一株枯草芽孢桿菌工程菌及其應用的制作方法

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本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種及工業品的微生物發酵制備，尤其涉及一株枯草芽孢桿菌工程菌及其應用。

背景技術：

D-核糖是一種五碳糖，是生命遺傳物質核糖核酸以及生理活性物質ATP、NADH、NADPH、FADH的重要組成部分，是生物體內能量代謝的主要參與者，具有重要的生理功能。

D-核糖在工業中主要用于核黃素維生素B₂以及食品鮮味劑的生產，近年來，更多的研究已將D-核糖可作為醫藥中間體，用于抗病毒、抗腫瘤藥物的合成，另外，D-核糖還可以作為輔助藥物用于治療心肌局部缺血、過度勞損引起的肌肉僵硬、肌肉酸痛等病癥。

D-核糖的生產方法包括從酵母核酸中提取、化學合成法以及利用微生物菌株發酵轉化。提取法和化學合成生產D-核糖因為生產效率低、工藝復雜等諸多原因始終沒有形成規?；a。微生物發酵法生產D-核糖生產效率高、工藝簡便、生產成本低，使D-核糖價格大幅度下降，真正實現了D-核糖規?；a。

D-核糖生產菌株多是通過傳統誘變篩選轉酮酶缺陷型突變株。1970年Sasajima等人發現一株枯草芽孢桿菌轉酮酶缺失突變株積累D-核糖，產量達35g/L，并且發現一株轉酮酶缺失回復突變株不再積累D-核糖，證明D-核糖積累是由于轉酮酶缺失造成的(Sasajima K et al.Agric Biol Chem,35(4),509-517,1971)。

3-羥基丁酮是一種廣泛應用的食用香料，此外，3-羥基丁酮作為一種中間體化合物，廣泛應用于制藥、化工和日化食品等領域。3-羥基丁酮和D-核糖的生產方式包括化學合成、酶法合成和微生物工業發酵制備，其中以糖原為原料的微生物發酵法制備具有良好的工業應用前景而收到廣泛關注?，F有技術中實現3-羥基丁酮和D-核糖聯產微生物發酵法較少，其中CN10197444A公開了一種高產D-核糖且聯產3-羥基丁酮的枯草芽孢桿菌，該菌株實在轉酮酶缺陷菌株的基礎上二次誘變得到的，其3-羥基丁酮和D-核糖的產量均較高，但誘變的方式獲得同樣性能的菌株較難實現，如何實現3-羥基丁酮和D-核糖的高效聯產，仍是本領域技術人員面臨的主要問題。

技術實現要素：

發明人前期通過傳統誘變的手段選育獲得一株轉酮酶缺失突變株SFR-4，經條件優化后該菌株D-核糖產率可達到62.3g/L(趙祥穎等,食品與藥品,7(3):23-26,2005)，然而發明人進一步研究發現由于隨機誘變產生的負突變積累，菌株SFR-4環境耐受性較差，在工業生產過程中存在較大的染菌風險，這成為限制該菌株D-核糖發酵效率提升、降低成本的一個重要原因。

針對現有技術存在的上述問題，尤其是針對發現的菌株SFR-4環境耐受性較差、生產過程中存在較大的染菌風險的問題，本發明提供一株抗逆性強、不易染菌的D-核糖發酵的枯草芽孢桿菌工程菌，本發明基于現有傳統誘變選育獲得轉酮酶缺陷型D-核糖高產枯草芽孢桿菌抗逆性差的問題，通過分子生物學手段獲得一株高產D-核糖菌株，同時具有抗逆性好、耗糖速度快的特點。此外，本發明的目的還在于提供該枯草芽孢桿菌工程菌發酵生產D-核糖和/3-羥基丁酮的應用和發酵方法。

發明人將菌株SFR-4進行了全基因組測序，針對測序結果，發明人偶然發現菌株SFR-4與另一株發明人篩選的積累3-羥基丁酮的枯草芽孢桿菌菌株SFA-H43(趙祥穎等，一株產3-羥基丁酮的芽孢桿菌及其應用，中國專利CN 103333842A，保藏號CCTCC No:M2013181)基因組功能基因組成高度相似，而與枯草芽孢桿常用168菌株比較差異相對較大(見附圖1)。

