Cc2d2a基因突變體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了CC2D2A基因突變體及其應用，具體涉及分離的編碼CC2D2A突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患遺傳性Joubert綜合征的生物樣品的方法，篩選易患遺傳性Joubert綜合征的生物樣品的系統，用于篩選易患遺傳性Joubert綜合征的生物樣品的試劑盒。其中，該分離的編碼CC2D2A基因突變體的核酸，與SEQ?ID?NO：1相比，具有c.2999A>T，c.3688C>T的至少一種突變。通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患遺傳性Joubert綜合征。
【專利說明】CC2D2A基因突變體及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及【技術領域】。具體而言，本發明涉及CC2D2A基因突變體及其應用。

【背景技術】
[0002]Joubert 綜合征(Joubert syndrome, TS, omim num:213300)是.一類與視網膜色素變性相關的遺傳性綜合癥，在1969年由Joubert等首次報道，本病男性多見，男女比例為3:2，發病比例為1/100000，預后通常較差。5年的存活率僅達50%。
[0003]臨床特點主要包括帶有磨牙癥的小腦蚓部發育不全，并伴隨有神經系統癥狀，包括呼吸模式和發育遲緩的失調。本病還可伴隨其他發育異常，如視網膜營養不良、腎功能異常、小頭畸形、面部畸形、胼胝體發育不良、多指(趾)畸形等。其臨床診斷標準為必須具備小腦蚓部發育不全、肌張力低下、發育延遲3項；異常呼吸以及眼運動異常2項中至少存在I項。
[0004]Joubert綜合征與多個基因有關，目前發現的基因有20個多，這些基因所生成的蛋白是確定的或懷疑在細胞中扮演纖毛的作用。纖毛呈指狀突起，在細胞表面參與化學信號傳導。纖毛在多類細胞的結構和功能上有重要作用，其中包括腦細胞(神經元)，腎臟以及肝臟細胞，初級纖毛在浦肯野細胞以及原始粒細胞已經被分離出來.而且纖毛也是感官的必要組成部分(如視覺，聽覺，嗅覺)。研究人員認為，纖毛缺陷會引起該疾病的大部分表型，但目前仍不清楚具體是如何導致發育異常的。
[0005]目前有兩個理論來解釋Joubert綜合征患者的小腦蚓部發育不良。一是由于纖毛缺陷而SHH信號轉導異常，從而粒細胞增殖減少導致小腦蚓部發育不良，二是中后腦邊界以及菱腦節有細微變化造成小腦蚓部發育不良。
[0006]大約有25%的Joubert綜合征的致病基因是AHIl基因或者CEP290/NPHP6基因。盡管Joubert綜合征在遺傳學研究上進展迅速，但基因缺陷是如何影響大腦功能，發育以及結構卻仍不清楚。其中CC2D2A基因位于4pl5.33，編碼富含一個卷曲螺旋和C2區域的蛋白，功能研究發現該基因可能在鈣離子依賴型信號轉導中起重要作用。
[0007]因而，目前對Joubert綜合征的研究仍有待深入。


【發明內容】

[0008]本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠有效篩選易患Joubert綜合征的生物樣品的方法。
[0009]本發明是基于發明人的下列工作完成的:發明人通過高通量外顯子組測序聯合候選基因突變驗證的方法確定了 Joubert綜合征新的致病基因突變位點(CC2D2A基因的c.2999A>T, c.3688C>T 至少之一突變)。
[0010]根據本發明的第一方面，本發明提出了一種分離的編碼CC2D2A基因突變體的核酸。根據本發明的實施例，所述核酸與SEQ ID NO:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.2999A>T，c.3688C>T。即相對于野生型CC2D2A基因，本發明的CC2D2A基因具有錯義突變c.2999A>T,c.3688C>T的至少一種。根據本發明的實施例，發明人確定了 CC2D2A基因的新突變體，該突變體與Joubert綜合征的發病密切相關，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患Joubert綜合征。
[0011]根據本發明的第二個方面，本發明提出了一種分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2相比，具有選自下列的至少一種突變:p.GlulOOOVal、p.Argl230X，通過檢測生物樣品中是否表達該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易Joubert綜合征。根據本發明的實施例，該多肽是由上述核酸編碼的。
[0012]根據本發明的地三個方面，本發明提出了一種篩選易患Joubert綜合征的生物樣品的方法，該方法包括以下步驟:從所述生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.2999ΑΧ 或者c.3688C>T的至少一種突變是所述生物樣品易患Joubert綜合征的指示,任選地,所述生物樣品為選自人體血液，任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA,任選地,所述Joubert綜合征是常染色體隱性遺傳疾病。通過根據本發明實施例的篩選易感Joubert綜合征的生物樣品的方法，可以有效地篩選易感Joubert綜合征的生物樣品。
