專利名稱：一種軟骨干細胞分離培養方法
技術領域：
本發明涉及一種軟骨干細胞分離培養方法。
背景技術：
軟骨缺損是一類普遍疾病，嚴重的關節軟骨缺損會導致骨關節炎。在我國，骨關節炎發病率3%，并有逐年上升的趨勢。然而目前治療骨關節炎的手段對癥治療效果短暫，長期療效不確定，而基于組織工程原理的自體軟骨細胞移植的療法也存在種子細胞來源不足和質量有限的缺陷成體軟骨細胞的的供區極其有限；軟骨細胞在體外培養過程中擴增能力有限；傳代后的細胞老化，發生“去分化”現象，喪失形成軟骨能力等。因此難以用少量的成體軟骨細胞經體外培養擴增后來獲得大量有正常功能的軟骨細胞，從而限制了軟骨組織工程的臨床應用。為了解決種子細胞來源不足的問題，干細胞憑借其自我更新能力和多向分化潛能的特征，為組織工程提供了理想的種子來源，來源于軟骨組織的組織特異性干細胞在其中有其先天優勢。最近有研究表明，軟骨組織中存在具有多能特性的干細胞。將軟骨細胞體外低密度種植，有部分細胞表現出成集落特性。經鑒定發現其中有十分之一的細胞具有向脂肪，骨和軟骨多向分化的潛能。從胚胎軟骨組織中也分離出了具有間質干細胞特性的細胞。只是，在這樣的分離過程中，還沒有標準的分選流程，并能保證分選效率。

發明內容
本發明目的是提供一種軟骨干細胞分離培養方法。本發明采用的技術方案是一種軟骨干細胞分離培養方法，所述方法包括(1)取三代以內的軟骨細胞，用細胞培養基I培養至軟骨細胞長滿培養皿；所述細胞培養基I終濃度組成如下5 20% (w/v，質量體積百分比濃度，某組分濃度表示 IOOmL培養液中含有該組分lg，下同)胎牛血清，50 200U/ml青霉素，50 200U/ml鏈霉素，0. 5 2mM L-谷氨酰胺，溶劑為F12_DMEM(F12與DMEM體積比1 1的混合液)；(2)軟骨細胞長滿后用胰酶-EDTA (即胰酶/EDTA消化液，胰酶濃度0. 01 0. 05%，EDTA濃度0.01 0.05%，w/v)消化成單細胞懸液，以小于50個細胞/cm2的密度接種至培養板，利用細胞培養基Π進行培養10 14天；所述細胞培養基II終濃度組成如下5 20%胎牛血清，50 200U/ml青霉素，50 200U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM ；(3)待獲得細胞平鋪面積占培養板20 30%的細胞量時，更換用細胞培養基III 培養；所述細胞培養基III終濃度組成如下5 20%胎牛血清，50 200U/ml青霉素， 50 200U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM ；(4)待細胞呈現50 %以上面積融合率時，用胰酶-EDTA (即胰酶/EDTA消化液，胰酶濃度0. 01 0. 05%工01々濃度0. 01 0. 05%,w/v)消化成單細胞懸液，以50 100個細胞/cm2的密度，接種至培養板，用細胞培養基III進行培養；傳代細胞經細胞鑒定，獲得所述軟骨干細胞；所述細胞培養基III終濃度組成如下5 20%胎牛血清，50 200U/ml青霉素，50 200U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM。后代細胞可正常傳代培養，正常傳代條件為 利用胰酶-EDTA消化成單細胞懸液，以100 300個細胞/cm2的密度接種培養。優選的，所述細胞培養基I終濃度組成如下10%胎牛血清，100U/ml青霉素， 100U/ml鏈霉素，ImM L-谷氨酰胺，溶劑為F12-DMEM。所述步驟O)中細胞接種密度優選為3 10個/平方厘米，所述細胞培養基II 終濃度組成如下20%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM。所述細胞培養基III終濃度組成如下10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM。