一種抗Blys的單克隆抗體及含有該抗體的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程抗體【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及與B淋巴細胞刺激因子Blys特異性結(jié)合的基因工程抗體以及含有該抗體的藥物組合物和試劑盒。所述基因工程抗體，其重鏈可變區(qū)含有SEQ?ID?NO.1，SEQ?ID?N0.2和SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸序列，或其輕鏈可變區(qū)含有SEQID?NO.4，SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供一種抗Blys的單克隆抗體，由保藏編號為CGMCC?No.7352的細胞株產(chǎn)生。本發(fā)明所述抗體可與Blys有很強的結(jié)合親和力,可抑制Blys與IM9細胞表面受體，抑制Blys誘導(dǎo)的鼠脾細胞增殖，可用于治療Blys相關(guān)性疾病。本發(fā)明所述抗體活性強、特異性好、易于制備，具有廣闊的臨床應(yīng)用和實驗應(yīng)用前景。
【專利說明】一種抗Blys的單克隆抗體及含有該抗體的藥物組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及基因工程抗體【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及與B淋巴細胞刺激因子Blys特異性結(jié)合的基因工程抗體以及含有該抗體的藥物組合物和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]Blys (B淋巴細胞刺激因子)，又稱BAFF，是1999年發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞因子，屬于腫瘤壞死因子超家族成員(TNFSF)。主要由巨噬細胞和中性粒細胞分泌產(chǎn)生，在活化的T細胞和樹突狀細胞中也有少量表達。人BAFF基因定位于染色體13q32_q34，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成。
[0003]Blys分子由285個氨基酸組成，，為II型跨膜糖蛋白，單體成楔形樣的“三明治”結(jié)構(gòu)，缺少N-糖基化位點。跨膜區(qū)在47-73位氨基酸。133-285位氨基酸為其發(fā)揮功能的主要區(qū)域。可溶型Blys (soluble Blys, s Blys)是由膜型Blys在第132或133位氨基酸殘基發(fā)生酶解脫落而形成，兩者的生物學(xué)活性基本一致。Blys以同源三聚體的形式發(fā)揮生物學(xué)作用。Blys的受體共有三種，即TAC1、BCMA和BR3，通過與受體結(jié)合調(diào)節(jié)著機體免疫平衡。
[0004]Blys分子在B細胞發(fā)育、功能調(diào)節(jié)和自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其缺陷或過量表達均可引起機體免疫失衡，從而誘發(fā)多種疾病，可能與某些自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AD)的發(fā)生有關(guān)。在SLE、SS和RA等疾病患者血清中Blys水平明顯升高，進一步證實BAFF過表達密切參與了這些疾病的發(fā)生和發(fā)展。
[0005]自身免疫性疾病(autoimmune diseases, AD)是一類機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害的疾病。常見的全身性自身免疫性疾病有SLE、干燥綜合征(Sjsngren syndrome, SS)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)等。目前，對AD的治療手段仍處于研究和探索中，主要是依賴免疫抑制劑等藥物治療，但療程較長，發(fā)生藥物不良反應(yīng)較多見。結(jié)合基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的靶向抗體藥物治療正成為新興的研究領(lǐng)域，有望為AD治療提供新的策略。抗體與其靶點的結(jié)合是特異性的，能夠起到介導(dǎo)免疫效應(yīng)機制的作用，并且在血清中具有較長的半衰期。這些特性使抗體具有很強的治療應(yīng)用。
[0006]目前，F(xiàn)DA于2011年3月9日批準抗Blys單克隆抗體Belimumab的上市，用于治療SLE，成為50年來首個獲準的用于治療SLE的藥物，預(yù)計至2015年，其銷售總額將會高達30億美元。但是由于獨家生產(chǎn)，病人需要花費高額的費用，目前一個病人用藥一年的費用約在3萬美元左右。所以，研發(fā)新的抗Blys單克隆抗體，從而減少病人負擔，降低治療費用是一個亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種對Blys抑制活性更高的單克隆抗體。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有該抗體的藥物組合物或試劑、試劑盒或芯片。
[0009]本發(fā)明的目的還在于提供抗Blys抗體用于制備治療相關(guān)疾病的藥物中的用途。
[0010]本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到:
[0011]本發(fā)明所述抗Blys單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID N0.1,SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.3所示的氨基酸序列，和/或其輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.5和SEQID N0.6所示的氨基酸序列。
[0012]本發(fā)明所述“抗體”應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因子。因而，這個術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的。抗體的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb或Fd,或者雙鏈抗體(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在 EP.A-0120694 和 EP.A-0125023 中有所描述。
[0013]本發(fā)明所述單克隆抗體可以是，例如，單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
[0014]抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補性決定區(qū)(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見，EP.A-184187、GB2188638A或EP.A-239400。還可以對雜交瘤細胞或產(chǎn)生抗體的其它細胞進行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。
[0015]本發(fā)明所述單克隆抗體除了重鏈和輕鏈中的高度可變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3和連接序列外，其它為框架區(qū)。框架區(qū)可在結(jié)合所需的三維結(jié)構(gòu)不受影響的條件下被其他序列置換，抗體特異性的分子基礎(chǔ)主要來自于它的高度可變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3，這些區(qū)域是與抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位。為維持優(yōu)選的結(jié)合特性，CDR的序列應(yīng)盡可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改變使結(jié)合特性最優(yōu)化，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以用標準做法來達到此目的。
[0016]一個實施方案中，抗體包含如下序列的可變區(qū):一個包含了如SEQ ID N0.7所示的重鏈可變區(qū)，其含有 CDRl (SEQ ID N0.1)，CDR2(SEQ ID N0.2)和 CDR3 (SEQ ID N0.3)所示的氨基酸序列；和一個包含了如SEQ ID N0.8所示的輕鏈可變區(qū)，其含有CDRl (SEQ ID N0.4),CDR2 (SEQ ID N0.5)，和 CDR3 (SEQ ID N0.6)所示的氨基酸序列。
[0017]可變區(qū)⑶R的變體與上述⑶R區(qū)除了有至多6個氨基酸取代的不同外基本上是一致的(例如，1、2、3、4或5個氨基酸取代)，在具有CDR變體的單克隆抗體中，CDR區(qū)變體具有與Blys結(jié)合活性。
[0018]另一個實施方案中，抗體可包含:a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ IDN0.7所示序列相比有至多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個氨基酸取代；和b) —個輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0.8所示序列相比有至多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個氨基酸取代。目標抗體可能包含這些取代中的任何一個或其組合。
[0019]擁有這些取代位置中任一個取代位置的抗體和擁有所有取代位置的抗體同樣具有結(jié)合Blys的活性。氨基酸取代可同時存在于框架區(qū)和CDR區(qū)，或單獨出現(xiàn)在框架區(qū)或⑶R區(qū)。因此，在某些優(yōu)選例中，重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0.7所示序列相比可能有最多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個取代，和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0.8所示序列相比可能有最多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個取代。
