本發明屬于糧食儲藏技術領域，具體涉及一株廣譜拮抗儲糧主要危害霉菌的芽孢桿菌菌株、其抗菌代謝物制備方法、芽孢桿菌菌株及其抗菌代謝物在糧食儲藏中的應用。

背景技術：

相對于世界上其他國家而言，我國糧食儲藏年限較長，平均儲藏年限為3年。在長期儲藏中，儲糧不可避免會受外界環境因素及糧堆水分遷移的影響，從而發生霉菌生長、代謝、產毒。霉菌生長代謝可分解糧食中的營養成分，使糧食品質發生不同程度的劣變。據不完全統計，全世界每年僅糧食霉變造成的損失就達總產量的3％以上，我國每年由于霉菌危害活動造成的糧食損失量高達150億至200億公斤，折合金額高達180億至240億元。另外，霉菌代謝活動還可產生有毒的或致癌性的真菌毒素，全世界谷物供應量的25％受到真菌毒素的污染，帶來了嚴重的食品安全問題。目前我國批準使用的飼料、糧食防霉劑大部分為化學防霉劑，長期使用化學防霉劑造成儲糧主要危害霉菌產生抗性、污染環境、藥劑殘留、損害倉儲工作人員健康等一系列后果，目前糧食儲藏減損領域對綠色生物防霉技術需求強烈。而國內外尚沒有微生物源的防霉劑商業化應用于糧食儲藏領域。

芽孢桿菌是一類在自然界中廣泛存在的好氧、產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，抗逆性強，易于培養。枯草芽孢桿菌更是國際上公認的安全菌種之一，被美國FDA和環保署列為可商業上應用的微生物菌種，也是我國農業部規定的免做安全鑒定的一級菌種之一。目前，芽孢桿菌及其代謝物主要用于植物病害防治，在糧食防霉方面的研究、應用極少。中國專利(申請號200510038629.6)公布的枯草芽孢桿菌抗菌肽僅具有抑制黃曲霉的作用，抑菌譜窄，實際應用價值低；中國專利(申請號201310263918.0)公布的枯草芽孢桿菌LPL-NM45僅具有在玉米儲藏中抑制黑曲霉、串珠鐮刀菌、草酸青霉的作用，抑菌譜有限，應用開發潛力有限。

本發明的提供的枯草芽孢桿菌菌株LM3403及其抗菌代謝物在糧食儲藏減損方面具有巨大的應用價值和市場開發潛力。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一株廣譜拮抗儲糧主要危害霉菌的芽孢桿菌菌株、其抗菌代謝物制備方法、芽孢桿菌菌株及其抗菌代謝物在糧食儲藏中的應用。

本發明提供的菌株LM3403（Bacillus subtilis LM3403）已于2014年6月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.9377，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

本發明提供了所述枯草芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物。

本發明還提供了枯草芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物的制備方法，其特征在于，所述方法為：將活化后的枯草芽孢桿菌LM3403接種于液體培養基中，35℃、200r/min培養48h，得到發酵液；發酵液于4℃下9500rpm離心15min，得到發酵上清液。向發酵上清液中加入無機酸或有機酸，調節至pH2，4℃過夜；4℃下9500rpm離心15min，收集沉淀，用少量1％無菌碳酸氫胺溶液溶解，通過干燥至含水量13％以下，即得到抗菌代謝物。

所述培養基，可以是LB培養基、NA培養基、Landy培養基等，優選為Landy培養基。Landy培養基：谷氨酸5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5g/L；KCl 0.5g/L；酵母膏1g/L；L-苯丙氨酸2mg/L；MnSO₄ 5mg/L；CuSO₄·5H₂O 0.16mg/L；FeSO₄·7H₂O0.15mg/L；葡萄糖20g/L；KH₂PO₄ 1g/L；pH 7.0。

所述無機酸，可以是鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸等，優選為濃鹽酸。

所述有機酸，可以是酒石酸、苯甲酸、檸檬酸等有機酸，優選為檸檬酸固體。基于食品安全考慮，優選為食品級檸檬酸。

所述干燥，可以是常壓干燥、噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥、流化床干燥等，優選為冷凍干燥。

