用于不斷富集由微藻產(chǎn)生的、具有dha乙酯的一種油的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于制備由發(fā)酵微生物產(chǎn)生的、富含DHA乙酯的油的方法，其特征在于所述方法包括通過所謂的“短路徑”分子蒸餾進(jìn)行的純化步驟。CNCM I-446920110414
【專利說明】用于不斷富集由微藻產(chǎn)生的、具有DHA乙酯的一種油的方 法
[0001] 本發(fā)明涉及一種連續(xù)方法，該方法使得在工業(yè)上能夠獲得一種油，該油富含來自 微藻的一種天然脂肪酸：二十二碳六烯酸或DHA的乙酯。
[0002] 更具體地，本發(fā)明涉及從一種微藻衍生的油生產(chǎn)富含DHA乙酯的一種油，該微藻 衍生的油最初：
[0003]-中等富含DHA并且
[0004]-包含大量的不可皂化的、基本由角鯊烯組成的化合物。
[0005] 為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"微藻衍生的油"旨在意指從破囊壺菌目 (Thraustochytriales sp.)家族的微藻提取的油。
[0006] 為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"破囊壺菌目家族的微藻"旨在意指屬于裂殖壺 菌屬（Schizochytrium sp.)、澄黃壺菌屬（Aurantiochytrium sp.)和破囊壺菌屬 (Thraustochytrium sp.)物種的微藻。
[0007] 為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"中等富含DHA的油"旨在意指包含按總脂肪酸的質(zhì)量計 30%至45%的DHA的一種油（為了簡化，使用了術(shù)語總脂肪酸的"重量"）。
[0008] 為了本發(fā)明的目的，表述"包含大量的不可皂化的、基本由角鯊烯組成的化合物的 油"同樣旨在意指包含按不可皂化的化合物的重量計約10%至30%、包括15%至25%的角 鯊烯的一種油。
[0009] 最后，表述"使一種油富含衍生自微藻的DHA乙酯"旨在意指一種方法，該方法使 得能夠?qū)⒃撚偷腄HA含量增加到1. 5至2倍，在這種情況下從最初的按總脂肪酸的重量計 30%和45%之間的DHA含量到具有按總脂肪酸的重量計60%和70%之間的DHA的DHA乙 酯含量的一種油。
[0010] 脂質(zhì)與蛋白質(zhì)和碳水化合物一起構(gòu)成了大量營養(yǎng)元素的三個主要家族。
[0011] 在脂質(zhì)中，甘油三酸酯和磷脂是特別突出的。
[0012] 甘油三酸酯代表大約95%的攝取的食物脂質(zhì)。在生物中，它們主要存在于脂肪組 織并構(gòu)成能量存儲的主要形式。
[0013] 磷脂是結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)，因為他們是細(xì)胞膜的組分，在細(xì)胞膜中它們尤其提供流動性。
[0014] 甘油三酸酯和磷脂主要由脂肪酸組成，它們都是由飲食提供，對于它們中的一些， 是由生物合成的。
[0015] "必需"多不飽和脂肪酸的飲食來源是植物油（即和脂肪酸）以及特別包 含大量《 3脂肪酸的魚油。
[0016] 多不飽和脂肪酸是根據(jù)第一雙鍵的位置（從最終甲基官能開始）歸類的。
[0017] 因此，在命名中對于《 "x"或"nx"，"x"對應(yīng)于第一不飽和的位置。
[0018] 生物學(xué)上感興趣的多不飽和脂肪酸的大部分屬于《6(花生四烯酸或ARA)或 ? 3 (二十碳五烯酸或EPA，二十二碳六烯酸或DHA)家族。
[0019] 此外，在命名中，構(gòu)成該鏈的碳的數(shù)目也被定義：從而EPA被描述為C20:5并且 DHA被描述為C22:6。
[0020] 該"5"和"6"從而對應(yīng)于該碳鏈的不飽和數(shù)目，該碳鏈分別由EPA和DHA呈現(xiàn)。