[0020]在一些抗體中，氨基酸取代可能分布在多個⑶R區(qū)。因此，重鏈可變區(qū)的多個⑶R區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0.7所示序列相比可能有至多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個取代，和輕鏈可變區(qū)的多個⑶R區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0.8所示序列相比可能有至多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個取代。
[0021]另一個實施方案中，抗體可能包含a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ IDN0.7所示序列至少有95%的一致性和b) —個輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0.8所示序列至少有95%的一致性。因此，目標抗體可能包含a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0.7所示序列至少有約95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性和b) —個輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0.8所示序列至少有約95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
[0022]另一個實施方案中，抗體可能包含a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ IDN0.7所示序列一致和b) —個輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0.8所示序列一致。
[0023]另一個實施方案中，抗體進一步包括免疫球蛋白的Fe區(qū)，優(yōu)選地免疫球蛋白為IgG，進一步優(yōu)選地免疫球蛋白為人的IgG。
[0024]另一個實施方案中，抗體可能包含a) —個重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID N0.9所示序列至少有95%的一致性和b) —個輕鏈，其氨基酸序列與SEQ ID N0.10所示序列至少有95%的一致性。因此，目標抗體可能包含a) —個重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID N0.9所示序列至少有約95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性和b) —個輕鏈，其氨基酸序列與SEQ IDN0.10所示序列至少有約95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
[0025]除了上面所描述的氨基酸取代，目標抗體可能在重鏈或輕鏈的兩端有附加的氨基酸。例如，目標抗體在重鏈和/或輕鏈的C或N末端分別可能包含至少1、2、3、4、5或6或更多的附加氨基酸。在某些實施例中，目標抗體可能比這里所描述的示范性氨基酸短，其主要區(qū)別為在重鏈和輕鏈的兩端分別比示范性氨基酸少1、2、3、4、5或6個氨基酸。
[0026]另一個實施方案中，抗體可能包含a) —個重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID N0.9所示序列一致和b) —個輕鏈，其氨基酸序列與SEQ ID N0.10所示序列一致。
[0027]在本發(fā)明的實施例中，所述的單克隆抗體是由保藏編號為CGMCC N0.7352的細胞株產(chǎn)生，其重鏈氨基酸系列如SEQ ID N0.9所示，輕鏈如SEQ ID N0.10所示。
[0028]本發(fā)明還提供了一種細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.7352。其產(chǎn)生一種單克隆抗體，所述抗體重鏈氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示，在本發(fā)明的實施例中，命名為H1104-30-CA，受體結(jié)合活性試驗證明，H1104-30-CA具有抑制Blys與其受體結(jié)合的活性。
[0029]本發(fā)明提供了一種藥用組合物，該組合物含有有效量的抗Blys單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
[0030] 本發(fā)明還涉及了試劑、試劑盒或芯片，包含上述的單克隆抗體。
[0031]本發(fā)明所提供的抗Blys單克隆抗體的抑制Blys與受體結(jié)合活性(見實施例2)，與現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)物Belimumab的活性相似,但是所述的抗Blys單克隆抗體抑制Blys刺激的鼠脾細胞增殖的活性優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)物Belimumab，本發(fā)明的單克隆抗體的IC5tl值為0.0057ug/ml,Belimumab的IC5tl值為0.0078ug/ml，表明本發(fā)明對Blys有更強的抑制作用。
[0032]本發(fā)明還提供所述的單克隆抗體在制備用于治療Blys相關(guān)性疾病藥物中的用途。所述Blys相關(guān)性疾病包括自身免疫性疾病(例如全身性自身免疫性疾病有SLE、干燥綜合征SS和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎RA)，以及感染性疾病(例如AIDS)和增殖性疾病(例如白血病，癌癥和淋巴瘤)。該目標抗體還可以用于與Blys相關(guān)的科學(xué)研究，如發(fā)育生物學(xué)、細胞生物學(xué)、代謝、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、功能基因組學(xué)等多個領(lǐng)域的科學(xué)研究、或腫瘤、全身性自身免疫性疾病有SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的應(yīng)用研究。