進一步的，通過對三菌株的轉酮酶基因比對，發現SFR-4菌株轉酮酶基因的后50bp基因序列較SFA-H43菌株發生了明顯變異(見附圖2)。發明人通過對兩株菌(SFR-4、SFA-H43)進行比較研究，發現菌株SFA-H43對環境的耐受力比菌株SFR-4強，且生長旺盛，耗糖速度快，發酵過程不易染菌?；谏鲜龇治觯l明人大膽預期，如果將菌株SFA-H43正常的轉酮酶基因替換成菌株SFR-4發生了變異的轉酮酶基因，即可獲得轉酮酶發生變異的SFA-H43工程菌株，預期該工程菌株可以積累D-核糖，同時仍然保持菌株SFA-H43其他優良特性，提高D-核糖發酵的抗逆性、減少發酵染菌風險。

基于上述分析和試驗，具體的，本發明涉及以下技術方案：

首先，本發明提供了一種用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌工程菌，所述工程菌為枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉酮酶基因替換為SEQ ID NO.7所示基因序列后獲得的工程菌。

優選的，SEQ ID NO.7所示基因序列源自枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉酮酶基因。

所述枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株，保藏號為CCTCC No:M2013181。

所述枯草芽孢桿菌SFR-4菌株，為發明人早先篩選到的轉酮酶缺失突變株，參見趙祥穎等，食品與藥品,7(3):23-26,2005；公眾可以合理途徑獲得。

具體的，本發明所述用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌工程菌，為枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉酮酶基因終止密碼子前500bp序列，替換為枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉酮酶基因終止密碼子前500bp序列(包含突變位點)獲得的工程菌。

本發明優選的實施方案中，公開了一株用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)工程菌SFR-43T，該菌株于2016年11月22日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為：湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏號為：CCTCCM 2016666。

所述用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌工程菌株SFR-43T，在LB培養基平板上37℃培養培養12h開始出現菌落，24小時菌落直徑約1.0-1.5mm，菌落呈圓形，邊緣不整齊，乳白色，扁平、表面光滑、不透明，與菌株SFA-H43菌落有明顯區別；在LB液體培養基中，37℃搖床培養12-20小時，細胞呈直桿狀，呈單個或短鏈存在，革蘭氏染色陽性，產孢子能力降低。

所述菌株SFR-43T，為轉酮酶突變工程菌株，在合適的培養條件(培養溫度、pH、溶解氧等)下，為其提供恰當的培養基組分(碳源、氮源、無機鹽等)，該菌株在培養液中能夠積累D-核糖。

所述菌株SFR-43T是通過分子生物學的方法獲得的，其親株為SFA-H43菌株，發生突變的轉酮酶基因來自D-核糖生產菌株SFR-4。

其次，本發明提供一種用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌工程菌的構建方法，其通過同源重組的方法，將枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉酮酶基因替換為SEQ ID NO.7所示基因序列。

優選的，SEQ ID NO.7所示基因序列源自枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉酮酶基因。

具體的，用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌工程菌SFR-43T的構建方法中，同源重組替換的基因片段為枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉酮酶基因終止密碼子前500bp序列替換為枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉酮酶基因終止密碼子前500bp序列。

本發明優選的實施方案中，所述菌株SFR-43T是通過下述步驟構建而成的(構建流程參見附圖3)：

(1)以菌株SFR-4基因組為模板，擴增該菌株轉酮酶基因終止密碼子前500bp片段(包含突變位點)，稱為L-tkt(其序列如SEQ ID NO.10所示)，其中下游引物含有質粒p7Z6的lox71-zeo-lox66片段前端25bp互補序列；優選的，所用引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(2)以菌株SFA-H43基因組為模板，擴增其轉酮酶基因下游500bp片段，為R-tkt(其序列如SEQ ID NO.11所示)，其中上游引物含有質粒p7Z6的lox71-zeo-lox66末端25bp互補序列；優選的，所用引物序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