[0021] ? 3脂肪酸家族的DHA是生物可以從a -亞麻酸合成的或通過消耗脂質(zhì)魚（金槍 魚、鮭魚、鯡魚等）提供的一種脂肪酸。
[0022] DHA在膜結(jié)構(gòu)中以及在腦和視網(wǎng)膜發(fā)育和功能中發(fā)揮重要作用。
[0023] 魚油主要用作《 3型脂肪酸例如DHA和EPA的來源，但DHA和EPA也在微藻的油 (從其中它們是作為一種混合物或分開地提取的）中看到，如在這種情況下，例如該油衍生 自某些選擇的菌株，例如裂殖壺菌屬的那些，其僅包含痕量的EPA，但包含高DHA含量。
[0024] 用于使魚油富含DHA和/或EPA的常規(guī)方法基于針對該油的長鏈的組分脂肪酸或 其飽和度的選擇性。
[0025] 第一必要的是分離連接到甘油酯骨架的脂肪酸，為了能夠隨后分離DHA和/或EPA 鏈。
[0026] 從該甘油鏈分離這些脂肪酸的操作是通過乙醇轉(zhuǎn)酯（乙醇分解）進(jìn)行的。
[0027] 最常見地隨后使用的針對這樣的脂肪酸或其酯實施的富集方法是：
[0028] _ 結(jié)晶、
[0029]-逆流萃取、
[0030]-分子蒸餾、或
[0031] _制備型層析。
[0032] 通常，為了獲得有力的富集，會將各種方法進(jìn)行組合。
[0033] 然而，這些方法具有以下缺點：
[0034] _高溫富集方法引起脂肪酸的熱降解（異構(gòu)化、過氧化、低聚化）。
[0035] _層析技術(shù)的缺點是保留大量常常是有毒的溶劑的使用。
[0036] 此外，使用這些技術(shù)的大規(guī)模生產(chǎn)常常極不易。
[0037] 因為這些原因，已經(jīng)開發(fā)和研究了替代方法，所述方法基于使用超臨界流體，特別 是通過用超臨界C0 2進(jìn)行的分級方法。
[0038] 在使用超臨界C02使魚油富含DHA和/或EPA之前使用的一個步驟是使用甲醇或 乙醇對這些脂肪酸進(jìn)行轉(zhuǎn)酯。
[0039] 使用超臨界C02將脂肪酸的乙酯分級的方法已經(jīng)例如在文獻(xiàn)中充分地描述。
[0040] 然而，應(yīng)注意大部分引用的方法尤其描述了聯(lián)合富集EPA和DHA乙酯，而不僅是 DHA。
[0041] 此外，這些方法的絕大多數(shù)：
[0042] _是分批方法，
[0043] -過度地使用大量的超臨界流體，
[0044] _具有低產(chǎn)率，
[0045] -并且最后具有低生產(chǎn)力。
[0046] 此外，在許多情況下，柱中應(yīng)用的100°C溫度可引起脂肪酸降解。
[0047] 應(yīng)用的壓力也太強，并且降低它們直接導(dǎo)致超臨界C02的消耗增加。
[0048] 換句話說，這些方法在經(jīng)濟上可行的條件下不可用于工業(yè)規(guī)模。
[0049] 一種用于使魚油富含EPA和DHA乙酯的方法是例如描述于專利申請JP 2005-255971〇
[0050] 溫度與壓力范圍分別是從35°C至200°C和從100X 105Pa至500X 105Pa。
[0051] 作者建議為了獲得高含量進(jìn)行兩次連續(xù)提取。
[0052] 第一次提取是在原料上進(jìn)行，并且第二次提取在來自第一次操作的殘余物上進(jìn) 行。
[0053] 使用的柱是3m高，直徑是50mm。它包括6個不同的加熱室。
[0054] 用于獲得高DHA百分比的、定義為超臨界C02的流速與所處理的油的流速的比率 的溶劑水平保持高水平。
[0055] 這兩次連續(xù)提取液使該方法復(fù)雜并使它不可在工業(yè)上應(yīng)用。
[0056] 似乎，在閱讀這些元素時，使用超臨界流體使油富集脂肪酸的技術(shù)是優(yōu)選的選擇， 但仍需要優(yōu)化研究。
[0057] 如上所述，《 3脂肪酸的另一個來源是微藻。
[0058] 然而，在來自微藻的油的領(lǐng)域中該情況更加復(fù)雜，因為存在另外的困難，這與來自 微藻的油中不可皂化的化合物的存在有關(guān)。