[0033]本發(fā)明還提供了使用目標抗體來抑制Blys活性的方法，以及使用目標抗體用于治療Blys相關(guān)性疾病或使用含有該抗體的試劑盒進行Blys相關(guān)診斷與檢測。
[0034]用于本發(fā)明的單克隆抗體也可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發(fā)明人源化抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體中。
[0035]一旦制得本發(fā)明的抗體分子，就可以通過本領(lǐng)域已知的純化免疫球蛋白分子的任何方法對其進行純化，例如，通過色譜法(例如，離子交換色譜，親和色譜，特別是通過蛋白A對特異性抗原的親和色譜和其它柱色譜)、離心、利用溶解度差異，或通過任何其它純化蛋白質(zhì)的標準技術(shù)。在許多實施方案中，抗體從細胞分泌到培養(yǎng)基中，通過收集培養(yǎng)基并進行純化得到抗體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1顯示單克隆抗體與Blys的直接結(jié)合活性，Hl 104-30的EC5tl=0.05857nM。
[0037]圖2顯示單克隆抗體的結(jié)合特異性。
[0038]圖3顯示單克隆抗體競爭性抑制Blys與頂9細胞表面受體結(jié)合的活性，Hl 104-30的 IC5tl=0.4479nM, Belimumab 的 IC5tl=0.4763nM。
[0039]圖4顯示單克隆抗體的抑制Blys刺激的鼠脾細胞增殖的活性，Hl 104-30的IC50=0.0057ug/ml, Belimumab 的 IC50=0.0078ug/ml。
[0040]圖5顯示嵌合抗體H1104-30-CA競爭性抑制Blys與頂9細胞表面受體結(jié)合的活性。
[0041]生物材料保藏說明
[0042]保藏編號為CGMCC N0.7352的細胞株于2013年3月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，分類命名為小鼠雜交瘤細胞。
[0043]定義
[0044]本發(fā)明中提到的參考著作、專利、專利申請及科學(xué)文獻，構(gòu)成本領(lǐng)域技術(shù)人員的已有知識，作為整體在此引入作為參考，與這些文獻專門單個引入作為參考時的范圍相同。在本申請所引入文獻與本說明書特定含義之間如有任何抵觸，都應(yīng)該以后者為準。另外，本領(lǐng)域?qū)υ~匯和短語定義的已有理解與本說明書中對該詞匯或短語的專門解釋而下的定義之間如有抵觸，都以后者為準。
[0045]在進一步闡述本發(fā)明之前，我們有必要認識到，本發(fā)明并不局限于描述的特定的實施方案，也就是說，在具體形式上可能存在著變化。還有一點需要提醒的是，由于本發(fā)明的范圍受附加的權(quán)利要求書的限制，因此，本文使用的術(shù)語只是為了描述特定實施方案的目的，而不是為了限制本發(fā)明的目的。
[0046]氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域中所使用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母或I字母代碼。
[0047]另外應(yīng)注意，如本說明書中所使用的，單數(shù)形式包括其所指對象的復(fù)數(shù)形式，除非清楚且明確的限于一個所指對象。術(shù)語“或”可與術(shù)語“和/或”互換使用，除非上下文另有清楚指明。
[0048]術(shù)語“單克隆抗體(MAbs)”和“單抗”在本文中可以互換使用，是指對于特定抗原的抗體的同類群體并且該抗體僅包含一種類型的抗原結(jié)合位點并且只結(jié)合抗原決定簇上的一個表位。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法可以獲得對于特定抗原的單克隆抗體。例如單克隆抗體可以通過雜交瘤法,或重組DNA法制備。
[0049]術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可以互換使用。這些術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的術(shù)語，具體是指由能特異結(jié)合抗原的一種或多種多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)。抗體的一種形式構(gòu)成了抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。這種形式是四聚物，它由兩對完全相同的抗體鏈構(gòu)成，每一對都有一個輕鏈和一個重鏈。在每對抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)聯(lián)合在一起共同負責結(jié)合抗原，而恒定區(qū)則負責抗體的效應(yīng)器功能。