(3)以質粒p7Z6為模板，擴增攜帶有lox位點的博來霉素抗性基因片段lox71-zeo-lox66；優選的，所用引物序列為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

(4)采用融合PCR方法，將L-tkt、lox71-zeo-lox66、R-tkt融合；優選的，融合PCR所用引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示；

(5)將融合片段轉化菌株SFA-H43，通過博來霉素抗性平板篩選整合型重組突變菌株，獲得了含有菌株SFR-4轉酮酶突變位點的菌株SFA-H43的工程菌株，并采用Cre/lox系統方法敲除工程菌株中的抗性基因zeo(Xin Yan et al.Appled and Environmental Microbiology,2008,74(17):5556-5562.)，獲得不帶抗生素抗性基因的安全轉酮酶突變工程菌株，命名為SFR-43T。

此外，本發明還公開了上述枯草芽孢桿菌工程菌在發酵制備D-核糖中的應用。

優選的，上述應用還包括在生產D-核糖的同時還發酵生產3-羥基丁酮。

本發明的另一目的在于提供一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵生產D-核糖和/3-羥基丁酮的方法。

為實現上述發明目的，具體的，本發明涉及以下技術方案：

一種枯草芽孢桿菌工程菌株發酵生產D-核糖和/3-羥基丁酮的方法，其采用如下的搖瓶發酵和/發酵罐發酵方式：

(1)菌種培養：將工程菌株活化后接種到種子培養基培養，獲得一級種子和/二級種子；

(2)搖瓶發酵：將步驟(1)培養好的一級種子接種到裝有發酵培養基的搖瓶中，搖瓶培養至發酵液中D-核糖含量不再增加，結束發酵；

(3)發酵罐發酵：將步驟(1)培養好的一級或二級種子接種到發酵罐中，進行通風攪拌培養，培養過程中，控制pH，通過調節攪拌轉速和通風比，控制溶解氧進行發酵。

優選的實施方案中，步驟(1)中菌種培養為：取35-40℃培養2-3天工程菌株的新鮮斜面，用接種環取1-2環斜面菌種，接種到50ml液體種子培養基中，35-40℃，150-200rpm，搖瓶培養10-16小時，是為一級種子。將一級種子以1-10％的(體積百分數)接種種子培養基，35-40℃培養6-12小時，是為二級種子；

優選的實施方案中，(2)搖瓶發酵：將步驟(1)培養好的一級種子以1-10％(體積百分數)的接種量接種到裝有發酵培養基的搖瓶中，35-40℃、180-220rpm，搖瓶培養至發酵液中D-核糖含量不再增加，結束發酵；

優選的實施方案中，(3)發酵罐發酵：將步驟(1)培養好的一級或二級種子以1-10％(體積百分數)的接種量接種到發酵罐中(65-75％的裝液量)，35-40℃進行通風攪拌培養，培養過程中，控制pH在5-7，通過調節攪拌轉速和通風比，保持發酵液中相對溶解氧濃度5-30％。

進一步地，上述斜面培養所用的斜面菌種培養基的組成為：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，瓊脂20g/L，其余為水，pH7.0-7.2。

進一步地，上述液體一級種子培養基的組成為：葡萄糖20-40g/L，酵母浸提物2-10g/L，玉米漿8-12g/L，pH 7.0-7.2。

進一步地，上述二級種子培養基的組成為：葡萄糖30-60g/L，酵母浸提物2-10g/L，玉米漿8-12g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，MgSO₄ 2g/L，pH 7.0-7.2。

進一步地，上述搖瓶發酵培養基組成為：葡萄糖120-150g/L，酵母浸提物2-10g/L，玉米漿5-15g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH7.0-7.2。

進一步地，上述發酵罐發酵初始培養基組成為：葡萄糖120-150g/L，酵母浸提物3-6g/L，玉米漿5-10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH 6.0-7.2。

