專利名稱：一種無動(dòng)物源的淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別涉及一種化學(xué)成分明確、無動(dòng)物源的淋巴細(xì)胞無血清
培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療的弊端，已經(jīng)被認(rèn)為是二十一世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有發(fā)展前途的一種治療手段。細(xì)胞免疫治療是采集人體免疫細(xì)胞(主要為淋巴細(xì)胞)，經(jīng)過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增多，靶向性殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。體外培養(yǎng)、擴(kuò)增淋巴細(xì)胞使用最大的試劑是培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為細(xì)胞的生長(zhǎng)擴(kuò)增提供了基本的環(huán)境，包括適宜的滲透壓，為淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增提供生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分，包括氨基酸、無機(jī)鹽、微量元素、維生素等，同時(shí)也保護(hù)淋巴細(xì)胞免受代謝過程中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的損害。傳統(tǒng)的淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增體系，主要是基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加一定濃度的胎牛血清(FBS)。盡管歐洲等允許使用FBS，但中國(guó)，美國(guó)等國(guó)家嚴(yán)禁在細(xì)胞治療中使用動(dòng)物源成分。FBS中含有異種蛋白質(zhì)，它本身有攜帶細(xì)菌、病毒、蛋白傳染性疾病或朊病毒的風(fēng)險(xiǎn)。另外，有研究表明淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可以吞噬培養(yǎng)基中的蛋白，內(nèi)含有牛血清蛋白，可以使受者體內(nèi)產(chǎn)生抗牛蛋白抗體引起免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致患者尤其在重復(fù)輸注細(xì)胞治療后治療失效。因此FBS在細(xì)胞臨床大規(guī)模培養(yǎng)中的不利因素已經(jīng)逐漸暴露出來，現(xiàn)已有很多學(xué)者研究淋巴細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。一些公司也已經(jīng)開發(fā)了淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基.如LONZA公司開發(fā)X-VIVO無血清培養(yǎng)基、奧地利PAA公司開發(fā)QUANTUM-007淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基等。但這些無血清培養(yǎng)基成分不明確,且價(jià)格昂貴,這大大的增加了免疫細(xì)胞治療的成本，不利于廣泛應(yīng)用的推廣。而且QUANTUM-007淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基含有動(dòng)物源成分(說明書)。我們提供了一種淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基化學(xué)成分明確，無動(dòng)物源，無血清。此類培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其次是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確，有助于進(jìn)一步研究淋巴細(xì)胞的作用機(jī)制。這種培養(yǎng)基的開發(fā)能極大推動(dòng)免疫細(xì)胞治療標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)，也節(jié)約了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種無血清培養(yǎng)基，組成為MDM 17.7 g/L、L-谷氨酰胺1-5 mM、碳酸氫鈉3.024 g/L、重組人胰島素1_10 mg/L、人轉(zhuǎn)鐵蛋白5_20 mg/L、人血清白蛋白4-10 g/L、2-巰基乙醇55 uM、N-乙酰-半胱氨酸100-300 mg/ml、脂質(zhì)
0.1-0.5%、氨基酸1_5%、維生素1-5%、微量兀素0.1-0.5%、氫化可的松Ι-lOng/ml、乙醇胺l-5mg/l、非必需氨基酸1-5%、檸檬酸鐵l-10mg/L。
更優(yōu)選地，本發(fā)明所述無血清培養(yǎng)基其必要組成為MDM 17.7 g/L、L_谷氨酰胺5禮、碳酸氫鈉3.024 g/L、N-乙酰-半胱氨酸160mg/L、重組人胰島素10 mg/L、人轉(zhuǎn)鐵蛋白10 mg/L、人血清白蛋白5 g/L、2-巰基乙醇55 uM、氫化可的松40ug/L、脂質(zhì)0.1%、氨基酸2%、維生素1%、微量元素1%、非必需氨基酸1%、檸檬酸鐵l-10mg/L。用本發(fā)明提供的無動(dòng)物源、無血清培養(yǎng)基與QUANTUM-007淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、X-VIVO無血清培養(yǎng)基培淋巴細(xì)胞相比，結(jié)果顯示，其細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞活率要好于這兩種培養(yǎng)基，細(xì)胞表型結(jié)果也顯示輔助性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例高于這兩種培養(yǎng)基，在一定比例下，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基擴(kuò)增的CIK細(xì)胞殺瘤率高于這兩種培養(yǎng)基，而且避免了動(dòng)物成分和批次的不穩(wěn)定性。