[0050]目前已知的免疫球蛋白多肽包括K和λ輕鏈，以及a，Y (IgGl，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重鏈或它們的其它類型等價物。全長的免疫球蛋白“輕鏈”(大約25kDa或大約214個氨基酸)包含一個由NH2-末端上大約110個氨基酸形成的可變區(qū)，以及一個COOH-末端上的K或λ恒定區(qū)。全長的免疫球蛋白“重鏈”(大約50kDa或大約446個氨基酸)，同樣包含一個可變區(qū)(大約116個氨基酸)，以及重鏈恒定區(qū)之一，例如Y (大約330個氨基酸)。
[0051 ] 術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗原特異結(jié)合的抗體片段，包括但不限于Fab，F(xiàn)v, scFv和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包含抗體的抗原結(jié)合部分和非抗體蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。抗體可以被標記和檢測，例如，可以通過放射性同位素、能產(chǎn)生可檢測物的酶、熒光蛋白質(zhì)、生物素等等進行標記并被檢測。抗體還可以結(jié)合于固相載體，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。該術(shù)語還包括Fab’、Fv, F (ab’)2和/或其它能與抗原特異性結(jié)合的抗體片段和單克隆抗體。
[0052]抗體還可以以多種形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab’)2，以及雙功能雜合抗體(例如，Lanzavecchia 等,Eur.J.1mmunol.，1987 ;17，105)以及以單鏈形式(例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，1988 ;85，5879 和 Bird 等，Science, 1988 ;242，423，在此引用作為參考)存在。免疫球蛋白的重鏈或輕鏈可變區(qū)由三個超變區(qū)(也稱為“互補決定區(qū)”或⑶R)組成，這些超變區(qū)被框架區(qū)(FR)間隔。框架區(qū)和互補決定區(qū)的范圍已被精石角定義(參見〃Sequences of Proteins of Immunological Interest, 〃Ε.Kabat 等，U.S.Department of Health and Human Services, 1991)。此處所討論的所有抗體氨基酸序列的排序都參照Kabat系統(tǒng)。同一物種不同的輕鏈和重鏈框架區(qū)序列相對保守。抗體的框架區(qū)用于定位和校準CDR。CDR主要負責結(jié)合抗原的表位。
[0053]“嵌合抗體”是其重鏈和輕鏈基因經(jīng)過構(gòu)建的抗體，特別是利用基因工程改造的屬于不同物種的抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因。例如，可以將鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)片段連接到人抗體恒定區(qū)片段如Y I和Y3。當然，嵌合抗體的基因來源也可以使用其它哺乳動物物種。
[0054]在某些實施方案中，抗體與其靶點之間的親和力用KD (解離常數(shù))來表征，它低于10-6Μ、10-7Μ、10-8Μ、10-9Μ、10-10Μ、KT11M 或者約 KT12M 或更低。
[0055]抗體重鏈或輕鏈的“可變區(qū)”是該鏈的N端成熟區(qū)域。所有區(qū)域、CDR和殘基編號均以序列比對、按已有的結(jié)構(gòu)知識為基礎(chǔ)進行定義。框架區(qū)和CDR殘基的鑒定和編號按 Chothia 和他人所述(Chothia, Structural determinants in the sequences ofimmunoglobulin variable domain.J Mol B1l.1998 ;278,457)。
[0056]“VH”是抗體重鏈的可變區(qū)。“VL”是抗體輕鏈的可變區(qū)，它可能具有K和λ同種型。κ-l抗體具有K-1同種型而Κ-2抗體具有K-2同種型，“V λ ”是可變的λ輕鏈。
[0057]術(shù)語“ 多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以互換使用，它們都是指任何長度的聚合形式的氨基酸，可以包括編碼和非編碼的氨基酸、通過化學(xué)或生物化學(xué)修飾或衍生的氨基酸以及具有修飾肽骨架的多肽。該術(shù)語包括融合蛋白，包括但不限于具有異源氨基酸序列的融合蛋白；具有異源和同源前導(dǎo)序列，帶有或不帶有N-末端甲硫氨酸殘基的融合蛋白；帶有免疫標簽的蛋白；帶有可檢測融合伴侶的融合蛋白，例如包括熒光蛋白質(zhì)、β_半乳糖苷酶、熒光素等等作為融合伴侶的融合蛋白等等。多肽可以具有任何大小，術(shù)語“肽”是指長度為8-50個殘基(如8-20個殘基)的多肽。
[0058]“相應(yīng)的氨基酸”，是指當兩個或多個氨基酸序列比對時，位于相同位置(也就是它們彼此對應(yīng))的氨基酸殘基。抗體序列比對和編號的方法在Chothia，見上，Kabat，見上和其他中得到詳盡闡述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知(參見如Kabat 1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest, DHHS, Washington, DC),有時可以在抗體的一個或兩個氨基酸中制造一個、兩個或三個缺口和/或插入1、2、3或4個殘基或者至多約15個殘基(特別是在L3和H3⑶R中)，從而完成一次比對。