優選的，所述一級種子培養基培養的時間為12-14小時。

優選的，所述二級種子培養基培養的時間為6-8小時。

優選的，所述搖瓶發酵或發酵罐發酵的培養溫度為36-38℃。

優選的，所述發酵罐發酵的pH控制在5.5-6.5。

優選的，所述發酵罐發酵的溶解氧濃度保持在20-30％。

優選的，所述發酵培養基中葡萄糖130-150g/L，酵母浸提物3-6g/L，玉米漿6-10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH 7.0-7.2。

優選的，發酵罐通過補料的方式提高發酵效率和增加發酵產率。

優選的，補料發酵，初始葡萄糖濃度為120-150g/L。

優選的，補料采用一次補料方式。

優選的，補料時間為發酵液中葡萄糖濃度降至20-40g/L。

優選的，補料量為40-60g/L葡萄糖。

優選的，補料葡萄糖濃度為600-800g/L，酵母浸提物0.5g/L。

本發明取得了以下優點和積極效果：

(1)本發明基于菌株SFR-4與菌株SFA-H43基因組功能基因組成高度相似的發現以及SFR-4菌株轉酮酶基因50bp基因序列較SFA-H43菌株發生了明顯變異的特點，將SFR-4菌株與SFA-H43菌株的優勢進行組合；本發明選用的轉化用親株SFA-H43為自然篩選的積累3-羥基丁酮的菌株，經全基因組測序比較分析與D-核糖高產菌株SFR-4同源性較高，轉酮酶基因序列除突變位點外核酸序列完全相同，本發明采用同源重組的方法將菌株SFR-4菌株的轉酮酶基因突變序列轉入菌株SFA-43，替換該菌株轉酮酶基因的正常序列，獲得一株轉酮酶發生變異的工程菌株SFR-43T，經發酵試驗驗證，工程菌株SFR-43T既保持了菌株SFA-43的其他優良性能(抗逆性好、耗糖速度快、生長旺盛、不易染菌)，同時可以積累高濃度的D-核糖，發酵抗逆性明顯提高。

(2)SFA-H43菌株為發明人前期從白酒大曲磚中分離篩選到的生理生化性質適于代謝生產3-羥基丁酮的菌株，基于菌株SFR-4與菌株SFA-H43基因組功能基因組成高度相似的特點，將SFA-H43菌株中轉酮酶基因替換為SFR-4菌株的轉酮酶基因后，本發明所述工程菌可以利用高濃度葡萄糖來高產D-核糖并聯產3-羥基丁酮，提高了工程菌生產D-核糖的價值。

附圖說明：

圖1菌株SFR-4、菌株SFA-H43、菌株168基因組功能基因相似度分析

圖2菌株SFR-4、菌株SFA-H43、菌株168轉酮酶基因序列差異位點的比對

圖3工程菌SFR-43T的構建路線圖

圖4 PCR獲得的L-tkt、R-tkt、lox71-zeo-lox66片段的電泳圖，1.DL5000Marker；2.L-tkt基因片段；3.R-tkt基因片段；4.zeo基因片段

圖5融合PCR獲得的L-tkt、lox71-zeo-lox66、R-tkt重組基因片段電泳圖，1.DL5000Marker；2.重組基因片段

圖6工程菌SFR-43T發酵進程

圖7菌株SFR-4發酵進程

圖8工程菌SFR-43T發酵罐補料發酵進程

具體實施方式：

下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法，所用引物合成均購自華大基因，所用質粒p7Z6及質粒pDGC由南京農業大學贈與(Xin Yan et al.Appled and Environmental Microbiology,74(17):5556-5562,2008.)。

實施例1菌株SFR-43T構建

(1)以菌株SFR-4基因組為模板，擴增該菌株轉酮酶基因終止密碼子前500bp片段(包含突變位點)，稱為L-tkt(其序列如SEQ ID NO.10所示)。其下游引物含有lox71-zeo-lox66前端25bp互補序列。

模板：菌株SFR-4基因組

上游引物：GCAGCATGGAAGCTTGCAG(SEQ ID NO.1)

下游引物：TATAATGTATGCTATACGAACGGTATTATCTTGATACTATATAGAAACATCTCAAGG(SEQ ID NO.2)

PCR反應體系(50uL)：菌株SFR-4基因組DNA模板1uL，上游引物1uL，下游引物1uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水17.5uL。