[0059] 因此，盡管通常在魚油上進(jìn)行的轉(zhuǎn)酯操作不構(gòu)成任何重大技術(shù)問題，對于來自微 藻的油這變得有問題，因為大規(guī)模的粗制油轉(zhuǎn)酯從實用的觀點上看實際上是不可能的。
[0060] 這種技術(shù)不可能性和可變（但通常是高的）含量的不可皂化的化合物（例如角鯊 烯）的存在有關(guān)。
[0061] 因此，顯著損失可利用化合物受到批判。
[0062] 角鯊烯是在醫(yī)藥、美容和飲食上感興趣的一種多不飽和的烴，特別存在于來自微 藻的油中。
[0063] 其中發(fā)現(xiàn)按某些選擇的菌株（例如裂殖壺菌屬的那些）的質(zhì)量計的超過15%的可 變含量（時常是高的）。
[0064] 在現(xiàn)有技術(shù)中，已知如果目的是從該油中提取該角鯊烯并且隨后生產(chǎn)僅包含痕量 的角鯊烯的一種油的話，角鯊烯可從脂質(zhì)（基本上由甘油三酸酯組成）例如通過分子蒸餾 而花費幾個連續(xù)步驟獲得。
[0065] 因為所有來自微藻的油的組分對熱特別敏感，這種方法常規(guī)地必須在非常強的真 空下進(jìn)行，考慮到其非常低的生產(chǎn)力，需要配備非常大的容積。
[0066] 因此，可建議提出其他方法：
[0067]-更高效的（如果希望的是使用分子蒸餾而不是常規(guī)實施的操作的話）的方法，或 [0068]-在中等溫度下操作并確保保護(hù)對氧化非常不穩(wěn)定的不飽和的產(chǎn)物和空氣沒有任 何接觸，而同時可以容易地工業(yè)化直到每年加工成百上噸所處理的油的能力。
[0069] 就本 申請人:公司的知識所及，目前對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說沒有可得的用 于使用微藻通過分子蒸餾技術(shù)使油富集DHA乙酯的高效和可工業(yè)化的方法。
[0070] 關(guān)于開發(fā)用于富集由微藻產(chǎn)生的DHA的高效方法，本 申請人:公司已經(jīng)開發(fā)了它自 身的研究并已成功改進(jìn)分子蒸餾技術(shù)以確保富集超過兩倍的初始油的含量的DHA。
[0071] 本發(fā)明因此涉及一種用于制備富含由發(fā)酵微生物產(chǎn)生的DHA乙酯的油的方法，其 特征在于它包括通過"短路徑"分子蒸餾進(jìn)行的純化步驟。
[0072] 這些微生物優(yōu)先地是屬于破囊壺菌目家族的微藻，甚至更優(yōu)先地是屬于裂殖壺菌 屬、橙黃壺菌屬和破囊壺菌屬物種的微藻。
[0073] 分子蒸餾的實施
[0074] 在根據(jù)本發(fā)明的用于制備富含DHA乙酯的油的方法中，實施了一種方法，其特征 在于所述方法包括以下步驟：
[0075] 1)通過發(fā)酵破囊壺菌目家族的微藻制備包含以下物質(zhì)的混合物的粗制油：富含 DHA的甘油三酸酯和基本上由角鯊烯組成的不可皂化的化合物，
[0076] 2)任選地通過脫膠、脫酸、褪色和脫臭的一系列步驟，精煉所得到的粗制油，
[0077] 3)通過"短路徑"分子蒸餾提取該角鯊烯，以獲得不含角鯊烯的提余液，
[0078] 4)在堿性或酶催化劑、優(yōu)選酶催化劑的存在下通過醇轉(zhuǎn)酯將所得到的提余液進(jìn)行 轉(zhuǎn)酯，
[0079] 5)通過"短路徑"分子蒸餾將步驟4)中的脂肪酸酯的混合物進(jìn)行分級，以獲得富 含短鏈脂肪酸酯的提取物以及極富含長鏈脂肪酸酯的提余液，
[0080] 6)通過"短路徑"分子蒸餾將步驟5)中獲得的長鏈脂肪酸酯的混合物進(jìn)行純化， 以獲得極富含長鏈酯的不含雜質(zhì)的提取物，
[0081] 7)任選地，通過褪色和脫臭的一系列步驟，精煉極富含長鏈酯級分的該提取物，
[0082] 8)收集所得到的富含DHA乙酯的化合物。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明的這種方法的第一步在于通過發(fā)酵破囊壺菌目家族的微藻制備包含 以下物質(zhì)的混合物的粗制油：富含DHA的甘油三酸酯和基本上由角鯊烯組成的不可皂化的 化合物。