本發明還提供了所述枯草芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物在糧食儲藏中的防霉應用，所述糧食優選為小麥、玉米。

本發明的有益效果：

本發明提供的枯草芽孢桿菌菌株屬于是國際上公認的安全菌種，被美國FDA和環保署列為可商業上應用的微生物菌種之一，也是我國農業部規定的免做安全鑒定的一級菌種之一。

本發明提供的枯草芽孢桿菌LM3403對禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、黃曲霉、黑曲霉、灰綠曲霉、煙曲霉、草酸青霉、擴展青霉等儲糧主要危害霉菌均具有較好的抑制作用，抑菌譜廣，適用范圍大，應用開發潛力大。

本發明所述枯草芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物易于制備、易于規模化生產、生產成本低。

本發明所述枯草芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物對儲糧主要危害霉菌的生長均具有顯著的抑制作用。

儲藏試驗結果顯示，添加芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物能夠有效抑制糧食儲藏過程中霉菌的生長，保障糧食儲藏安全。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。

實施例1：芽孢桿菌LM3403分離篩選和鑒定

采用稀釋涂布法從采集自海拔3000米以上高寒無污染草原上生長的野牦牛牛糞樣品中分離純化出形態差異明顯的各細菌菌落，編號，保存備用。

采用平板對峙法從上述分離純化得到細菌菌株中篩選對霉菌具有廣譜拮抗能力的菌株，得到廣譜拮抗能力最強的菌株，命名為LM3403。

實施例2：芽孢桿菌LM3403種屬鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行菌株形態學觀察和生理生化特性分析。菌株LM3403在NA平板上菌落圓形、不透明乳白色、較黏稠、邊緣不整齊；細胞呈桿狀，革蘭氏陽性，芽孢中生、橢圓形。菌株LM3403在NA平板上菌落圓形、不透明乳白色、較黏稠、邊緣不整齊；細胞呈桿狀，革蘭氏陽性，芽孢中生、橢圓形。需氧生長，可運動，V-P試驗陽性，過氧化氫酶試驗陽性，吲哚試驗陽性，淀粉水解陽性，酪蛋白水解陽性，明膠液化陽性，葡萄糖發酵試驗陽性，硝酸鹽還原陽性，尿素利用陽性。菌株LM3403的形態特征、生理生化特征與枯草芽孢桿菌標準株保持一致。

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以通用引物27F和1492R為引物，對菌株16S rDNA進行PCR擴增。PCR產物經0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交上海生工生物工程有限公司純化測序。將測序結果與GenBank數據庫中已知的16S rDNA序列進行BLAST比對。菌株PCR產物經純化后測序得到1439bp的序列(GenBank登錄號KJ906613)，經BLAST比對，發現菌株LM3403的16S rDNA序列與Bacillus subtilis strain SPA N1(JQ308575)、Bacillus subtilis strain ME2(JQ900623)和Bacillus subtilis strain BDT3(HQ711982)的同源性達到100％。

綜合分析確定菌株LM3403為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

實施例3：菌株LM3403抑菌譜

以禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、黃曲霉、黑曲霉、灰綠曲霉、煙曲霉、草酸青霉、擴展青霉、高大毛霉等儲糧主要危害霉菌為指示菌，采用對峙培養法測定菌株LM3403的廣譜抑菌能力，結果見表2。

表1菌株LM3403抑菌譜

注：“+”表示抑菌帶寬＜3mm，“++”表示抑菌帶寬在3-5mm，“+++”表示抑菌帶寬＞5mm

實施例4：枯草芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物制備

將活化后的枯草芽孢桿菌LM3403接種于液體培養基中，35℃、200r/min培養48h，得到發酵液；發酵液于4℃下9500rpm離心15min，得到發酵上清液。向發酵上清液中加入食品級檸檬酸固體，調節至pH2，4℃過夜；4℃下9500rpm離心15min，收集沉淀，用少量1％無菌碳酸氫胺溶液溶解，通過冷凍干燥至含水量13％以下，即得到抗菌代謝物。

