專利名稱：一種富油微藻的高通量篩選方法
技術領域：
本發明涉及微藻生物能源領域。
背景技術：
近幾年，隨著化石燃料儲量日益降低，化石燃料的枯竭和不可再生性及其燃燒導致的全球變暖、環境污染等問題，迫使世界各國尋找可以替代化石燃料的綠色、可持續發展的新能源。生物質能可以利用光合作用將太陽能以化學能的形式儲存在生物體內，是地球上最普遍的環保型可再生能源。在眾多的生物質能中，生物柴油已為了世界上發展最快、應用最廣的綠色新能源，受到了廣泛的關注。生物柴油的主要成份是脂肪酸甲酯，有著與石化柴油相近的性能，且具有優良的燃燒性能、環保性和可再生性。其主要原料來源于植物油脂(大豆油、菜籽油、玉米油、麻風樹油、棕櫚油和花生油等)、動物油脂(動物脂肪酸)和廢棄食用油(地溝油)。然而，現有生物柴油發展的瓶頸在于原料價格高、供應嚴重不足，且加大生物柴油的生產勢必會與其他農作物爭奪土地，導致糧食供應問題。因此，亟需尋求低成本、大規模、可持續供應的油脂原料來源。與其他生物柴油的原料相比，以微藻油脂生產生物柴油有著明顯的優勢。微藻的含油量高、生長周期短、油脂產率要遠高于普通的產油作物。微藻培養不與農業生產沖突，可以在鹽堿地、灘涂、荒漠地區及鹽堿水、海水和廢水等非農用水中進行規模化生產。微藻除了用于提取油脂外，還可開發高附加值產品(活性蛋白、活性多糖、天然色素、沼氣、飼料、表面活化劑等)，用以降低微藻生物柴油的成本。微藻生物柴油規模化生產的首要任務是篩選油脂含量高、生長迅速和抗逆性強的藻株，而微藻的培養方式在富油藻種的選育中起到重要的作用。微藻的培養方式主要分為自養、異養和混合培養 三種方式。自養培養是以無機碳化合物為碳源，利用微藻的光合作用將化學能轉化為生物能的營養方式。其操作簡單、成本較低，但得到的細胞密度低、光合效率低，規模培養時微藻收獲困難，難以滿足規模化生產的需要。異養培養是在無光照條件下利用有機碳源作為能源和碳源，可以進行藻類的高密度培養并大大提高微藻的油脂產率，這相應的降低了采收的難度和提取成本，但異養培養生產成本和能耗均較高。混合培養是指微藻利用無機物和有機物作為碳源的培養方式，能同時利用藻類光能自養和異養生長的能力，據報道其比生長速率約等于自養和異養培養的總和，可以實現自養培養和異養培養的優勢互補，故混合培養是一種比較適合的培養方式。此外，傳統的有機溶劑提取法測定微藻油脂含量存在耗時費力、所需試劑和樣品量大、毒性試劑會對人體和環境造成危害等問題，難以滿足富油微藻篩選過程中高通量測定油脂含量的需要。

發明內容
本發明的目的是為了篩選能進行混合培養的富油藻種，并解決現有微藻有機溶劑提取法存在耗時費力、所需試劑和樣品量大、毒性試劑會對人體和環境造成危害，難以滿足微藻篩選中高通量測定油脂含量的需要的問題，而提供一種富油微藻的高通量篩選方法。本發明的一種富油微藻的高通量篩選方法，是通過以下步驟實現:一、取微藻樣品加入到培養基A中富集培養15 30天，得藻液；二、取步驟一得到的藻液，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養基A中,在溫度為25°C的光照培養箱中培養7 14天；三、重復步驟二 2 3次，得藻液A ;四、取步驟三得到的藻液A，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養基B中，在溫度為25°C的培養箱中培養7 14天，得藻液B ;五、取步驟四得到的藻液B以無菌水按10'10_2、10_3、10_4、10_5和10_6的倍數進行稀釋，將10_5 10_6倍數稀釋后的藻液均勻涂布于固體培養基C平板上，在25°C培養箱中培養至出現藻落；六、在無菌環境中，挑取單藻落，轉入到培養基B中，在溫度為25°C的培養箱中培養7 14天；七、重復步驟五至步驟六3 4次，即完成藻株的分離，得到微藻液；八、取3 IOmL步驟七得到的微藻液，用超聲波進行破碎，在破碎后的藻液中加入尼羅紅溶液，混勻后，測定藻液的熒光強度，選擇熒光強度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株；其中，步驟一和步驟二中所述的培養基A按重量份數是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸和0.005 0.01份微量元素組成的；步驟四和步驟六中所述的培養基B按重量份數是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸、0.005 0.01份微量元素和5 50份葡萄糖組成的；步驟五中所述的固體培養基C按重量份數是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸、0.005 0.01份微量元素、5 50份葡萄糖和5 20份瓊脂組成的；步驟八中所述的 藻液與尼羅紅溶液的體積比為3:1000。本發明包含以下有益效果:本發明采用一種熒光染色的方法，避免了冗繁的傳統油脂檢測步驟，克服了藻種大規模篩選缺乏快速、高通量的篩選方法的瓶頸問題。表I為有機溶劑提取法與熒光法的比較，由表可知，本發明的方法具有所需樣品量小、測定快速、耗時少、對人和環境無毒性等優點。表I有機溶劑提取法與熒光法比較表
權利要求