PCR反應條件：95℃變性5min，98℃10s，60.3℃30s，72℃30s，33個循環。

擴增產物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并收集。

(2)以菌株SFA-H43基因組為模板，擴增其轉酮酶基因下游500bp片段，為R-tkt(其序列如SEQ ID NO.11所示)。其上游引物含有lox71-zeo-lox66末端25bp互補序列。

模板：菌株SFA-H43基因組

上游引物：

ATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCTTTTGAAAGAGGATGAGTCAAAT(SEQ ID NO.3)

下游引物：AAAGAATATCGTTTCTGCCTCGTAA(SEQ ID NO.4)

PCR反應體系(50uL)：菌株SFA-H43基因組DNA模板1uL，上游引物1uL，下游引物1uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水17.5uL。

PCR反應條件：95℃變性5min，98℃10s，60.8℃30s，72℃30s，33個循環。

擴增產物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并收集。

(3)以質粒p7Z6為模板，擴增攜帶有lox位點的博來霉素抗性基因(zeo)片段lox71-zeo-lox66。

模板：質粒p7Z6

上游引物:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACG(SEQ ID NO.5)

下游引物:TATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCAGTC(SEQ ID NO.6)

PCR反應體系(50uL)：菌株SFA-H43基因組DNA模板1uL，上游引物1uL，下游引物1uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水8.5uL。

PCR反應條件：95℃變性5min，98℃10s，59.2℃30s，72℃30s，33個循環。

擴增產物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并收集。

PCR獲得的L-tkt、R-tkt、lox71-zeo-lox66zeo基因片段電泳圖見附圖4。

(4)采用融合PCR方法，制備L-tkt、lox71-zeo-lox66、R-tkt融合片段。

①融合反應

融合PCR反應體系：L-tkt基因片段3uL，R-tkt基因片段3uL，lox71-zeo-lox66zeo基因片段3uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水11.5uL。

融合PCR反應條件：95℃變性5min，98℃10s，59.2℃30s，72℃90s，10個循環。

②擴增反應

模板：融合片段

上游引物：GCAGCATGGAAGCTTGCAG(SEQ ID NO.1)

下游引物：AAAGAATATCGTTTCTGCCTCGTAA(SEQ ID NO.4)

反應體系：融合片段10uL，上游引物1uL，下游引物1uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水8.5uL。

反應條件：95℃變性5min，98℃10s，59.2℃30s，72℃90s，33個循環。

擴增產物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并收集。附圖5為融合PCR獲得重組基因片段電泳圖。

(5)采用電轉法將該融合片段轉化SFA-H43菌株，通過博來霉素抗性平板(25ug/mL)篩選到8株抗性菌株，經多次傳代獲得4株遺傳穩定菌株，經搖瓶發酵發現有3株菌積累D-核糖，挑選其中一株進行下一步抗性基因zeo敲除。

(6)采用電轉法將質粒pDGC導入(5)獲得的重組工程菌株中，采用IPTG誘導質粒中cre基因的表達，采用Cre/lox系統方法敲除重組體中的zeo基因，經篩選和發酵試驗獲得一株攜帶菌株SFR-4轉酮酶基因突變序列、且不帶抗性基因的轉酮酶突變工程菌株，命名為SFR-43T。

該菌株于2016年11月22日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為：湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏號為：CCTCC M 2016666。

實施例2菌株SFR-43T產物分析

取37℃培養2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，用接種環取1-2環斜面菌種，接種到液體種子培養基中，37℃，180rpm搖床培養14小時，5％接種量接種發酵培養基，37℃，180rpm搖瓶培養72小時。發酵液經4500rpm離心10min，取上清，進行產物分析，結果顯示菌株SFR-43T發酵液中同時檢出3-羥基丁酮和D-核糖組分。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.5g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。

