一株可高效表達(dá)外源分泌蛋白酶的枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株可高效表達(dá)外源分泌蛋白酶的枯草芽孢桿菌。一個表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌，該表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌中兩種外分泌蛋白酶---枯草桿菌堿性蛋白酶的基因apr和枯草芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的基因npr以及產(chǎn)孢子基因spoIIAC被敲除。所得到的枯草芽孢桿菌宿主菌能夠應(yīng)用于基因工程手段高產(chǎn)外源蛋白。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明成功構(gòu)建了一株分泌普魯蘭酶的基因工程菌，能夠高產(chǎn)普魯蘭酶，經(jīng)過發(fā)酵工業(yè)研究在工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣闊的發(fā)展前景。
【專利說明】一株可高效表達(dá)外源分泌蛋白酶的枯草芽孢桿菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一株可高效表達(dá)外源分泌蛋白酶的枯草芽孢桿菌。

【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌在生物工程和酶制劑工業(yè)中是一種極其重要的出發(fā)菌種。如今，它的理化特性已知，基因改造方法也已比較成熟；另外它是美國FDA承認(rèn)的非致病菌種，可廣泛用于食品工業(yè)相關(guān)酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)?？莶菅挎邨U菌的自然菌種具有較高的外分泌蛋白酶的濃度，大大限制了它在發(fā)酵工程中的應(yīng)用，特別是一些對蛋白酶敏感的酶種。本發(fā)明利用基因工程的手段構(gòu)建了一株外源分泌蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌，另外，為了適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵，調(diào)控產(chǎn)孢子基因sigF也被敲除。為了證明該方案的有效性，我們以該基因工程菌為母株構(gòu)建了一株產(chǎn)普魯蘭酶的工程菌，并經(jīng)發(fā)酵研究獲得了酶的高效表達(dá)。
[0003]普魯蘭酶(pullulan6_glucanohydrolases，EC3.2.1.41)是一類脫支酶，它可以特異的水解淀粉、支鏈淀粉中的α-1，6_糖苷鍵。淀粉必須先在淀粉酶的水解作用下切開α -1, 4-糖苷鍵變成麥芽糊精，再在普魯蘭酶的作用下轉(zhuǎn)化成葡萄糖或者麥芽糖。
[0004]目前已經(jīng)從植物和微生物中發(fā)現(xiàn)了很多產(chǎn)生糖化酶和支鏈淀粉酶的物種，在微生物領(lǐng)域已報道產(chǎn)生普魯蘭酶的菌種:包括肺炎克雷柏氏菌、芽孢桿菌、高溫放線菌等。其中從嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(bacillus acidopulluticus)中得到的普魯蘭酶最具商業(yè)價值。這些分離的普魯蘭酶具有如下特征:耐低PH值；最佳酶活條件在65°C。這些特性與糖化生產(chǎn)工業(yè)中的標(biāo)準(zhǔn)糖化條件完美匹配。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一個表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供該枯草芽孢桿菌宿主菌的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的又一目的是提供利用該枯草芽孢桿菌宿主菌構(gòu)建的高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株。
[0008]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0009]一個表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌,該表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌中兩種外分泌蛋白酶一枯草桿菌堿性蛋白酶的基因aprE和枯草芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的基因nprE以及調(diào)控產(chǎn)孢子基因sigF被敲除。