[0084] 作為屬于破囊壺菌目家族的微藻，例如以下菌株是可商購的：
[0085]-裂殖壺菌，參考號為ATCC 20888，
[0086]-橙黃壺菌，參考號ATCC PRA 276，
[0087] 此外，本 申請人:公司還擁有自己生產(chǎn)的菌株，裂殖壺菌，于2011年4月14日保 藏在法國巴斯德研究所的國家微生物保藏中心[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes]，保藏號為CNCMI-4469,并且還保藏在中國武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，中國武漢，430072,保藏號為M 209118。
[0088] 該培養(yǎng)在異養(yǎng)條件下進(jìn)行。總的來講，該培養(yǎng)步驟包括預(yù)培養(yǎng)步驟（為了使該菌 株復(fù)蘇），并且然后是實際培養(yǎng)或發(fā)酵步驟。后一步驟對應(yīng)于生產(chǎn)感興趣的脂類化合物的步 驟。
[0089] 用于培養(yǎng)這些微藻的條件在本領(lǐng)域是熟知的。然后處理該生物質(zhì)以獲得包含DHA 和基本上由角鯊烯組成的不可皂化的化合物的混合物的粗制油。
[0090] 此外，這些處理可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行。
[0091] 這使得能夠獲得由甘油酯（主要是甘油三酸酯）和不可皂化的化合物（主要是角 鯊烯）和任選的較低比例的游離脂肪酸和磷脂組成的粗制油。如將在后文示例的，可從上 述的CNCM 1-4469菌株容易地獲得按總脂肪酸的重量計30%和45 %之間的DHA和按重量 計10%和30%之間的不可皂化的化合物（包括15%至25%角鯊烯）的含量。
[0092] 根據(jù)本發(fā)明的這種方法的第二步在于任選地通過脫膠、脫酸、褪色和脫臭的一系 列步驟，精煉所得到的粗制油。
[0093] 因此，在提取角鯊烯之前，事先將富含角鯊烯的粗制油經(jīng)歷粗精煉。
[0094]可設(shè)想以下步驟中的一個或多個：
[0095] _脫膠：在酸性介質(zhì)中通過沉淀去除磷脂，
[0096] _脫酸：使用堿中和這些游離脂肪酸。為了避免夾帶角鯊烯，似乎應(yīng)禁用用于去除 該游離脂肪酸的分子蒸餾的使用，
[0097] _褪色：通過用活性炭處理，
[0098]-脫臭（真空蒸餾、汽提等）。
[0099] 這些精煉步驟是在植物油的精煉中專業(yè)人士常用的步驟。
[0100] 根據(jù)本發(fā)明的這種方法的第三步在于通過"短路徑"分子蒸餾提取該角鯊烯，以獲 得不含角鯊烯的提余液。
[0101] 該粗制的（或部分純化的）油的角鯊烯是通過分子蒸餾提取的。
[0102] 對于少于0. 1毫巴的真空，該角鯊烯的沸點是大約200°C。
[0103] 這種高真空使得能夠限制該溫度并且因此限制該角鯊烯以及這些多不飽和脂肪 酸的降解/聚合風(fēng)險。
[0104] 該 申請人:公司已發(fā)現(xiàn)，重要的是在該設(shè)備上將滯留時間調(diào)節(jié)到少于1分鐘的非常 短的時間。在本申請中，通常優(yōu)選理解的是，"短路徑"意指少于1分鐘的接觸時間。
[0105] 從而從氮惰性進(jìn)料池中，通過用恒溫器控制的在從25°C到150°C范圍中的一個第 一回路將該油泵到排氣器（去除水和溶劑的痕跡）。
[0106] 在排氣器出口，將該油泵入（"短路徑"）蒸發(fā)室以通向用恒溫器控制的在從50°C 至lj 150°C、優(yōu)選從100°C到140°C、特別是大約120°C的溫度范圍中的一個回路。
[0107] 在從150°C到250°C、優(yōu)選從200°C到240°C、特別是大約220°C的范圍中調(diào)節(jié)該蒸 發(fā)器的溫度。