[0059]“可取代位置”，指的是抗體的一個特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不會使抗體的結(jié)合活性顯著降低。鑒定可取代位置的方法和它們可以被如何取代在下面將進行更加詳細的描述。可取代位置也可以稱為“變異耐受位置”。
[0060]“親本”抗體是指作為氨基酸取代的靶抗體。在某些實施方案中，“供體”抗體會將氨基酸“贈捐”給親本抗體以生成改變的抗體。
[0061]“相關(guān)抗體”是指具有相似序列并且由具有共同B細胞祖先的細胞產(chǎn)生的抗體。這種B細胞祖先含有具有重排輕鏈VJC區(qū)和重排重鏈VDJC區(qū)基因組，并且產(chǎn)生還未經(jīng)歷親和力成熟的抗體。存在于脾臟組織中的“純真”或“原始”B細胞是B細胞的共同祖先。相關(guān)抗體與相同的抗原表位結(jié)合通常在序列上極為相似，特別是它們的L3和H3CDR。相關(guān)抗體的H3和L3CDR都具有相同的長度和近乎一致的序列(有0-4個氨基酸殘基不同)。相關(guān)抗體通過共同抗體祖先，即原初B細胞祖先產(chǎn)生的抗體相關(guān)聯(lián)。
[0062]術(shù)語“抗Blys單克隆抗體”是與Blys以足夠的親和力以及特異性結(jié)合的抗體。
[0063]術(shù)語“有效暈”指可有效治療哺乳動物中的疾病或病癥的藥物量。
[0064]術(shù)語“藥效上可接受的載體”指一種或多種有機或無機成分，它可以是天然的或合成的，與抗體組合后可促進其應(yīng)用。可接受的載體包括無菌的生理鹽水或是其它藥學(xué)上可獲得的且為本領(lǐng)域所熟知的水或非水的等滲溶液或滅菌混懸劑。

【具體實施方式】
[0065]本發(fā)明公開了一種抗Blys抗體及含有該抗體的組合物，和其用于制備治療Blys相關(guān)疾病的藥物中的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0066]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0067]實施例1:制備表達抗人Blys單抗的雜交瘤細胞
[0068]通過雜交瘤細胞技術(shù)制備鼠源單克隆抗體。有關(guān)實驗方案參見文獻(EdHarlow, David Lane.Antibody:A laboratory manual.1988)。
[0069]首先通過重組技術(shù)制備Blys-His (含6Xhis標簽)融合蛋白。將Blys_his的DNA 序列克隆入 PCDNA3.1 (Invitrogen),轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒進入 CH0-K1 (ATCC N0.CCL-60)細胞株，經(jīng)過G418 (G IBCO)加壓篩選，獲得Blys-His穩(wěn)定表達細胞株，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，收集培養(yǎng)上清液，用NI柱(QIAGEN)純化表達的Blys-His融合蛋白。
[0070]用純化的Blys-His (作為抗原組分)與完全弗氏佐劑(Sigma)混合進行腹腔注射，對BALB/c小鼠進行首次免疫，此后，分別在第14d和第35d，用純化蛋白和不完全弗氏佐劑混合后腹腔注射對小鼠進行加強免疫，第56d用純化的Blys-His (PBS稀釋)對BALB/c小鼠靜脈注射進行最終免疫，4天后取脾臟進行融合。
[0071]將鼠脾細胞與SP2/0細胞(ATCC N0.CRL-1581)按5:1比例融合，在96孔板(Corning)中以HAT (GBICO)培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后進行雜交瘤細胞篩選，所得細胞克隆進行結(jié)合篩選。
[0072]鑒定篩選過程分為兩個步驟:①將Blys-His固定化于96孔酶聯(lián)免疫吸附板(Costar)上，加入克隆表達上清孵育Ih后，用PBST洗滌3次，使用羊抗鼠IgG抗體-HRP(Jackson Immuno )鑒定具有Blys結(jié)合活性細胞克隆上清,從而獲得可與Blys直接結(jié)合的陽性克隆。②隨后將步驟①中的陽性克隆轉(zhuǎn)移入24孔板(Corning)培養(yǎng)，以獲得更多的表達產(chǎn)物。將IM9細胞(ATCC N0.CCL-159) (Blys受體過表達)固定于Poly_lysine96孔板(NUNC)上，加入生物素化的Blys和克隆表達產(chǎn)物共同孵育lh，再用PBS洗滌3次，使用EU標記的鏈親和素(Perkin Elmer)檢測生物素化的Blys的含量，以鑒定克隆對Blys受體結(jié)合活性的抑制作用，從而鑒別出能夠阻斷Blys與其受體結(jié)合的陽性克隆。
[0073]實施例2:抗人Blys的鼠源單克隆抗體的制備及鑒定
[0074]用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞，收集培養(yǎng)上清液，用Protein G柱(金斯瑞)純化鼠源單克隆抗體，獲得單克隆抗體稱為H1104-30。抗體鑒定項目如下:
[0075]A:抗體結(jié)合活性
[0076]將Blys-His包被于96孔酶聯(lián)免疫吸附板(Costar)上，然后將1:4系列稀釋單克隆抗體加入包被Blys-His板的孔中，加入羊抗鼠IgG抗體_HRP( Jackson Immuno),顯色進行檢測。結(jié)果顯示所篩選的單克隆抗體直接Binding EC5tl達1-1OOpM水平(見圖1)。
[0077]B:抗體的結(jié)合特異性