[0010]其中，所述的aprE基因敲除后aprE位點序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]所述的nprE基因敲除后nprE位點序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]所述的sigF基因敲除后sigF位點序列如SEQ ID N0.4所示。
[0013]本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌宿主菌在通過基因工程手段表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。
[0014]一株高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株，用普魯蘭酶基因表達(dá)框來代替所述的表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌基因組原有α -淀粉酶基因amyE表達(dá)框。
[0015]其中，所述的普魯蘭酶基因表達(dá)框:
[0016](I)該表達(dá)框架使用大腸桿菌/芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pYF - tsDE，整個普魯蘭酶表達(dá)框利用重組技術(shù)環(huán)化被BglII線性化的pYF - tsDE質(zhì)粒，構(gòu)建好的溫敏型質(zhì)粒命名為PYF - tsINT -pul ;所述的 PYF - tsDE 質(zhì)粒，其構(gòu)建方法:pUC57 -KS -erm (質(zhì)粒由 Genscript公司提供)經(jīng)由Bgl II酶切后，回收3.Skbp的片段再用T4連接酶(NEB公司提供)自連。這個自連而得到的3.8kbp的質(zhì)粒命名為pYF -tsDE。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10增殖后作為下面所有的基因操作的骨架。
[0017](2)該表達(dá)框架具有來自于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的三個串聯(lián)重復(fù)天然啟動子，見 SEQ ID N0.5 ；
[0018](3)該表達(dá)框架含有合成核糖體結(jié)合位點序列，見SEQ ID N0.6 ；
[0019](4)該表達(dá)框架普魯蘭酶基因來源于嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(B.acidopulluticus)，見 SEQ ID N0.1 ；
[0020](5)該表達(dá)框架含有合成的終止子序列，見SEQ ID N0.7 ；
[0021 ] (6)該表達(dá)框架在普魯蘭酶編碼基因的起始密碼子上游插入了一個強(qiáng)自然信號肽序列，見 SEQID N0.8 ；
[0022](7)在構(gòu)建的工程菌中，該表達(dá)框架用普魯蘭酶基因表達(dá)框來代替原有淀粉酶基因表達(dá)框。
[0023]所述的普魯蘭酶基因表達(dá)框中的普魯蘭酶基因來源于嗜酸普魯蘭芽胞桿菌，序列為 SEQID N0.1。
[0024]所述的高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包含如下步驟:
[0025](I)敲除枯草芽孢桿菌中堿性蛋白酶aprE和中性金屬蛋白酶nprE的兩個外分泌蛋白酶以及調(diào)控產(chǎn)孢子基因sigF ；
[0026](2)選定了幾組控制普魯蘭酶表達(dá)必須的序列如SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6，SEQID N0.7，SEQ ID N0.8所示，將上述序列及普魯蘭酶基因序列如SEQ ID N0.1所示按照啟動子，核糖結(jié)合位點，強(qiáng)自然信號肽序列，普魯蘭酶基因序列和合成終止子序列無縫串聯(lián)得到普魯蘭酶基因表達(dá)框；
[0027](3)選定枯草芽孢桿菌中原有α -淀粉酶基因amyE為新質(zhì)粒的插入位點,將amyE基因上游同源片段(SEQ ID N0.10)和下游同源片段(SEQ ID N0.11)通過直接合成手段加到普魯蘭酶表達(dá)框兩側(cè)；將所得序列組裝到線性化的pYF-tsDE質(zhì)粒，構(gòu)建好的溫敏型質(zhì)粒命名為 PYF - tsINT - pul ；
[0028](4)將(3)中所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化至(I)中蛋白酶敲除、不產(chǎn)孢子的枯草芽孢桿菌中，用普魯蘭酶基因表達(dá)框來代替原有α -淀粉酶基因amyE表達(dá)框；
[0029](5)通過紅色普魯蘭平板觀察透明消化圈確認(rèn)是否成功構(gòu)建了普魯蘭酶產(chǎn)生菌株;
[0030](6) PCR結(jié)果進(jìn)一步表明表達(dá)框確實插入設(shè)定位點。
[0031]有益效果:
[0032]本發(fā)明提供了一個表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌，利用原產(chǎn)a -淀粉酶的枯草芽孢桿菌(CICC20632，中國微生物菌種庫購得)為原始菌種，敲除了枯草芽孢桿菌基因組中影響異種酶分泌的枯草桿菌堿性蛋白酶的基因aprE和枯草芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的基因nprE以及調(diào)控產(chǎn)孢子基因sigF，所得到的枯草芽孢桿菌宿主菌能夠應(yīng)用于基因工程手段高產(chǎn)外源蛋白。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明成功構(gòu)建了一株分泌普魯蘭酶的基因工程菌，能夠高產(chǎn)普魯蘭酶，經(jīng)過發(fā)酵工業(yè)研究在工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣闊的發(fā)展前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1pYF - tsDE 質(zhì)粒圖譜。
[0034]圖2pUC57 - KS - erm 質(zhì)粒圖譜。
[0035]圖3敲除aprE, nprE及sigF的枯草桿菌細(xì)胞PCR鑒定結(jié)果。
[0036]泳道I和2:BSA4用兩邊的引物擴(kuò)增aprE敲除情況；泳道3: BSwt擴(kuò)增AprE ;泳道5和6:BSA4用兩邊的引物擴(kuò)增sigF敲除情況;泳道7: BSwt擴(kuò)增sigF ;泳道9和10:BS Δ 4用兩邊的引物擴(kuò)增nprE敲除情況；泳道11:1^￥1:擴(kuò)增nprE ;泳道4、8、12:天根markerlll。

【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合實例對本發(fā)明的構(gòu)建過程做進(jìn)一步闡釋，下述說明中相關(guān)實例是說明性質(zhì)的，不能限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0038]一株高產(chǎn)普魯蘭酶的基因工程菌，利用原產(chǎn)a -淀粉酶的枯草芽孢桿菌(CICC20632，中國微生物菌種庫購得)為原始菌種，構(gòu)建新型高產(chǎn)菌株。在本發(fā)明中，枯草芽孢桿菌用于基因操作的受體菌株。目前，外源載體轉(zhuǎn)化枯草桿菌菌株的技術(shù)已經(jīng)很成熟，如感受態(tài)化學(xué)轉(zhuǎn)化法，電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，都可以成功實現(xiàn)枯草桿菌的基因?qū)?。本發(fā)明中，一個普魯蘭酶表達(dá)框被成功整合到枯草桿菌的基因組中，成功表達(dá)了普魯蘭酶。普魯蘭酶表達(dá)框主要包含以下幾個部分:一個或多個天然啟動子串聯(lián)在一起，一個合成的核糖體結(jié)合位點，一個高效的信號肽序列，一個普魯蘭酶編碼基因和一個合成的轉(zhuǎn)錄終止子。這樣的設(shè)計大大提高了宿主菌的基因表達(dá)水平和普魯蘭酶分泌水平。將普魯蘭酶編碼基因插入指定的枯草桿菌染色體位點可通過質(zhì)粒介導(dǎo)的單交換同源重組來實現(xiàn)?？莶輻U菌蛋白酶aprE和枯草芽孢桿菌中性金屬蛋白酶nprE這2個主要的胞外蛋白酶的基因被預(yù)先刪除，使普魯蘭酶基因得以高效地完全表達(dá)。
[0039]實施例1.PYF - tsDE質(zhì)粒的構(gòu)建
[0040]pYF - tsDE (圖1)是發(fā)明人設(shè)計的大腸桿菌/芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒。其構(gòu)成主要包括在30°C有復(fù)制活性的熱敏的復(fù)制起點和紅霉素抗性基因。紅霉素抗性濃度在大腸桿菌中為300ug/ml ;在枯草桿菌中的濃度為5ug/ml。37°C時，質(zhì)粒的復(fù)制起點無法復(fù)制從而使得質(zhì)粒通過設(shè)計的位點融入宿主基因組中并通過紅霉素抗性基因進(jìn)行篩選。pYF - tsDE質(zhì)粒的構(gòu)建描述如下:
[0041]pUC57 -KS- erm (質(zhì)粒由 Genscript 公司構(gòu)建)(圖 2,序列見 SEQ ID N0.9)經(jīng)由BglII酶切后，回收3.8kbp的片段再用T4連接酶(NEB公司提供)自連。這個自連而得到的3.8kbp的質(zhì)粒命名為pYF -tsDE。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10增殖后作為下面所有的基因操作的骨架。
[0042] 實施例2.構(gòu)建外源分泌蛋白酶及產(chǎn)孢子缺失的枯草芽孢桿菌菌株
[0043]枯草桿菌本身的胞外蛋白酶活性對異種酶的分泌是不利的。已經(jīng)證實的兩種胞外蛋白酶:枯草桿菌堿性蛋白酶aprE和枯草桿菌中性金屬蛋白酶nprE構(gòu)成了枯草桿菌85%的胞外蛋白酶活性。此外，產(chǎn)生芽孢在發(fā)酵過程中能形成休眠細(xì)胞這將導(dǎo)致生產(chǎn)效率成倍的降低。sigF基因編碼控制芽孢形成的sigma -F因子，該因子在指導(dǎo)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄和表達(dá)產(chǎn)物在芽孢形成的專一性起關(guān)鍵作用。
