usingfluorescent probes and melting curve analysis:A step towards rapid DNA identityscreening.Forensic Science.(2008) 333-339)。例如 Promega 公司的 PowerPlex*16System試劑盒包括了 13個(gè)核心基因座，并增加了 PentaD、PentaE和AMELO三個(gè)基因座；美國 ABI 公司的AmpF/STlT Identifiler* PCR Amplificat1n Kit 則是 13 個(gè)核心基因座加上D2S1338、D19S433和AMELO ;其公司的另外兩款試劑盒AmpFlSTifSGM Plus? PCRAmplificat1n Kit 和 AmpFlSTR* Sinofiler"' PCR Amplificat1n Kit 也做了相應(yīng)基因座位點(diǎn)的增減。國內(nèi)生產(chǎn)類似檢測試劑盒的單位也有很多，例如公安部二所推廣的DNATyperTM15，中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司的AG⑶EX22 STR熒光檢測試劑盒，所檢測基因座增至22個(gè)。
[0004]以上試劑盒選擇的STR基因座的優(yōu)點(diǎn)在于，以13個(gè)得到公認(rèn)的核心基因座為基礎(chǔ)，附加一些其它位點(diǎn)以豐富所檢測得到的信息量，能較全面的反應(yīng)出個(gè)體間的差異性，進(jìn)而完成個(gè)體識別、父權(quán)判定等工作。但是所用的這些基因座中并非都是最優(yōu)選擇，例如FGA基因座存在序列長度過長、重復(fù)單元多但跨度不連續(xù)，從而影響了與其它位點(diǎn)的兼容性，不利于與多個(gè)基因座聯(lián)合檢測的多重體系運(yùn)用；D19S433基因座則位于基因組中高度重復(fù)序列區(qū)，擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)存在較大麻煩，并且該位點(diǎn)的穩(wěn)定性不高，應(yīng)用于個(gè)體識別時(shí)所提供的可用信息質(zhì)量和區(qū)分度都不高；再如D21S11基因座除了存在位于基因組中高度重復(fù)序列區(qū)域的問題之外，還發(fā)現(xiàn)在該基因座所在區(qū)域中可能存在CNV(基因拷貝數(shù)變異的情況；在遇到基因拷貝數(shù)非正常的樣本檢測時(shí)，會(huì)降低該位點(diǎn)STR分型的準(zhǔn)確度，在個(gè)人識別中采用該基因座的效果也會(huì)大打折扣。隨著人類基因組圖譜的建立及測序技術(shù)的發(fā)展，以較低的成本，在較快的時(shí)間內(nèi)對個(gè)人全基因組重測序成為可能，進(jìn)而能在較大的信息量下篩選出區(qū)分度更高的STR基因座，推動(dòng)了應(yīng)用于個(gè)體識別等研究中的STR基因座的選擇與更新。
[0005]因此，為克服兼容性差、存在CNV或位于高度重復(fù)序列區(qū)域等缺陷，本領(lǐng)域尚需一種新型的具有高區(qū)分度的短串聯(lián)重復(fù)序列。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座，不存在CNV，且不位于高度重復(fù)序列區(qū)域，具有高區(qū)分度。
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001，序列如SEQID N0.:1 所示。
[0008]本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的核苷酸序列，所述核苷酸序列的結(jié)構(gòu)如下:
[0009]X1-X2-X3
[0010]式中，Xl為 SEQ ID N0.:2 中第 1-800 位；
[0011]X2為含有≥2個(gè)重復(fù)單元ttcc的遺傳多態(tài)區(qū)；
[0012]X3 為 SEQ ID N0.:2 中第 860-1660 位。
[0013]本發(fā)明的第三方面，提供第一方面所述的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001的用途，用于制備:
[0014](a)用于遺傳關(guān)系分析的試劑或試劑盒；
[0015](b)用于個(gè)體識別的試劑或試劑盒；
[0016](c)用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒；
[0017](d)用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或
[0018](e)用于檢測骨髓移植后受體中的白細(xì)胞是否被供體細(xì)胞取代的試劑盒。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括(i)引物或引物對；(ii)探針；(iii)核酸芯片。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的引物對的序列如SEQ ID N0.:3和SEQ ID N0.:4所示。
[0021]本發(fā)明的第四方面，提供一種特異性擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001的引物對，所述的引物對的序列如SEQ ID N0.:3和SEQ ID N0.:4所示。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001如第一方面所述。
[0023]本發(fā)明的第五方面，提供一種試劑盒，包括:
[0024](a)用于特異性擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001的引物對；
[0025](b)使用說明書。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001如第一方面所述。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括(C)特異性擴(kuò)增選自下組的一種或多種基因座的引物對:
[0028]D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSFlP0、D13S317、TP0X、D8S1179、D21Sll、D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
[0029]本發(fā)明的第六方面，提供一種擴(kuò)增體系，包括:
[0030](a)用于特異性擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001的引物對；和
[0031](b)任選的、特異性擴(kuò)增選自下組的一種或多種基因座的引物對:
[0032]D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSFlP0、D13S317、TP0X、D8S1179、D21Sll、D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMELO ；
[0033]并且所述引物對 (a)和任選的引物對(b)位于同一擴(kuò)增體系。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001如第一方面所述。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增體系為復(fù)合擴(kuò)增體系，其中，所述的引物對(b)包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16對特異性引物對；和 / 或
[0036]所述復(fù)合擴(kuò)增體系為熒光標(biāo)記的復(fù)合擴(kuò)增體系，其中，所述熒光標(biāo)記是指選用下組的一種或多種熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記所述基因座的引物:FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、ROX、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。
[0037]本發(fā)明的第七方面，提供一種擴(kuò)增方法，包括步驟:
[0038]在第六方面所述的擴(kuò)增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行基因座的擴(kuò)增，從而獲得基因座擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括:對所述基因座擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的步驟。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測選自下組:毛細(xì)管電泳、測序、雜交。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述待測樣品選自下組:血液、唾液、精液、汗液、羊水、骨骼、或毛發(fā)。
[0042]本發(fā)明的第八方面，提供一種遺傳關(guān)系分析方法，包括步驟:
[0043]在第六方面所述的擴(kuò)增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行基因座的擴(kuò)增，從而獲得基因座擴(kuò)增產(chǎn)物；和
[0044]其中，所述待檢測樣本包括分別來自不同個(gè)體的核酸樣本SI, S2,......,Si，式中i
為≥2的正整數(shù)；
[0045](2)對來自不同核酸樣本SI，S2,……，Si的基因座擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，從而獲得對應(yīng)于不同核酸樣本的檢測結(jié)果；
[0046](3)對步驟(2)獲得的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，從而確定不同個(gè)體之間的遺傳關(guān)系。
[0047]在另一優(yōu)選例中，所述遺傳關(guān)系分析包括個(gè)體識別分析、親子鑒定分析、血緣關(guān)系分析。
[0048]本發(fā)明提供了一種新型的STR基因座，不存在CNV，且不位于高度重復(fù)序列區(qū)域、雜合度高，分辨率高、兼容性高，能與已有的大多數(shù)位點(diǎn)在同一體系內(nèi)使用，能夠有效區(qū)分隨機(jī)人群的遺傳關(guān)系。
[0049]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1為父本多個(gè)STR位點(diǎn)的檢測峰圖；
[0051]圖2為母本多個(gè)STR位點(diǎn)的檢測峰圖；
[0052]圖3為子代多個(gè)STR位點(diǎn)的檢測峰圖；
[0053]圖4為無親緣關(guān)系樣本多個(gè)STR位點(diǎn)的檢測峰圖。

【具體實(shí)施方式】
[0054]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過大量篩選，首次篩選出一種新型的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001，含有> 2個(gè)重復(fù)單元ttcc的遺傳多態(tài)區(qū)。該短串聯(lián)重復(fù)序列基因座區(qū)分度達(dá)到0.7910以上，與少量常規(guī)的STR基因座聯(lián)用，可有效區(qū)分遺傳關(guān)系，區(qū)分度高達(dá)0.99以上。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0055]短串聯(lián)重復(fù)序列基因座
[0056]本發(fā)明通過大量篩選，分離出一種新的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座，STR位點(diǎn)信息如表I所示。