細胞鑒定方法(1)利用CD146抗體，進行磁珠分選進行陰性細胞分選，對比上述獲得的軟骨干細胞，進行比對鑒定。(2)利用⑶146作為軟骨組織中特定亞群軟骨干細胞標記物軟骨干細胞鑒定1) 細胞形態觀察細胞貼壁為分化第一天，每天觀察貼壁細胞形態，細胞篩選后成纖維樣細胞比例> 95%。2)克隆形成能力對比⑶146-的軟骨細胞(< 3% )和依照本發明方法收獲的軟骨干細胞(> 45% )在克隆形成率上有明顯差別。幻細胞表型鑒定間質細胞表型陽性(CD44，CD90，CD105，CD106)，造血系表形陰性(⑶34)，間質樣細胞占到95%以上。4)增殖、分化及組織分化能力細胞具有骨、軟骨及脂肪三系分化能力。本發明所述的軟骨干細胞為由軟骨組織細胞篩選而來，經特定培養基培養條件維持的成纖維樣細胞，具骨、軟骨及脂肪分化能力，與成體細胞相比還具有良好的擴增能力， 自原代收獲后可傳至15代以上而保持原來特性。本發明是在前研究的基礎上進一步提高， 利用特定培養條件進行篩選，純化出軟骨干細胞，使軟骨干細胞含量在95%以上。此技術將促進軟骨組織性特異干細胞的收獲和應用于骨、軟骨組織工程。本發明的有益效果主要體現在(1)本發明所獲得細胞具有良好的擴增能力，可傳至15代而保持特性，并具有形成骨，軟骨及脂肪的能力；(2)本發明獲得了定義準確、純度高的細胞亞群；C3)本發明細胞適合于骨、軟骨等組織的缺損修復和作為組織工程的種子細胞。未來骨關節炎的細胞治療也是本發明潛在的應用范圍。


圖1為軟骨細胞平面培養的原代細胞㈧和軟骨干細胞⑶的種子細胞形態；圖2為分選后細胞形態和表面標記具有高度均一性；圖3為本發明分離出軟骨干細胞的倍增速率；圖4為軟骨干細胞與間充質干細胞表型相似度；圖5為與⑶146-軟骨細胞亞群相比的陽性克隆形成力對比；圖6為軟骨干細胞具有類似于間充質干細胞的三系分化能力；圖7為軟骨干細胞與MSC體內成骨能力對比；圖8為軟骨干細胞與MSC體外成軟骨能力對比；圖9為軟骨干細胞與MSC體內成軟骨能力對比。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 (本實例試劑除特殊說明均購自hvitrogen公司)1)軟骨細胞培養取0. 20g軟骨組織(廢棄組織，由浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院惠贈)，將其切成ImmX ImmX Imm碎片，PBS緩沖液(含青霉素、鏈霉素各100U/mL)沖洗后，在透明質酸酶和II型膠原酶的序列性消化下，分離單個軟骨細胞。過濾，1500r/min 離心5min，離心半徑為4. 5cm，沉淀細胞PBS洗2次。低糖DMEM (20% FBS)制成細胞懸液， 以10個細胞/cm2密度接種于IOem培養皿，每3d換液1次，0. 25%的胰蛋白酶-EDTA進行傳代，體外單層培養，低糖DMEM(10% FBS)至第3代。2)進行體外單層培養并進行⑶146免疫熒光染色。體外單層培養過程如下(1)取三代以內的軟骨細胞，用細胞培養基I培養至軟骨細胞長滿培養皿；所述細胞培養基I終濃度組成如下10% (w/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，ImM L-谷氨酰胺，溶劑為F12-DMEM(1 1)；(2)軟骨細胞長滿后用胰酶-EDTA (即胰酶/EDTA消化液，胰酶濃度0. 25%，EDTA 濃度0. 02%,w/v)消化成單細胞懸液，以3 10個細胞/cm2的密度接種至培養板，利用細胞培養基II進行培養12天；所述細胞培養基II終濃度組成如下20%胎牛血清，100U/ml 青霉素，100U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM ；(3)待獲得細胞平鋪面積占培養板20 30%的細胞量時，更換用細胞培養基III 培養；所述細胞培養基III終濃度組成如下10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM ；(4)待細胞呈現50 %以上面積融合率，用胰酶-EDTA (即胰酶/EDTA消化液，胰酶濃度0. 