[0013]根據本發明的第四方面，本發明提出了一種篩選易患Joubert綜合征的生物樣品的系統，該系統包括:核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，是否具有c.2999A>T，c.3688C>T的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易患Joubert綜合征；任選地，所述Joubert綜合征是常染色體隱性遺傳疾病。利用該系統，能夠有效地實施前述篩選易感Joubert綜合征的生物樣品的方法,從而可以有效地篩選易感Joubert綜合征的生物樣品。
[0014]根據本發明的第五方面，本發明提出了一種用于篩選易患Joubert綜合征的生物樣品的試劑盒，該試劑盒含有:適于檢測CC2D2A基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述CC2D2A基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.2999ΑΧ ，c.3688C>T，任選地，所述試劑為核酸探針或引物，任選地，所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO:3-6所示的核苷酸序列，任選地，所述Joubert綜合征是常染色體隱性遺傳疾病。
[0015]根據本發明的第六方面，本發明還提出了一種構建體。根據本發明的實施例，該構建體包含前面所述的分離的編碼CC2D2A基因突變體的核酸。需要說明的是，“構建體包含前面所述的分離的編碼ATM基因突變體的核酸”表示，本發明的構建體包含與SEQ ID NO:1相比具有c.2999ΑΧ 突變的CC2D2A基因突變體的核酸序列，或者包含與SEQ ID N0:1相比具有c.36880T突變的CC2D2A基因突變體的核酸序列，或者同時包含上述兩種CC2D2A基因突變體的核酸序列。由此，利用本發明的構建體轉化受體細胞獲得的重組細胞，能夠有效地用作Joubert綜合征相關研究的模型。
[0016]根據本發明的第七方面，本發明還提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，該重組細胞是通過前面所述的構建體轉化受體細胞而獲得的。根據本發明的一些實施例，本發明的重組細胞，能夠有效地用作Joubert綜合征相關研究的模型。
[0017]對于本發明中所述核酸，本領域技術人員應當理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本發明的實施例中，雖然多數情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID NO: 1，實際包括其互補序列。本領域技術人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。
[0018]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0020]圖1:顯示了根據本發明一個實施例的篩選易患Joubert綜合征的生物樣品的系統及其組成部分的示意圖，其中，
[0021]A為根據本發明實施例的篩選易患Joubert綜合征患者的生物樣品的系統的示意圖，
[0022]B為根據本發明實施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0023]C為根據本發明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖。
[0024]圖2:顯示了根據本發明一個實施例的Joubert綜合征患者的家系圖譜。
[0025]圖3:顯示了根據本發明一個實施例的Joubert綜合征患者的頭部核磁共振圖片。
[0026]圖4:顯示了根據本發明一個實施例的CC2D2A基因突變體的Sanger法測序結果。

【具體實施方式】
[0027]下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0028]CC2D2A基因突變體
[0029]根據本發明的第一方面，本發明提出了一種分離的編碼CC2D2A基因突變體的核酸。根據本發明的實施例，所述核酸與SEQ ID NO:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.2999Α>T，c.3688C>T。即相對于野生型CC2D2A基因，本發明的CC2D2A基因具有一個錯義突變c.2999Α>T或者一個無義突變c.36880T的至少一種。根據本發明的具體實施例，CC2D2A基因的c.2999Α>T突變導致編碼蛋白發生p.GlulOOOVal錯義突變，c.36880T該突變導致編碼蛋白發生P.Argl230X無義突變。因此本研究豐富了 CC2D2A基因的致病突變譜，對開展CC2D2A的分子診斷具有重要意義。
[0030]根據本發明的實施例，發明人確定了 CC2D2A基因的新突變體，該突變體與Joubert綜合征的發病密切相關，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患Joubert綜合征。
[0031] 在本文中所使用的表達方式“編碼CC2D2A突變體的核酸”，是指與編碼CC2D2A突變體的基因相對應的核酸物質，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與CC2D2A突變體的編碼基因相對應的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據本發明的一個具體示例，前面所述的編碼CC2D2A突變體的核酸為DNA。根據本發明的實施例，發明人確定了 CC2D2A基因的新突變體，這些新突變體與Joubert綜合征的發病密切相關，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患Joubert綜合征，也可以通過檢測這些突變體在生物體中是否存在，可以有效地預測生物體是否易患Joubert綜合征。