[0108] 在從0到50°C、優(yōu)選10°C和30°C之間、特別是大約20°C的溫度范圍中調(diào)節(jié)該冷凝 器。
[0109] 將該蒸發(fā)室中的壓力調(diào)節(jié)到少于1(T2毫巴、優(yōu)選少于1(T3毫巴的高真空。
[0110] 通過這些收集回路將主要包含角鯊烯的蒸餾物和主要包含甘油三酸酯的殘余物 運送到惰性的儲存槽中。
[0111] 該提余液中的角鯊烯含量少于5 %，優(yōu)選少于2 %。
[0112] 去除角鯊烯使得能夠獲得感興趣的純化的級分（富含DHA的甘油三酸酯）（提余 液），然后其可進(jìn)入用于富集處于乙酯形式的DHA的操作的鏈中。
[0113] 該提余液具有包含按重量計的大約40 %的DHA的氨基酸譜。
[0114] 根據(jù)本發(fā)明的這種方法的第四步在于在堿性或酶催化劑、優(yōu)選酶催化劑的存在下 通過醇轉(zhuǎn)酯將所得到的提余液進(jìn)行轉(zhuǎn)酯。
[0115] 為了能夠富集DHA，必要的是分離連接到甘油酯骨架的脂肪酸，為了能夠隨后分離 DHA 鏈。
[0116] 從該甘油鏈分離這些脂肪酸的操作是優(yōu)先通過酶促乙醇轉(zhuǎn)酯（乙醇分解）進(jìn)行 的。
[0117] 該轉(zhuǎn)化伴隨著甘油的釋放。
[0118] 酶促乙醇分解是用來自諾維信公司的商業(yè)酶N 435(南極假絲酵母（Candida antartica))在50°C以化學(xué)計量比例的乙醇分批操作進(jìn)行的。
[0119] 在這些條件下，在大約8h的反應(yīng)中獲得大于90%的轉(zhuǎn)化度。
[0120] 在反應(yīng)結(jié)束時，這些脂肪酸主要分布在轉(zhuǎn)化為乙酯（超過90 % )的級分中，剩下的 保持殘余的甘油酯（單-二-三甘油酸酯）的形式。
[0121] 在進(jìn)行乙酯的分級之前，使在酶轉(zhuǎn)化結(jié)束時的反應(yīng)混合物經(jīng)歷過濾步驟，以提取 該酶。
[0122] 通過沉析或離心分離該甘油。還可將該混合物用水洗滌，以去除殘余的甘油。
[0123] 如果乙醇的殘余濃度高，可在真空下通過蒸發(fā)去除后者。
[0124] 根據(jù)本發(fā)明的這種方法的第五步在于通過"短路徑"分子蒸餾將步驟4)中獲得的 脂肪酸酯的混合物進(jìn)行分級，以獲得富含短鏈脂肪酸酯的提取物以及極富含長鏈脂肪酸酯 的提余液。
[0125] 如步驟4中所述獲得的乙酯的混合物具有對應(yīng)于起始的油并且因此除了感興趣 的DHA之外還包括脂肪酸的脂肪酸譜。
[0126] 該分級操作的目標(biāo)是去除具有短于（〈C 22)DHA的鏈的最大量的脂肪酸。
[0127] 用來進(jìn)行這一操作的蒸餾技術(shù)利用了這些乙酯的揮發(fā)性上的不同（這取決于它 們的分子量以及它們的脂肪鏈的長度）。
[0128] 如以上解釋的，高真空以及還有該技術(shù)的非常短的滯留時間（少于一分鐘）使得 能夠限制該溫度并且因此限制這些多不飽和脂肪酸的降解/聚合風(fēng)險。
[0129] 對于少于0. 1毫巴的真空，這些乙酯的沸點通常在250°C以下的溫度范圍內(nèi)。
[0130] 該操作實際上以兩步進(jìn)行：
[0131] _分子蒸餾的第一步是照這樣的分級，目標(biāo)是分離該"短鏈"乙酯級分，以相對于多 不飽和脂肪酸濃縮該殘余物，
[0132] -第二步代替地是純化步驟，在此意義上，相對于多不飽和脂肪酸濃縮的乙酯是從 重雜質(zhì)（殘余的甘油酯、留醇、顏料、不可皂化的化合物等）分離的。
[0133] 從氮惰性進(jìn)料池中，通過用恒溫器控制的在從25°C到100°C、例如從70°C到 100°C、特別地大約100°C范圍中的一個第一回路將從該乙醇分解中得到的混合物送到排氣 器（去除乙醇的痕跡）。
[0134] 在排氣器出口，通過用恒溫器控制的在從50°C到100°C、例如從70°C到90°C、特別 是大約85°C的溫度范圍中的一個回路將該油泵入（"短路徑"）蒸發(fā)室。