25%,EDTA濃度0. 02%,w/v)消化成單細胞懸液，以50 100個細胞/cm2的密度， 接種與培養板，用細胞培養基III進行培養。后代細胞可正常傳代培養。傳代細胞經細胞鑒定，獲得所述軟骨干細胞；所述細胞培養基III終濃度組成如下10%胎牛血清，100U/ml 青霉素，100U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM。正常傳代條件為利用胰酶-EDTA消化成單細胞懸液，以100 300個細胞/cm2的密度接種培養。軟骨細胞平面培養的原代細胞和軟骨干細胞的種子細胞形態見圖1 ；分選后細胞形態和表面標記具有高度均一性(圖2)，分離出軟骨干細胞的倍增速率見圖3 ；3)流式細胞術檢測CD146陽性細胞表面標記將體外單層培養培養的CD146陽性細胞分離消化下來，PBS洗一次，一抗常溫孵育30min，PBS洗兩次，多聚甲醛固定，上機檢測 ⑶146、⑶105、⑶90、⑶44、⑶34等表面標記。結果見圖4。由圖可見，軟骨干細胞具有間充質干細胞類似表型。4)利用磁珠分選篩選出CD146-細胞亞群，和以上分離出的細胞進行克隆形成能力比對。在直徑6cm的培養皿中種植100個細胞，9天后清點直徑大于2mm的克隆數，評估其克隆形成能力。結果圖5，由圖可見，與CD146-軟骨細胞亞群相比，軟骨干細胞具有明顯的陽性克隆形成力。實施例2 對實施例1所得的細胞進行三系分化能力鑒定。
(1)骨系分化鑒定誘導過程將軟骨干細胞以100個細胞/cm2接種與M孔培養板，利用骨誘導培養基(溶劑:10% FBS, 100U/ml 青霉素，100U/ml 鏈霉素，50 μ M 抗壞血酸，IOmM β-甘油磷酸鈉，0. IuM地塞米松)進行誘導14天。成骨分化鑒定結果ALP堿性磷酸酶表達陽性(參見圖6A)(2)脂肪系分化鑒定將軟骨干細胞以100個細胞/cm2接種與M孔培養板，利用脂肪誘導培養基(溶劑H-DMEM，添加10% FBS, 100U/ml 青霉素，100U/ml 鏈霉素，0. 5mM 3-異丁基-1-甲基 (IBMX)，IOuM胰島素，0. 5uM地塞米松)進行誘導14天。成脂肪分化鑒定方法油紅染色，脂滴著色紅(參見圖6B)(3)軟骨系分化鑒定細胞團塊三維軟骨誘導模型將軟骨干細胞胰酶消化后以 2X IO5個細胞/0. 5ml軟骨誘導液/離心管分裝，300g離心5分鐘。直立放入培養箱，進行三維軟骨誘導，隔2天換液一次，21天后收集樣本。軟骨誘導液配方L-DMEM+10ng/ml TGF- β 1,0. IuM 地塞米松，50mg/ml 維生素 C。成軟骨分化鑒定方法組織學包埋固定后，進行番紅-0染色。細胞團塊的基質呈紅色，代表有糖胺聚糖分泌，軟骨誘導成功(參見圖6C)。實施例3:將實施例1所得的細胞和已有的骨髓來源間充質干細胞培養至長滿后，種植 2. 5X IO6細胞(50ul，5X 107ml)于海藻酸鈉凝膠，構建組織工程骨。1)細胞標記Dil熒光染料，植入支架材料空缺處，利用海藻酸鈉凝膠將細胞和材料復合物包裹，加入BMP4作為成骨誘導因素，植入裸鼠皮下。2) 8周后取出，追蹤其熒光，觀察細胞存活情況，顯示細胞生存良好。利用X光檢測其鈣化，軟骨干細胞(CSPC)組優于骨髓來源的間質干細胞(BMSC)。軟骨干細胞與MSC體內成骨能力對比結果見圖7，提示其擁有較好異位成骨能力。實施例4 將實施例1所得的細胞和已有的骨髓來源間充質干細胞培養至長滿后，種植 2. 5X IO5細胞進行pellet培養，評估其體外成軟骨能力。根據Visual Histological Grading System for the Evaluation of in Vitro-Generated Neocartilage一文中評分標準獲得評分。