[0044]本發(fā)明里，以上3個基因的刪除都是以順序方向由單一交叉的坎貝爾類型機(jī)制通過同源插入目的基因中。具體操作如下:
[0045]2.1pYF - tsDE經(jīng)由BglII酶切后用CIP處理來抑制自連；
[0046]2.2基因敲除
[0047](I)為了能夠獲得每個基因缺失片段，以枯草桿菌基因組DNA為模板用PCR的方法從要缺失的基因兩側(cè)各擴(kuò)增大約500bp的同源序列?？莶菅挎邨U菌的單克隆經(jīng)過98°C，5分鐘預(yù)變性后可以作為基因組DNA模板直接在PCR反應(yīng)中使用。
[0048]用于PCR反應(yīng)的引物是由Genscript公司合成的。引物序列如下:
[0049]擴(kuò)增apr基因上游序列的引物為:
[0050]pksb - apr - czFl GGTATCGATAAGCTTCCTGCAGATCTCTCAGGAGCATTTAACCT
[0051]pksb - apr - Rl GCACCTACTGCAATAGTAAGGAACAGATTGCGCAT
[0052]擴(kuò)增apr基因下游序列的引物為:
[0053]pksb - apr - F2 ATGCGCAATCTGTTCCTTACTATTGCAGTAGGTGC
[0054]pksb - apr - czR2 AATATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTCTAATGCTGTCTCGCGTT
[0055]擴(kuò)增npr基因上游序列的引物為:
[0056]pksb - npr - czFl GGTATCGATAAGCTTCCTGCAGATCTCATCTTCCCCTTGAT
[0057]pksb - npr - Rl CAGTCTTCTGTATCGTTACGCTTTTAATTCGGCT
[0058]擴(kuò)增npr基因下游序列的引物為:
[0059]pksb - npr - F2AGCCGAATTAAAAGCGTAACGATACAGAAGACTG
[0060]pksb - nprcz - R2 TATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTCCTGGCCAGGAGAATCT
[0061]擴(kuò)增s i g基因上游序列的引物為:
[0062]pksb - sig - czFl GGTATCGATAAGCTTCCTGCAGGAACAATCTGAACAGCAGGCACTC
[0063]pksb - sig - Rl TTGTCAAACCATTTTTCTTCGCCCGATGCAGCCGATCTG
[0064]擴(kuò)增s i g基因下游序列的引物為:
[0065]pksb - sig - F2 CAGATCGGCTGCATCGGGCGAAGAAAAATGGTTTGACAA
[0066]pksb - sig - czR2 ATATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTGTTCATGATGGCAAGACAC
[0067]PCR擴(kuò)增體系為50ul，反應(yīng)程序如下:
[0068](I)枯草芽孢桿菌B.subtilisl68單克隆預(yù)變性98°C，8分鐘；
[0069](2)96°C,15 秒;
[0070](3)58°C，15 秒;
[0071](4)72°C，30 秒；重復(fù) 2 - 4 步驟 25 - 30 次；
[0072](5)終延伸 72°C，2 分鐘。
[0073]PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖膠電泳檢測后用愛思進(jìn)試劑盒純化。
[0074]2.3重疊PCR方法擴(kuò)增內(nèi)部大約400 - 500bp序列缺失的目的基因
[0075]基因內(nèi)部缺失片段是用重疊PCR方法(overlap extens1n PCR，S0E)獲得的，具體操作如下:
[0076](I)分別回收2.2中各基因上游、下游PCR片段并純化；
[0077](2)以各目的基因的上、下游同源序列片段1:1摩爾比混合后作為模板，用引物XX-CZ- Fl和XX-CZ- R2 (“XX”代表apr、npr或sig) PCR擴(kuò)增獲得內(nèi)部缺失片段的aprE基因、nprE基因或sigF基因。
[0078]上述片段隨后用Clone - EZ克隆試劑盒(Genscript公司提供)重組進(jìn)經(jīng)過BglII線性化的pYF -tsDE載體中，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為:pYF - tsDE -Apr, pYF - tsDE -Npr, pYF -1sDE -SpoII。這些重組質(zhì)粒為溫敏型質(zhì)粒，其中包含的apr基因、npr基因或spo基因相對于完整基因來說缺失了內(nèi)部大約400 - 500bp的序列。