[0032]該編碼CC2D2A突變體的核酸，是本申請的發明人通過高通量外顯子組測序聯合候選基因突變驗證的方法確定的Joubert綜合征的致病基因上的新突變。該突變位點在現有技術中并未被提到。
[0033]其中，野生型CC2D2A基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:
[0034]ATGAATCCCAGGGAAGAAAAAGTAAAAATAATTACAGAGGAGTTCATTGAAAATGATGAGGATGCAGACATGGGAAGACAGAATAAGAACTCAAAGGTTCGAAGACAGCCAAGAAAGAAACAGCCACCAACTGCTGTCCCCAAGGAMTGGTGTCCGAAAAATCCCACCTTGGCAACCCCCAGGAGCCTGTGCAGGAGGAGCCCAAGACCCGCCTCCTGAGTATGACAGTCCGGAGAGGCCCACGGAGCTTACCTCCAATTCCTTCAACTTCCAGAACAGGCTTTGCAGAATTTTCCATGAGGGGACGCATGAGGGAGAAATTGCAAGCAGCGAGGTCCAAAGCAGAAAGTGCATTGCTGCAGGAAATCCCCACTCCTCGGCCCAGACGCTTACGAAGTCCCAGTAAGAAAGAATTGGAGACTGAATTTGGCACAGAGCCAGGGAAAGAGGTAGAAAGGACTCAACAAGAAGTTGACTCCCAAAGTTACTCAAGAGTCAAGTTCCATGATTCTGCACGAAAAATCAAGCCTAAACCCCAGGTTCCACCTGGCTTCCCTTCTGCAGAAGAGGCCTATAACTTCTTTACTTTCAACTTTGATCCCGAACCAGAAGGATCAGAGGAAAAACCAAAAGCAAGACATAGAGCGGGAACTAATCAAGAGGAGGAGGAAGGGGAAGAAGAAGAACCACCTGCACAAGGAGGAGGAAAGGAAATGGATGAGGAAGAACTGCTTAATGGTGATGATGCCGAGGACTTCCTATTGGGCTTAGATCACGTGGCTGACGATTTTGTAGCAGTCAGACCTGCAGATTATGAAAGCATCCATGATCGGCTGCAGATGGAAAGAGAAATGCTCTTCATACCCAGTAGGCAGACAGTCCCTACATATAAAAAGCTTCCTGAGAATGTACAGCCCAGGTTCCTGGAAGATGAAGGCCTTTACACCGGGGTAAGACCAGAGGTGGCACGCACCAATCAGAACATCATGGAGAACAGATTGCTGATGCAGGACCCCGAAAGAAGATGGTTTGGAGATGACGGCAGGATCCTAGCTCTGCCAAACCCCATCAAGCCATTTCCTTCAAGGCCGCCAGTACTAACACAGGAGCAGAGCATTAAGGCAGAGCTTGAAACACTGTATAAAAAGGCTGTAAAATACGTTCACAGTAGTCAGCATGTGATCAGATCTGGAGACCCTCCTGGAAATTTCCAACTGGACATTGATATTTCAGGGTTAATCTTCACTCATCATCCCTGTTTTAGCCGAGAGCATGTTTTGGCAGCCAAGCTGGCCCAGTTATATGACCAGTACCTTGCAAGACACCAGAGAAACAAGGCGAAATTTCTTACTGATAAGCTCCAAGCTTTAAGAAATGCTGTTCAGACTGGCCTTGATCCAGAAAAACCTCATCAGTCTCTCGATACCATCCAAAAAACCATCAATGAGTATAAATCTGAAATTCGACAAACAAGAAAATTCCGTGATGCTGAACAAGAAAAAGATAGAACATTGCTTAAGACTATCATAAAAGTTTGGAAAGAGATGAAATCCCTTCGAGAGTTCCAGAGATTTACAAATACTCCCTTGAAACTTGTTTTGAGAAAGGAAAAAGCTGACCAGAAAGCAGATGAAGAAGCATATGAAGCAGAAATTCAAGCTGAAATAAGTGAACTGTTAGAAGAGCACACGGAGGAGTACGCACAGAAGATGGAAGAATACAGAACGTCGTTACAACAGTGGAAGGCCTGGAGGAAAGTGCAAAGGGCCAAGAAGAAGAAAAGGAAACAAGCAGCAGAAGAACATCCCGGTGATGAGATTGCAGAGCCGTATCCCGAGGAGGACCTTGTGAAGCCCAGCCCTCCAGAGCCCACTGATCGGGCAGTGATAGAGCAGGAGGTGAGGGAGAGAGCAGCCCAGAGCAGGAGGAGGCCTTGGGAGCCCACGCTGGTCCCGGAGCTAAGCCTGGCAGGAAGCGTAACACCCAATGACCAGTGCCCCAGAGCGGAGGTCTCGAGAAGGGAGGATGTAAAGAAGCGCTCAGTGTACTTAAAAGTGCTGTTCAACAACAAGGAGGTGTCCAGGACAGTCAGTCGGCCACTAGGAGCAGACTTCCGAGTTCACTTTGGGCAGATTTTCAATTTGCAAATAGTCAACTGGCCGGAGAGTTTAACACTTCAGGTCTATGAAACTGTCGGACACAGTAGTCCCACCTTGCTAGCAGAAGTGTTTCTGCCTATTCCTGAGACTACTGTTGTCACTGGAAGGGCTCCTACTGAAGAAGTGGAGTTTAGCAGTAATCAGCATGTGACACTGGACCACGAGGGAGTTGGAAGTGGAGTGCCCTTCTCATTTGAAGCTGATGGCAGTAACCAGCTGACTCTGATGACCTCAGGGAAAGTGTCTCATAGTGTGGCATGGGCCATTGGAGAAAACGGGATACCTTTAATTCCTCC