軟骨干細胞與MSC體外成軟骨能力對比結果見圖8，由圖可見，本發明獲得的軟骨干細胞與MSC相比，具有更強的體外成軟骨能力。實施例5 將實施例1所得的細胞和已有的骨髓來源間充質干細胞培養至長滿后，種植 2. 5X IO6細胞(50ul，5X107ml)于海藻酸鈉凝膠，構建組織工程軟骨。1)細胞標記Dil熒光染料，植入支架材料空缺處，利用海藻酸鈉凝膠將細胞和材料復合物包裹，植入裸鼠皮下。2) 8周后取出，追蹤其熒光，觀察細胞存活情況，顯示細胞生存良好。3)利用X光檢測其鈣化，軟骨干細胞(CSPC)組幾乎無鈣化，骨髓來源的間質干細胞(BMSC)則出現鈣化情況。4)根據國際軟骨修復學會的組織修復大體評分標準，CSPC體內成軟骨能力與原代軟骨細胞持平(見圖9)，優于骨髓來源間質干細胞。
權利要求
1.一種軟骨干細胞分離培養方法，所述方法包括(1)取三代以內的軟骨細胞，用細胞培養基I培養至軟骨細胞長滿培養皿；所述細胞培養基I終濃度組成如下5 20%胎牛血清，50 200U/ml青霉素，50 200U/ml鏈霉素， 0. 5 2mM L-谷氨酰胺，溶劑為F12-DMEM ；(2)軟骨細胞長滿后用胰酶-EDTA消化成單細胞懸液，以小于50個細胞/cm2的密度接種至培養板，利用細胞培養基Π進行培養10 14天；所述細胞培養基II終濃度組成如下5 20%胎牛血清，50 200U/ml青霉素，50 200U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM ；(3)待獲得細胞平鋪面積占培養板20 30%細胞量時，更換用細胞培養基III培養； 所述細胞培養基III終濃度組成如下5 20%胎牛血清，50 200U/ml青霉素，50 200U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM ；(4)待細胞呈現50%以上面積融合率時，用胰酶-EDTA消化成單細胞懸液，以50 100 個細胞/cm2的密度，接種至培養板，用細胞培養基III進行培養；傳代細胞經細胞鑒定，獲得所述軟骨干細胞；所述細胞培養基III終濃度組成如下5 20%胎牛血清，50 200U/ ml青霉素，50 200U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述細胞培養基I終濃度組成如下10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，ImM L-谷氨酰胺，溶劑為F12-DMEM。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中細胞接種密度為3 10個 /平方厘米，所述細胞培養基II終濃度組成如下20%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml 鏈霉素，溶劑為L-DMEM。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述細胞培養基III終濃度組成如下10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，溶劑為L-DMEM。
全文摘要
本發明提供了一種軟骨干細胞分離培養方法。本發明所述的軟骨干細胞為由軟骨組織細胞篩選而來，經特定培養基培養條件維持的成纖維樣細胞，具骨、軟骨及脂肪分化能力，與成體細胞相比還具有良好的擴增能力，自原代收獲后可傳至15代以上而保持原來特性。本發明利用特定培養條件進行篩選，純化出軟骨干細胞，使軟骨干細胞含量在95％以上，此技術將促進軟骨組織性特異干細胞的收獲和應用于骨、軟骨組織工程。
文檔編號C12N5/077GK102399745SQ20111037462
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月22日 優先權日2011年11月22日
發明者姜洋子, 歐陽宏偉 申請人:浙江大學