[0079]不同等位基因的替換可通過同源重組來實現(xiàn)。方法參見CN102124112A，也可使用本領(lǐng)域的其他公知的同源重組的方法。
[0080]2.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0081]本實驗采用將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草桿菌感受態(tài)細(xì)胞中方法及篩選過程如下:
[0082](I)將溫敏型質(zhì)粒 PYF - tsDE - Apr, pYF - tsDE - Npr, pYF - tsDE - Sig 轉(zhuǎn)化枯草桿菌(CICC20632)感受態(tài)細(xì)胞；
[0083](2)在30°C的條件下，在LB (每升含蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉1g)培養(yǎng)基上用紅霉素(5ug/ml)抗性來篩選陽性克隆菌株；
[0084](2)再將陽性克隆菌株轉(zhuǎn)移到37°C的條件下培養(yǎng)，使該溫敏質(zhì)粒能夠融合到宿主基因組上。為了使基因在設(shè)定的位點發(fā)生替換，挑選幾個克隆同時接種于2XYT培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)24小時后重新繼代一次，整個過程繼代4 - 5次(一般需要5 - 7天)。
[0085](3)篩選紅霉素敏感的枯草桿菌細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定.可同時用1%的脫脂牛奶LB平板觀察透明水解圈，敲除后的菌種應(yīng)顯示顯著縮小的水解圈。
[0086]鑒定所用PCR引物:
[0087]aprE:00131 - seqFl/00131 - seqR3
[0088]sigF:00309 - seqFl/00309 - seqR3
[0089]nprE:00327 - seqFl/00327 - seqR3
[0090]00131 - SeqFl:TTGCTTGGCGAATGTTCATC
[0091]00131 - SeqR3:GCGCTGAATGCCTATGTTAC
[0092]00309 - seqFl:TCGTGCTGAACTTGGAGGAC
[0093]00309 - seqR3:GCATGGCCACATATTGATCG
[0094]00327 - SeqFl:CGCCAGAACAACAATTGACC
[0095]00327 - SeqR3:GAGACGTTAAGCTGGACTCA
[0096]PCR鑒定結(jié)果見圖3。由圖3可知最后獲得的枯草芽孢桿菌陽性克隆中aprE、nprE及sigF基因已被敲除?；蚯贸?，aprE, sigF及nprE位點序列依次見SEQ ID N0.2, SEQID N0.3 和 SEQ ID N0.4。
[0097]實施例3.普魯蘭酶產(chǎn)生菌株構(gòu)建
[0098]3.1普魯蘭酶表達(dá)框架構(gòu)建
[0099]一個典型的普魯蘭酶表達(dá)框有以下幾個部分構(gòu)成:
[0100](I)兩至三個串聯(lián)天然啟動子(可選用來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)天然啟動子)；序列為SEQ ID N0.5 ；
[0101](2)合成的核糖體結(jié)合位點序列，見SEQ ID N0.6 ；
[0102](3)該表達(dá)框架在普魯蘭酶編碼基因的起始密碼子上游插入了一個強(qiáng)自然信號肽序列，見 SEQ ID N0.8 ；
[0103](4)該表達(dá)框架普魯蘭酶基因來源于嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(B.acidopulluticus)，見 SEQ IDN0.1 ；
[0104](5)該表達(dá)框架含有合成的終止序列，見SEQ ID N0.7 ；
[0105]上述序列的合成由Genscript公司來完成，將上述序列依次無縫串聯(lián)得到普魯蘭酶表達(dá)框。本框架中信號肽序列是從枯草芽孢桿菌中篩選出的，能夠有效的提高酶的分泌。
[0106]選定α -淀粉酶基因amyE為新質(zhì)粒的插入位點，將amyE基因上下游同源片段(SEQ IDN0.10&SEQ ID N0.11)分別通過基因合成的手段加到普魯蘭酶表達(dá)框兩側(cè)。上述序列的合成和質(zhì)粒構(gòu)建都是由Genscript公司來完成的。
[0107]3.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0108]將上述整個普魯蘭酶表達(dá)框(包含amyE基因上下游同源片段)利用重組技術(shù)環(huán)化BglII線性化的pYF - tsDE質(zhì)粒(重組試劑盒由Genscript公司提供),構(gòu)建好的溫敏型質(zhì)粒命名為pYF - tsINT - puL.該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化至蛋白酶基因敲除、不產(chǎn)孢子的枯草芽孢桿菌中，用普魯蘭酶基因表達(dá)框來代替原有淀粉酶基因表達(dá)框。