【權利要求】
1.一種分離的編碼CC2D2A基因突變體的核酸，其特征在于，與SEQ ID N0:1相比，所述核酸具有選自下列的至少一種突變:c.2999Α>T，c.3688C>T。
2.一種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.GlulOOOVal、p.Argl230X, 任選地，所述多肽是由權利要求1所述的核酸編碼的。
3.一種篩選易患Joubert綜合征的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.2999Α>T，c.36880T的至少一種突變是所述生物樣品易患Joubert綜合征的指示， 任選地，所述生物樣品為選自人體血液， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA， 任選地，所述Joubert綜合征是常染色體隱性遺傳疾病。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基于所述RNA樣本，通過反轉錄反應，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進一步包括: 針對所述核酸樣本，構建核酸測序文庫；以及 對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果，任選地，采用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所述核酸測序文庫進行測序， 任選地,針對所述核酸樣本,構建核酸測序文庫進一步包括: 利用CC2D2A基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增；以及 針對所得到的擴增產物，構建所述核酸測序文庫， 任選地，所述CC2D2A基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:3_6所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易患Joubert綜合征的生物樣品的系統，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，是否具有c.2999A>T，c.3688C>T的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易患Joubert綜合征； 任選地，所述Joubert綜合征是常染色體隱性遺傳疾病。
7.根據權利要求6所述的系統，其特征在于，所述核酸提取裝置進一步包括: RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及反轉錄單元，所述反轉錄單元與所述RNA提取單元相連,用于對所述RNA樣本進行反轉錄反應，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。
8.根據權利要求6所述的系統，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進一步包括: 文庫構建單元，所述文庫構建單元用于針對所述核酸樣本，構建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構建單元相連，用于對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果， 任選地,所述文庫構建單元進一步包括: PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設置有CC2D2A基因外顯子特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO:3-6所示的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種。
9.一種用于篩選易患Joubert綜合征的生物樣品的試劑盒,其特征在于,含有: 適于檢測CC2D2A基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述CC2D2A基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.2999ΑΧ，c.3688C>T, 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地，所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO:3-6所示的核苷酸序列， 任選地，所述Joubert綜合征是常染色體隱性遺傳疾病。
10.一種構建體，其特征在于，包含權利要求1所述的分離的編碼CC2D2A基因突變體的核酸。
11.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是通過權利要求10所述的構建體轉化受體細胞而獲得的。
【文檔編號】C12M1/34GK104164424SQ201310184623
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優先權日:2013年5月17日
【發明者】江泓, 孫占芳, 陳召, 唐北沙, 肖晶晶, 咼軍, 張建國 申請人:中南大學湘雅醫院, 深圳華大基因科技有限公司