實施例3發酵培養基優化

本發明以菌株SFR-4D-核糖發酵培養基為基礎，對菌株SFR-43T發酵D-核糖的培養基氮源等組分進行了進一步優化。

氮源優選：取37℃培養2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，用接種環挑取1-2環，接種到液體種子培養基中，37℃，180rpm搖床培養14小時，接種量5％，接種到含不同氮源的搖瓶發酵培養基(氮源分別為蛋白胨、酵母浸提物、玉米漿干粉、硝酸銨、磷酸氫二銨、硫酸銨，濃度均為10g/L，碳源為葡萄糖，其他組分相同)，37℃，180rpm搖瓶培養72小時。發酵液經離心去菌體，上清液用于D-核糖含量測定。結果顯示菌株SFR-43T單獨利用蛋白胨、酵母浸提物、玉米漿干粉、硝酸銨(NH₄NO₃)、磷酸氫二銨((NH₄)₂HPO₄)、硫酸銨((NH₄)₂SO₄)為氮源均可產生D-核糖，其中單獨利用酵母浸提物為氮源，D-核糖產量最高?？紤]到酵母浸提物售價較高，本發明對多種復合氮源的各成分進行組合優選，結果當酵母浸提物3-6g/L，玉米漿6-10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L時，菌株SFR-43T發酵D-核糖產率最高。

葡萄糖濃度優選：取37℃培養2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，用接種環挑取1-2環，接種到液體種子培養基中，37℃，180rpm搖床培養14小時，接種量5％，接種到含不同濃度葡萄糖的搖瓶發酵培養基，37℃，180rpm搖瓶培養72小時。發酵液經離心去菌體，上清液用于D-核糖含量測定。結果顯示，葡萄糖濃度在120-150g/L的范圍內，菌株D-核糖產率及轉化率較高。

無機離子優選：取37℃培養2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，用接種環挑取1-2環，接種到液體種子培養基中，37℃，180rpm搖床培養14小時，接種量5％，接種到含不同無機離子的搖瓶發酵培養基(無機離子分別為硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鈉、硫酸鋅，濃度均為1g/L，碳源為葡萄糖，氮源為酵母浸提物2-10g/L，玉米漿5-15g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，其他組分相同)，37℃，180rpm搖瓶培養72小時。發酵液經離心去菌體，上清液用于D-核糖含量測定。發酵液經4500rpm離心15min，上清液經液相色譜測定D-核糖含量，結果顯示菌株SFR-43T在添加有硫酸鎂和硫酸錳的培養基中，D-核糖含量較高，經復合優化該無機離子，結果顯示，當MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L時，菌株SFR-43T發酵D-核糖產率較高。

實施例4菌株SFR-43T與菌株SFR-4對比發酵

本實施例用于對比所提供的基因比較工程菌SFR-43T與菌株SFR-4的D-核糖發酵特征。

工程菌SFR-43T與菌株SFR-4接入搖瓶種子培養基，后分別接入5L發酵罐中培養，8h取樣一次，發酵罐發酵的pH控制在6.5，通風量為2L/min，通過調節轉速，溶解氧濃度保持在20-30％。比較菌體量、殘糖濃度、D-核糖產量，并繪制發酵進程曲線，如附圖6、圖7所示，相比于自然誘變選育菌株SFR-4，工程菌SFR-43T雖然D-核糖產量略有降低，但菌體生長較快，發酵周期較短。

斜面培養基配方：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，瓊脂20g/L，pH7.0。

液體種子培養基配方(g/L)：葡萄糖20g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，pH7.0。

菌株SFR-43T發酵培養基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。

菌株SFR-4發酵培養基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿3g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，MgSO₄ 2g/L，CaCO₃ 5g/L，pH6.5。

實例5工程菌SFR-43T搖瓶發酵

取37℃培養2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，接種環取1環斜面菌種，接種到50ml/250mL液體種子培養基中，36℃培養14小時，以5％的接種量接種到50ml/250mL發酵培養基中，37℃、180rpm搖瓶發酵，每隔12h取樣，培養周期至72小時，葡萄糖耗盡，結束發酵，D-核糖產量達39.35g/L，3-羥基丁酮產率35.7g/L。