[0135] 將該蒸發(fā)室中的壓力調(diào)節(jié)到少于1(T2毫巴、優(yōu)選少于1(T3毫巴的高真空。
[0136] 在從0到50°C、優(yōu)選10°C和30°C之間、特別是大約20°C的溫度范圍中調(diào)節(jié)該冷凝 器。
[0137] 在從100°C到200°C、優(yōu)選100°C和150°C之間、特別是大約110°C的范圍中調(diào)節(jié)該 蒸發(fā)器的溫度。
[0138] 調(diào)節(jié)該溫度以獲得一種提余液/餾出物，重量比率對應(yīng)于理論預(yù)測，允許優(yōu)化多 不飽和脂肪酸純度和產(chǎn)率的分離。
[0139] 通過這些收集回路將主要包含"短鏈"乙酯的餾出物和主要包含"長鏈"乙酯的提 余液以及還有雜質(zhì)運送到惰性的儲存槽中。
[0140] 該提余液中的DHA乙酯含量（重量百分比）是大于45%，優(yōu)選大于50%。
[0141] 該餾出物中的DHA含量少于20%，優(yōu)選少于10%。
[0142] 根據(jù)本發(fā)明的這種方法的第六步在于通過"短路徑"分子蒸餾將步驟5)中獲得的 長鏈脂肪酸酯的混合物進(jìn)行純化，以獲得極富含長鏈酯的不含雜質(zhì)的提取物。
[0143] 從氮惰性進(jìn)料池中，通過用恒溫器控制的在從25°C到100°C、優(yōu)選從70°C到 100°C、特別地大約KKTC范圍中的一個第一回路將在步驟5)結(jié)束時獲得的提余液送到排 氣器。
[0144] 在排氣器出口，通過用恒溫器控制的在從50°C到150°C、例如從70°C到90°C、特別 是大約85°C的溫度范圍中的一個回路將該油泵入（"短路徑"）蒸發(fā)室。
[0145] 將該蒸發(fā)室中的壓力調(diào)節(jié)到少于1(T2毫巴、優(yōu)選少于1(T3毫巴的高真空。
[0146] 在從0到50°C、優(yōu)選10°C和30°C之間、特別是大約20°C的溫度范圍中調(diào)節(jié)該冷凝 器。
[0147] 在從100°C到250°C、優(yōu)選180°C和220°C之間、特別是大約200°C的范圍中調(diào)節(jié)該 蒸發(fā)器的溫度。調(diào)節(jié)該溫度以獲得一種殘余物/餾出物，重量比率對應(yīng)于理論預(yù)測，允許高 效分尚雜質(zhì)。
[0148] 通過這些收集回路將主要包含純化的"長鏈"乙酯的餾出物和包含雜質(zhì)的殘余物 運送到惰性的儲存槽中。
[0149] 該饋出物中的DHA乙酯含量（重量百分比）是大于50%，優(yōu)選大于55%。
[0150] 該殘余物中的DHA含量少于30%，優(yōu)選少于20 %。從而該殘余物濃縮了這些雜質(zhì) (不可皂化的化合物、殘余的甘油酯、顏料等）。
[0151] 根據(jù)本發(fā)明的這種方法的第七步在于任選地通過褪色和脫臭的一系列步驟，精煉 極富含長鏈酯級分的該提取物。
[0152] 盡管在第六步中純化了，如果必要可使富含DHA乙酯的提取物經(jīng)歷額外的精煉， 該額外的精煉由一個褪色步驟和一個脫臭步驟組成：
[0153] _ 一個褪色步驟，為了減少淺黃色的顏色。
[0154] 這一褪色步驟是經(jīng)漂白土例如活性炭，以類似于在精煉植物油中常規(guī)使用的褪色 的方式進(jìn)行。
[0155] _ 一個脫臭步驟，通過在真空下的汽提進(jìn)行。
[0156] 最后，根據(jù)本發(fā)明的方法的此第二優(yōu)先模式的第八步驟在于收集富含DHA乙酯 的、所得到的組合物。
[0157] 在控制氣氛（理想地用氮惰化的）下儲存由此純化的DHA乙酯。
[0158] 添加抗氧化劑可有利于這一級分的穩(wěn)定。
[0159] 本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的富含DHA乙酯的組合物在食品行業(yè)中的 用途。
[0160] 本發(fā)明將通過以下實例更清楚地被理解，這些實例意為說明性的和非限制性的。