[0109]3.3紅色普魯蘭平板確認(rèn)
[0110]工程菌劃線遞傳兩代，通過紅色普魯蘭平板(1%蛋白胨，0.1%氯化氨，0.l%Sigma普魯蘭，2%瓊脂粉)觀察透明消化圈確認(rèn)是否成功構(gòu)建了普魯蘭酶產(chǎn)生菌株。
[0111]3.4PCR 驗證
[0112]挑取經(jīng)紅色普魯蘭確認(rèn)的陽性克隆，經(jīng)PCR及測序驗證，鑒定所用PCR上游引物是由插入位點的基因組上游固有序列和表達(dá)框內(nèi)部序列組成，鑒定所用PCR下游引物是由表達(dá)框內(nèi)部序列和插入位點的基因組下游固有序列組成，引物序列如下:
[0113]0531 - SeqFl GAAGCTGGCTTACAGAAGAG
[0114]0531 - SeqRl CCGGTCGCTACCATTACCAG
[0115]0531 - SeqF2 CGCAAGTGTACAGGCAGGTG
[0116]0531 - SeqR2 CCTTCCAGGGTATGTTTCTCTT
[0117]由0531 - SeqFl/0531 - SeqRl 擴(kuò)增后測序結(jié)果如 SEQ ID N0.12 所示，由0531 - SeqF2/0531 - SeqR2擴(kuò)增后測序結(jié)果如SEQ ID N0.13所示，PCR結(jié)果進(jìn)一步表明表達(dá)框確實插入設(shè)定位點。
[0118]實施例4、高產(chǎn)普魯蘭酶的發(fā)酵工藝
[0119]1.選用高產(chǎn)實施例3構(gòu)建成功的普魯蘭酶的枯草桿菌工程菌001BS -1I1- C - 10為試驗株。對照菌種為以pYF-tsINT -pul轉(zhuǎn)化的野生菌種為出發(fā)菌株，該菌種只含普魯蘭酶表達(dá)框，枯草桿菌堿性蛋白酶的基因aprE和枯草芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的基因nprE以及調(diào)控產(chǎn)孢子基因sigF，未被敲除。
[0120]2.培養(yǎng)基組份(g/L)
[0121]A.斜面培養(yǎng)基:
[0122]胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，瓊脂粉20，自然pH，37°C培養(yǎng)8小時
[0123]B.種子培養(yǎng)基(g/L)
[0124]麥芽糖漿40.0，蛋白胨20.0，酵母粉1.0，磷酸二氫鉀6.0，37°C，220rpm培養(yǎng)16小時
[0125]C.發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)
[0126]麥芽糖漿60.0，蛋白胨10.0，酵母粉10.0，磷酸二氫鉀2.0，自然pH
[0127]D.補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)
[0128]麥芽糖漿480.0，蛋白胨60.0，酵母粉80.0
[0129]3.工藝
[0130]A.選用10升自控發(fā)酵罐，初始裝液量為5升，接種量2.5% (v/v)初始攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，通風(fēng)量為1: 0.5，在培養(yǎng)過程中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通風(fēng)量，使溶氧不小于30%，直至發(fā)酵結(jié)束。
[0131]B.從4h開始補(bǔ)料，直至發(fā)酵結(jié)束。
[0132]C.工程菌001BS -1I1-C-10生產(chǎn)與產(chǎn)酶情況(表1)
[0133]表1生長與產(chǎn)酶
[0134]

【權(quán)利要求】
1.一個表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌，其特征在于該表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌中兩種外分泌蛋白酶---枯草桿菌堿性蛋白酶的基因aprE和枯草芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的基因nprE以及調(diào)控孢子形成的sigma-F因子基因sigF被敲除。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌，其特征在于所述的aprE基因敲除后aprE位點序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌，其特征在于所述的nprE基因敲除后nprE位點序列如SEQ ID N0.3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌，其特征在于所述的sigF基因敲除后sigF位點序列如SEQ ID N0.4所示。