斜面培養基配方：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，瓊脂20g/L，pH7.0。

液體種子培養基配方：葡萄糖20g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，pH7.0。

搖瓶發酵培養基配方：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH7.0。

實例6工程菌SFR-43T搖瓶發酵

取37℃培養2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，接種環取1環斜面菌種，接種到50ml/250mL液體種子培養基中，37℃培養12小時，以10％的接種量接種到50ml/250mL發酵培養基中，37℃、200rpm搖瓶發酵，每隔12h取樣，培養周期至72小時，葡萄糖耗盡，結束發酵，D-核糖產量達36.28g/L，3-羥基丁酮產率33.65g/L。

斜面培養基配方：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，瓊脂20g/L，pH7.0。

液體種子培養基配方：葡萄糖20g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿8g/L，pH7.0。

搖瓶發酵培養基配方：葡萄糖140g/L，酵母浸提物6g/L，玉米漿8g/L，(NH₄)₂SO₄3.0g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH7.0。

實例7菌株SFR-43T發酵罐發酵

取37℃培養2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，接種環取1環斜面菌種，接種到50ml/250mL液體種子培養基中，36℃培養14小時，以5％(體積百分數)的接種量接種到5L發酵罐中(裝液量為3L)，37℃通風攪拌培養，通風量為2L/min，控制pH5.5-6.0。通過調節攪拌轉速，保持發酵液中相對溶解氧濃度為20％左右，68h發酵結束，D-核糖產量達40.5g/L，3-羥基丁酮產率為35.6g/L。

液體種子培養基配方：葡萄糖50g/L，酵母浸提物6g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，pH7.0。

發酵罐發酵培養基配方：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。

實例8菌株SFR-43T發酵罐發酵

取37℃培養2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，接種環取1環斜面菌種，接種到50ml/250mL液體種子培養基中，37℃培養12小時，以5％(體積百分數)的接種量接種到800ml/5L三角瓶中，37℃振蕩培養8小時，以10％的接種量接種50L發酵罐，通風攪拌培養，通風比0.5-1.0，控制pH6.0±0.2。通過調節攪拌轉速，保持發酵液中相對溶解氧濃度為20-40％，64h發酵結束，D-核糖產量達42.5g/L，3-羥基丁酮產率為33.6g/L。

一級液體種子培養基配方：葡萄糖20g/L，酵母浸提物8g/L，玉米漿8g/L，pH7.0。

二級液體種子培養基配方：葡萄糖60g/L，酵母浸提物6g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，pH7.0。

發酵罐發酵培養基配方：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.5g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。

實例9菌株SFR-43T發酵罐補料發酵

一級種子37℃培養14小時，以5％(體積百分數)的接種量接種到二級種子培養基中，37℃培養8小時，10％的接種量接種50L發酵罐(裝液量30L)，通風攪拌培養。控制發酵溫度36-37℃、通風比0.5-0.8，控制pH6.0±0.2，通過調節攪拌轉速，保持發酵液中相對溶解氧濃度為20-40％，44h補料1次，補料40g/L，80小時發酵結束，D-核糖產量達51.5g/L，3-羥基丁酮產率35.1g/L，發酵結果如圖8所示。

發酵罐發酵初始培養基配方：葡萄糖120g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。發酵罐發酵過程流加物料組成：葡萄糖800g/L，酵母浸提物0.5g/L。

以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省食品發酵工業研究設計院

<120> 一株枯草芽孢桿菌工程菌及其應用

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工引物序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> SFR-4 tkt

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atggatacaa ttgaaaagaa atcagttgct accattcgca cactgtcaat agacgctatt 60

gaaaaagcaa attctggtca cccagggatg ccgatgggag ccgctccaat ggcatacacg 120

ctgtggacaa aatttatgaa cgtaagtccg gcaaaccctg gctggtttaa ccgtgaccgt 180

tttgttttat ctgctggaca cgggtcagca ctattataca gcatgcttca tttaagcggg 240

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gtactatacg attctaatga catctctctt gatggagacc tcgaccgttc attctctgaa 600

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gcagcatgga agcttgcagt gcaaagcact gaccacccaa cagcgctagt gcttacacgt 1560

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tgtttctata tagtatcaag ataa 2004

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<212> DNA

<213> SFA-H43 tkt基因

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