1.一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于富油微藻的高通量篩選方法是通過以下步驟實現:一、取微藻樣品加入到培養基A中富集培養15 30天，得藻液；二、取步驟一得到的藻液，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養基A中，在溫度為25°C的光照培養箱中培養7 14天；三、重復步驟二 2 3次，得藻液A ;四、取步驟三得到的藻液A，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養基B中，在溫度為25°C的培養箱中培養7 14天，得藻液B;五、取步驟四得到的藻液B以無菌水按10'10_2、10_3、10_4、10_5和10_6的倍數進行稀釋，將10_5 10_6倍數稀釋后的藻液均勻涂布于固體培養基C平板上，在25°C培養箱中培養至出現藻落；六、在無菌環境中，挑取單藻落，轉入到培養基B中，在溫度為25°C的培養箱中培養7 14天；七、重復步驟五至步驟六3 4次，即完成藻株的分離，得到微藻液；八、取3 IOmL步驟七得到的微藻液，用超聲波進行破碎，在破碎后的藻液中加入尼羅紅溶液，混勻后，測定藻液的熒光強度，選擇熒光強度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株； 其中，步驟一和步驟二中所述的培養基A按重量份數是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸和0.005 0.01份微量元素組成的； 步驟四和步驟六中所述的培養基B按重量份數是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸、0.005 0.01份微量元素和5 50份葡萄糖組成的； 步驟五中所述的固體培養基C按重量份數是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、.0.003 0.012份 檸 檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸、.0.005 0.01份微量元素、5 50份葡萄糖和5 20份瓊脂組成的； 步驟八中所述的藻液與尼羅紅溶液的體積比為3:1000。
2.根據權利要求1所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于步驟一中所述的微藻樣品為小球藻、柵藻、娃藻、隱甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻、金藻中的一種或幾種按任意比混合。
3.根據權利要求1所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于步驟一和步驟二中所述的培養基A按重量份數是由I份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、0.001份乙二胺四乙酸和0.00541份微量元素組成的。
4.根據權利要求1所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于步驟四和步驟六中所述的培養基B按重量份數是由0.5份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、.0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素和10份葡萄糖組成的。
5.根據權利要求1所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于步驟五中所述的固體培養基C按重量份數是由0.5份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、0.001份乙二胺四乙酸、.0.00541份微量元素、10份葡萄糖和15份瓊脂組成的。
6.根據權利要求1、3、4或5所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于所述的微量元素為0.00286重量份的硼酸、0.00181重量份的氯化錳、0.00039重量份的鑰酸鈉、.0.000222重量份 的 硫酸鋅、0.000079重量份的硫酸銅和0.000049重量份的硝酸鈷。
全文摘要
一種富油微藻的高通量篩選方法，它涉及微藻生物能源領域。本發明要解決現有微藻有機溶劑提取法存在耗時費力、所需試劑和樣品量大、毒性試劑會對人體和環境造成危害，難以滿足微藻篩選中高通量測定油脂含量的需要的問題。本發明的方法如下一、取微藻富集培養，培養7～14天；二、重復2～3次；三、接種后，培養7～14天；四、進行稀釋后涂布，培養至出現藻落；五、挑取生長較快、較大的單藻落，培養7～14天；六、重復步驟四至步驟五3～4次；八、超聲波進行破碎后加入尼羅紅溶液，選擇熒光強度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株；本發明避免了冗繁的傳統油脂檢測步驟，克服了藻種大規模篩選缺乏快速、高通量篩選方法的瓶頸問題。
文檔編號C12N1/12GK103146582SQ201310096030
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月25日 優先權日2013年3月25日
發明者任南琪, 任宏宇, 劉冰峰, 謝國俊, 趙磊, 馬超 申請人:哈爾濱工業大學