實施例5：抗菌代謝物對霉菌生長的影響

采用含藥平板法考察抗菌代謝物對霉菌生長的影響。將霉菌接種于PDA平板活化5d，用無菌打孔器打孔制得直徑6mm的菌餅，將菌餅接種于含有一定濃度抗菌代謝物的PDA平板中心，28℃培養5d，測算霉菌菌落直徑，計算生長抑制率，生長抑制率(％)＝(空白對照組菌落直徑-實驗組菌落直徑)/空白對照組菌落直徑×100％，每組3次重復，計算平均數。其中，空白對照組平板抗菌代謝物濃度為0μg/mL，實驗組平板抗菌代謝物濃度為100μg/mL。

表2抗菌代謝物對霉菌生長的抑制

實施例6：模擬小麥儲藏試驗

收集高水分小麥樣品，以實施例4制備的抗菌代謝物作為防霉劑進行模擬儲藏試驗，參照GB 4789.15-2010進行霉菌帶菌量的檢測，通過霉菌帶菌量的對比，衡量芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物的防霉效果。

本實施例中的小麥樣品水分含量經檢測為14.8％，分別隨機取1Kg小麥樣品裝入無菌玻璃器皿，試驗組按質量分數添加5‰的抗菌代謝物，充分混勻，空白對照組不添加，每組3次重復，置于相對濕度70％的Binder KMF720恒溫恒濕培養箱中進行模擬儲藏。霉菌最適生長溫度在30℃左右，因此模擬儲藏溫度設置為30℃。

表3儲藏期間小麥霉菌帶菌量變化(×10³CFU/g)

由表3可知，隨著儲藏時間的延長，空白對照組小麥霉菌帶菌量逐漸增加，儲藏35d時霉菌帶菌量已經達到初始帶菌量的200倍以上，并可聞到明顯的霉味，儲藏60d時出現明顯霉變；抗菌代謝物試驗組霉菌帶菌量在儲藏前期(14d前)出現小幅度的增加，但增加并不顯著；儲藏中期開始，試驗組霉菌帶菌量水平較初期雖有所增大，但顯著低于空白對照組，且儲藏60d時霉菌帶菌量仍與初始帶菌量保持在同樣的10³CFU/g水平，霉菌生長受到了很好的控制。說明芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物在小麥儲藏中具有良好的防霉效果。

實施例7：模擬玉米儲藏試驗

收集高水分玉米樣品，以實施例4制備的抗菌代謝物作為防霉劑進行模擬儲藏試驗，參照GB 4789.15-2010進行霉菌帶菌量的檢測。通過霉菌帶菌量的對比，衡量芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物的防霉效果。

本實施例中的玉米樣品水分含量經檢測為15.5％，分別隨機取1Kg玉米樣品裝入無菌玻璃器皿，試驗組按質量分數添加5‰的抗菌代謝物，充分混勻，空白對照組不添加，每組3次重復，置于30℃、相對濕度70％的Binder KMF720恒溫恒濕培養箱中進行模擬儲藏。

表4儲藏期間玉米霉菌帶菌量變化(×10³CFU/g)

同樣，由表4可知，隨著儲藏時間的延長，空白對照組玉米霉菌帶菌量逐漸增加，儲藏35d時霉菌帶菌量已達到初始帶菌量的200倍左右，并可聞到明顯的霉味，儲藏45d時即出現明顯霉變；而抗菌代謝物試驗組在整個儲藏期霉菌帶菌量與初始帶菌量保持在同樣的10³CFU/g水平，有效抑制了儲藏玉米中霉菌的生長。說明芽孢桿菌LM3403抗菌代謝物在玉米儲藏中具有良好的防霉效果。

雖然上文中已經用一般性說明、具體實施方式對本發明作了詳盡的描述，但對于本領域的技術人員來說，依然可以對上述所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換或者優化；而這些修改或替換或優化，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。

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