本發(fā)明提供了一種化學(xué)成分明確、無動(dòng)物源、無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其次是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確，有助于進(jìn)一步研究淋巴細(xì)胞擴(kuò)增情況。移植的淋巴細(xì)胞通過多種細(xì)胞因子與微環(huán)境相互作用以達(dá)到彼此適應(yīng)，微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子對(duì)移植后淋巴細(xì)胞的趨化、歸巢、活化及存活均起著重要的作用，而且培養(yǎng)基無動(dòng)物源成分，可以避免在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中引入動(dòng)物成分，干擾細(xì)胞生長(zhǎng)。


圖1為實(shí)施例中A、B、C無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血CIK細(xì)胞形態(tài)圖；圖2為實(shí)施例中A、B、C無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)外周血CIK細(xì)胞形態(tài)圖；圖3為實(shí)施例中A、B、C無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血CIK擴(kuò)增倍數(shù)；圖4為實(shí)施例中A、B、 C無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)外周血CIK擴(kuò)增倍數(shù)；圖5為實(shí)施例中A、B、C無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血CIK細(xì)胞活力；圖6為實(shí)施例中A、B、C無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血CIK21天后細(xì)胞表型；圖7為實(shí)施例中A、B、C無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)外周血CIK21天后細(xì)胞表型；圖8為實(shí)施例中A、B、C無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血CIK21天后細(xì)胞殺瘤率；
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種無動(dòng)物源的淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的無動(dòng)物源的淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1:培養(yǎng)基的配制重組人胰島素儲(chǔ)存液的配制:稱取IOOmg重組人胰島素溶于40mL注射用水中，滴加2M HCl至重組人胰島素完全溶解，定容至50mL，配制成20mg/mL的儲(chǔ)存液，4°C保存。人轉(zhuǎn)鐵蛋白儲(chǔ)存液的配制:稱取IOOmg人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于40mL注射用水中，至完全溶解后定容至50mL，配制成20mg/mL的儲(chǔ)存液，4°C保存。本發(fā)明所述培養(yǎng)基成分如下:
權(quán)利要求
1.一種無血清培養(yǎng)基，其必要組成為頂DM 17.7 g/L、L-谷氨酰胺1-5 mM、碳酸氫鈉3.024 g/L、重組人胰島素1-10 mg/L、人轉(zhuǎn)鐵蛋白5-20 mg/L、人血清白蛋白1-10 g/L、2-巰基乙醇55 uM、N-乙酰-半胱氨酸100-300 mg/mL、脂質(zhì)0.1-0.5%、氨基酸1_5%、維生素1_5%、微量兀素0.1-0.5%、氫化可的松Ι-lOng/mL、乙醇胺l_5mg/L、非必需氨基酸1_5%、檸檬酸鐵l-10mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，其必要組成為MDM17.7 g/L、L-谷氨酰胺5 mM、碳酸氫鈉3.024 g/L、N_乙酰-半胱氨酸160mg/L、重組人胰島素10 mg/L、人轉(zhuǎn)鐵蛋白10 mg/L、人血清白蛋白5 g/L、2-巰基乙醇55 uM、氫化可的松40ug/L、脂質(zhì)0.1%、氨基酸2%、維生素1%、微量元素1%、非必需氨基酸1%、檸檬酸鐵2mg/L。
3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述無血清培養(yǎng) 基培養(yǎng)淋巴細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，公開了一種無動(dòng)物源的無血清培養(yǎng)基，其必要組成為IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、重組人胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人血清白蛋白、2-巰基乙醇、N-乙酰-半胱氨酸、脂質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素、檸檬酸鐵、氫化可的松、乙醇胺、非必需氨基酸。本發(fā)明所述無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確、無動(dòng)物源、無血清，培養(yǎng)細(xì)胞安全、理想，避免了摻雜動(dòng)物成分和批次的不穩(wěn)定性，培養(yǎng)淋巴細(xì)胞結(jié)果顯示其細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞表型均正常，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/078GK103146648SQ20131008216
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者武曉云, 呂巖, 康會(huì)彥 申請(qǐng)人:北京京蒙高科干細(xì)胞技術(shù)有限公司