[0057]表1STR的基本信息
[0058]

【權(quán)利要求】
1.一種分離的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001，其特征在于，所述基因座的序列如SEQID N0.:1 所示。
2.一種分離的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的結(jié)構(gòu)如下:
X1-X2-X3
式中，Xl 為 SEQ ID N0.:2 中第 1-800 位； X2為含有> 2個(gè)重復(fù)單元ttcc的遺傳多態(tài)區(qū)；
X3 為 SEQ ID N0.:2 中第 860-1660 位。
3.如權(quán)利要求1所述的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001的用途，其特征在于，用于制備: (a)用于遺傳關(guān)系分析的試劑或試劑盒； (b)用于個(gè)體識別的試劑或試劑盒； (C)用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒； (d)用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或 (e)用于檢測骨髓移植 后受體中的白細(xì)胞是否被供體細(xì)胞取代的試劑盒。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的試劑包括(i)引物或引物對；(ii)探針；(iii)核酸芯片。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的引物對的序列如SEQID N0.:3和SEQID N0.:4 所示。
6.一種特異性擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001的引物對，其特征在于，所述的引物對的序列如SEQ ID N0.:3和SEQ ID N0.:4所示。
7.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: (a)用于特異性擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001的引物對； (b)使用說明書。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括(c)特異性擴(kuò)增選自下組的一種或多種基因座的引物對:
D3S1358、vffA, D16S539、D5S818、D7S820、CSF1PO、D13S317、TPOX, D8S1179、D21S11、D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
9.一種擴(kuò)增體系，其特征在于，所述擴(kuò)增體系包括: (a)用于特異性擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G8S0001的引物對；和 (b)任選的、特異性擴(kuò)增選自下組的一種或多種基因座的引物對:
D3S1358、vffA, D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX, D8S1179、D21S11、D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMELO ； 并且所述引物對(a)和任選的引物對(b)位于同一擴(kuò)增體系。
10.如權(quán)利要求9所述的擴(kuò)增體系，其特征在于，所述的擴(kuò)增體系為復(fù)合擴(kuò)增體系，其中，所述的引物對(b)包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16對特異性引物對；和/或 所述復(fù)合擴(kuò)增體系為熒光標(biāo)記的復(fù)合擴(kuò)增體系，其中，所述熒光標(biāo)記是指選用下組的一種或多種熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記所述基因座的引物:FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA, ROX、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。
11.一種擴(kuò)增方法，其特征在于，包括步驟: 在權(quán)利要求9-10中任一所述的擴(kuò)增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行基因座的擴(kuò)增，從而獲得基因座擴(kuò)增產(chǎn)物。
12.—種遺傳關(guān)系分析方法，其特征在于，包括步驟: (1)在權(quán)利要求9-10中任一所述的擴(kuò)增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行基因座的擴(kuò)增，從而獲得基因座擴(kuò)增產(chǎn)物；和其中，所述待檢測樣本包括分別來自不同個(gè)體的核酸樣本SI, S2,......，Si，式中i為≥2的正整數(shù)； (2)對來自不同核酸樣本SI，S2,……，Si的基因座擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，從而獲得對應(yīng)于不同核酸樣本的檢測結(jié)果； (3)對步驟(2)獲得的檢 測結(jié)果進(jìn)行比較，從而確定不同個(gè)體之間的遺傳關(guān)系。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046619SQ201310080392
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月13日
【發(fā)明者】姜正文, 馬瑞曉, 張希 申請人:天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司