[0161] 實例1:從裂殖壺菌CNCM 1-4469菌株制備包含按總脂肪酸的重量計30 %和45% 之間的DHA和按重量計10%和30%之間的不可皂化的化合物（包括15%至25%角鯊烯） 的一種油。
[0162] 這個實例說明了用于獲得一種粗制油的方法，該油包含DHA和基本上由角鯊烯組 成的不可皂化的化合物的混合物，該油通過發(fā)酵屬于本 申請人:公司的微藻裂殖壺菌（于 2011年4月14日保藏在法國巴斯德研究所的國家微生物保藏中心[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes]，保藏號 CNCM 1-4469)產(chǎn)生。
[0163] 在這種情況下，發(fā)酵在201反應(yīng)器中實際培養(yǎng)/生產(chǎn)階段之前以兩個先前的連續(xù) 的預(yù)培養(yǎng)階段進(jìn)行。
[0164] 為了本實驗，在第一個預(yù)培養(yǎng)介質(zhì)內(nèi)添加了維生素類，但是在第二個預(yù)培養(yǎng)介質(zhì) 中和在生產(chǎn)中添加維生素類是任選的。
[0165] 因此預(yù)培養(yǎng)介質(zhì)具有下面表I和II中示出的組成：
[0166] 表 I
【權(quán)利要求】
1. 一種用于制備由發(fā)酵微生物產(chǎn)生的、富含二十二碳六烯酸（DHA)乙酯的油的方法， 其特征在于，所述方法包括通過"短路徑"分子蒸餾進(jìn)行的純化步驟。
2. 如權(quán)利要求1所要求的方法，其特征在于，所述些微生物是屬于破囊壺菌目 (Thraustochytriales sp.)家族的微藻。
3. 如權(quán)利要求1和2中任一項所要求的方法，其特征在于，所述屬于破囊壺菌目 (Thraustochytriales sp.)家族的微藻是以下物種的微藻：裂殖壺菌屬（Schizochytrium sp.)、澄黃壺菌屬（Aurantiochytrium sp.)以及破囊壺菌屬（Thraustochytrium sp.)。
4. 如權(quán)利要求1到3中任一項所要求的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 從破囊壺菌目家族的微藻的發(fā)酵制備包含以下物質(zhì)的混合物的粗制油：富含DHA的 甘油三酸酯和基本上由角鯊烯組成的不可皂化的化合物， 2) 任選地通過脫膠、脫酸、褪色和脫臭的一系列步驟，精煉所得到的粗制油， 3) 通過"短路徑"分子蒸餾提取該角鯊烯，以獲得不含角鯊烯的提余液， 4) 在堿性或酶催化劑、優(yōu)選酶催化劑的存在下通過醇轉(zhuǎn)酯將所得到的提余液進(jìn)行轉(zhuǎn) 酯， 5) 通過"短路徑"分子蒸餾將步驟4)中的脂肪酸酯的混合物進(jìn)行分級，以獲得富含短 鏈脂肪酸酯的提取物以及極富含長鏈脂肪酸酯的提余液， 6) 通過"短路徑"分子蒸餾將步驟5)中獲得的長鏈脂肪酸酯的混合物進(jìn)行純化，以獲 得極富含長鏈酯的不含雜質(zhì)的提取物， 7) 任選地，通過褪色和脫臭的一系列步驟，精煉極富含長鏈酯級分的該提取物， 8) 收集所得到的富含DHA乙酯的化合物。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一項所要求的方法，其特征在于該分子蒸餾步驟是在少于 〇. 1毫巴的值的高真空下進(jìn)行。
6. 如權(quán)利要求1和5中任一項所要求的方法，其特征在于該"短路徑"意指接觸持續(xù)時 間少于1分鐘。
7. 通過前述權(quán)利要求中任一項獲得的富含DHA乙酯的組合物在食品行業(yè)中的用途。
【文檔編號】A23D9/02GK104394702SQ201380028599
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月29日
【發(fā)明者】塞繆爾·帕蒂尼爾, 菲利皮·盧騰 申請人:羅蓋特兄弟公司