[0078]將等量的Blys-His，TNF 其它家族成員，包括 TNFa (R&D), TNF^ (R&D), April(R&D) , , Light (R&D), Fas Ligand (R&D), Trial (R&D)，以及鼠 BLYS (R&D)和猴 BLYS，分別包被于96孔酶聯(lián)免疫吸附板(Costar)上，然后將單克隆抗體加入包被孔中，加入羊抗鼠IgG抗體-HRP (Jackson Immuno),顯色進行檢測。結(jié)果顯示所篩選的單克隆抗體與其它TNF家族成員沒有結(jié)合反應(yīng)(見圖2)，所述單克隆抗體與猴Blys有交叉結(jié)合，與鼠Blys結(jié)合較弱。
[0079]C:抗體的親和力測定
[0080]采用Forteb1測定單克隆抗體與Blys的親合常數(shù)KD。單克隆抗體被固定在MAC探針(Forteb1)上，用 SD BUFFER PBS+0.1%BSA 平衡探針，接著與 Blys-His 結(jié)合 5min，然后探針再孵育SD BUFFER進行解離，KD為kd/ka，表1中顯示單克隆抗體與Blys的親合常數(shù) KD。Hl 104-30 的親合常數(shù) KD 為 0.3023NM。
[0081]表1單克隆抗體的親和力測定
[0082]

【權(quán)利要求】
1.一種單克隆抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID N0.1,SEQ ID N0.2和SEQIDN0.3所示的氨基酸序列，和/或其輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.5和SEQ IDN0.6所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQID N0.7所示；或其重鏈可變區(qū)由SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID N0.7的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合BLYS的活性。。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，其輕鏈可變區(qū)如SEQID N0.8所示的氨基酸序列；或其輕鏈可變區(qū)由SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID N0.8的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合BLYS的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體進一步包括免疫球蛋白的Fe區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單克隆抗體，其特征在于所述免疫球蛋白是IgG。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單克隆抗體，其特征在于所述免疫球蛋白是人的免疫球蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，其重鏈如SEQID N0.9所示的氨基酸序列；或其重鏈由SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID N0.9的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合BLYS的活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，其輕鏈氨基酸序列如SEQIDN0.10所示的序列；或且其輕鏈由SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID N0.10的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合BLYS的活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCC N0.7352的細胞株產(chǎn)生。
11.一種細胞株，其特征在于，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7352。
12.權(quán)利要求1至9任一項所述的單克隆抗體在制備用于治療BLYS相關(guān)性疾病藥物中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述BLYS相關(guān)性疾病包括自身免疫性疾病(例如全身性自身免疫性疾病有SLE、干燥綜合征SS和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎RA)，以及感染性疾病(例如AIDS)和增殖性疾病(例如白血病，癌癥和淋巴瘤)。
14.一種藥物組合物，其特征在于，含有有效量的權(quán)利要求1-9任一項所述的單克隆抗體及藥學(xué)上可接受的載體。
15.一種試劑、試劑盒或芯片，包含權(quán)利要求1至9任一項所述的單克隆抗體。
【文檔編號】C12N5/20GK104045713SQ201310080394
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月13日
【發(fā)明者】蘇云鵬, 莊偉亮 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司, 江蘇先聲藥業(yè)有限公司