5.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌宿主菌在通過基因工程手段表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。
6.一株高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株，其特征在于用普魯蘭酶基因表達(dá)框來代替權(quán)利要求I所述的表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌基因組原有α -淀粉酶基因amyE表達(dá)框。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株，其特征在于所述的普魯蘭酶基因表達(dá)框: Cl)該表達(dá)框架具有來自于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的三個串聯(lián)重復(fù)天然啟動子,序列如SEQ ID N0.5所示； (2)該表達(dá)框架含有合成核糖體結(jié)合位點序列如SEQID N0.6所示； (3)該表達(dá)框架普魯蘭酶基因來源于嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(B.acidopulluticus)，序列如 SEQ IDN0.1 所示； (4)該表達(dá)框架含有合成的終止子序列如SEQID N0.7所示； (5 )該表達(dá)框架在普魯蘭酶編碼基因的起始密碼子上游插入了一個強(qiáng)自然信號序列如SEQ IDN0.8 所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株，其特征在于所述的來自于枯草芽孢桿菌(B.subtilis),地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的三個串聯(lián)重復(fù)天然啟動子、核糖體結(jié)合位點、強(qiáng)自然信號序列、普魯蘭酶基因、終止子依次無縫串聯(lián)得到普魯蘭酶基因表達(dá)框。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株，其特征在于將SEQID N0.10所示的amyE基因上游同源片段和SEQ ID N0.11所示的下游同源片段分別加到普魯蘭酶表達(dá)框兩側(cè)；所得序列利用重組技術(shù)環(huán)化被BglII線性化的pYF - tsDE質(zhì)粒，得質(zhì)粒PYF - tsINT - pul ;將質(zhì)粒pYF - tsINT - pul轉(zhuǎn)化至權(quán)利要求1所述的表達(dá)外源蛋白的枯草芽孢桿菌宿主菌中，得高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株。
10.權(quán)利要求6所述的高產(chǎn)普魯蘭酶基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包含如下步驟: (1)敲除枯草芽孢桿菌中堿性蛋白酶aprE和中性金屬蛋白酶nprE的兩個外分泌蛋白酶基因以及調(diào)控產(chǎn)孢子基因sigF ； (2)獲得普魯蘭酶表達(dá)框:由啟動子、核糖體結(jié)合位點、強(qiáng)自然信號序列、普魯蘭酶基因、終止子依次無縫串聯(lián)得到；優(yōu)選由SEQ ID N0.5所示的來自于枯草芽孢桿菌(B.subtilis),地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的三個串聯(lián)重復(fù)天然啟動子、SEQ ID N0.6所示的核糖體結(jié)合位點、SEQ ID N0.7所示的強(qiáng)自然信號序列、SEQ ID N0.1所示的普魯蘭酶基因以及SEQ ID N0.8所示的終止子依次無縫串聯(lián)得到。 (3)選定枯草芽孢桿菌中原有α-淀粉酶基因amyE為新質(zhì)粒的插入位點，將SEQ IDN0.10所示的amyE基因上游同源片段和SEQ ID N0.11所示的下游同源片段分別加到普魯蘭酶表達(dá)框兩側(cè)；所得序列利用重組技術(shù)環(huán)化被BglII線性化的pYF - tsDE質(zhì)粒，得質(zhì)粒PYF - tsINT - pul ； (4)將(3)中所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化至(I)中蛋白酶敲除、不產(chǎn)孢子的枯草芽孢桿菌中，用普魯蘭酶基因表達(dá)框來代替原有α -淀粉酶基因amyE表達(dá)框； (5)通過紅色普魯蘭平板觀察透明消化圈確認(rèn)是否成功構(gòu)建了普魯蘭酶產(chǎn)生菌株； (6)PCR結(jié)果進(jìn)一步表明表達(dá)框確實插入設(shè)定位點。
【文檔編號】C12R1/125GK104073458SQ201310100812
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月26日
【發(fā)明者】范巖, 陸亞敏, 杜秀貞, 杜華東, 付奇, 喬賓福 申請人:南京金斯瑞生物科技有限公司