專利名稱：鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的方法及其專用引物對IS-857c的制作方法
技術領域：
本發明涉及鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的方法及其專用引物對IS-857。。
背景技術：
營養不親和系統是一種識別異己的遺傳系統，在多數真菌中，該系統能引起遺傳上明顯不同的個體在交接區產生特征性的體細胞不親和性(戚元成等，中國栽培糙皮側耳品種體細胞不親和性實驗與RAro分析結果的比較.菌物學報，2010，29 (3))反應，體細胞不親和性反應的強度因個體不同而異。在真菌中，營養不親和又稱為體細胞不親和或異核體不親和，它的作用在于防止同一種內交配型不同的個體或營養不親和位點上基因不同的個體間的融合，以保持個體遺傳上的穩定性。交配型是根據交配因子的個體間能否完成交配結合而確定的結合類型(中國標準出版社第一編輯室，中國農業標準匯編(食用菌卷).中國標準出版社，2010)。在真菌的有性生殖和營養生長過程中都存在一個自己或異己識別的機制或系統。有性生殖階段靠交配型因子識別；而營養生長階段的識別是靠異核體不親和系統來進行的。異核體不親和性是普遍存在于真菌中的一種生物學現象，在子囊菌、擔子菌、接合菌等真菌中是一種普遍存在的現象。在異核體形成過程中，非己識別系統通過一系列蛋白因子的相互作用最終導·致遺傳背景不同的核不能形成穩定的異核體，也就是所謂的異核不親和性。異核體不親和性是一個受基因調控的過程并且往往異核體不親和性的菌絲體會死亡。異核菌絲體在原生質體制備過程中出現單核原生質體的現象。這些單核原生質體經過再生培養和遺傳篩選成為原生質體單核體，由于原生質體單核體是直接來源于營養菌絲，沒有經歷過減數分裂的無性后代，它為食用菌的遺傳和育種研究提供了一種十分重要的基礎材料。原生質體單核體的雜交育種方式是把兩個分別來自雙核親本的原生質體單核體兩兩接入同一 PDA平板，對峙培養進行雜交。在雜交過程中，兩個原生質體單核體的細胞質進行重組，形成一個異質異核的雜交后代。這一方法的主要特點是，根據親本性狀不易在原生質體單核體中分散和稀釋，在育種程序中可以從一個比較小的變異范圍內去選擇具有親本性狀的不育單核體，有效地克服了傳統育種過程中由孢子單核體遺傳多樣性所造成的親本性狀分散和選材困難的障礙，減少了篩選雜交后代的工作量。同時，由于原生質體單核體是在實驗室條件下獲得的，無季節性限制，因此縮短了育種時間?；樝隳?Lepistasordida)屬于擔子菌亞門(Basidiomycomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香蘑屬(Lepista)。該菌營養豐富，具有一定的藥用功效。在中國主要分布于貴州、黑龍江、遼寧、河北、河南、甘肅、青海、四川、新疆、山西、內蒙古和福建等地，是一種名貴的食用菌和藥用菌，人工栽培花臉香蘑還處于小規模試驗階段，野生產量低且稀少，其價格極其昂貴，是一種很有開發潛力的野生菌種。但實際生產中存在產量低，抗蟲能力差，適應溫度范圍窄，子實體易碎，不易運輸、保存等亟待解決的難題。這就要求花臉香蘑的遺傳育種相關的基礎研究加大力度，為傳統的遺傳育種奠定堅實的理論基礎和技術支持。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的方法及其專用引物對IS-857C。本發明所提供的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的PCR引物對，名稱為IS-857c，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。其中，SEQ ID N0.1由24個脫氧核苷酸組成，SEQ ID N0.2由20個脫氧核苷酸組成。含有PCR引物對IS-857C的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的試劑或試劑盒也屬于本發明的保護范圍。所述試劑或試劑盒除PCR引物對IS-857C外，還含有進行PCR和DNA測序的其它常規試劑。本發明的實驗證明PCR引物對IS-857C、含有PCR引物對IS_857c的試劑或試劑盒可用于鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型。本發明所提供的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的方法，包括如下步驟:分別以待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對IS_857c進行PCR擴增，檢測所得到的PCR產物的大小，根據PCR擴增產物的大小按照下述方法確定所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型:如果所述待鑒別 的兩株花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物均含有500bp_800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物均為500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同或候選為交配型相同，如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物均不含有500bp-800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物均不為大小是500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同或候選為交配型相同；如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體中的一株待鑒別的花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物含有500bp-800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體中的一株待鑒別的花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物為500bp-800bp的DNA片段)，另一株待鑒別的花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物不含有500bp-800bp的DNA片段(或另一株待鑒別的花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物不為500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型不同或候選為交配型不同。上述方法中，所述500bp-800bp的DNA片段具體為765bp的DNA片段。在本發明的一個實施例中，所述PCR擴增采用的引物退火條件為57°C退火30s。所述PCR擴增中采用的PCR反應溫度程序如下:94°C預變性5min ;94°C變性30s，57°C退火30s, 72°C延伸 40s, 30 個循環；72°C延伸 7min。上述方法中，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同是指將所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體在一起培養，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的菌絲之間不產生鎖狀聯合；所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型不同是指將所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體在一起培養，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的菌絲之間產生鎖狀聯合。上述方法中，所述花臉香蘑具體可為花臉香蘑(lepista sordida) CFCC89562。實驗證明，本發明的特異性引物對IS-857C對花臉香蘑原生質體單核體具有特異性，本發明利用PCR引物對IS-857C鑒別花臉香蘑原生質體單核體間的交配型是否相同的方法與現有的體細胞不親和性實驗方法鑒別花臉香蘑原生質體單核體間的交配型是否相同的方法的一致性為100%。本方法縮短了花臉香蘑原生質體單核體交配型的鑒別時間并簡化了交配型鑒別的步驟，其準確性和可靠性高。通過原生質體單核化獲得的單核體稱為原生質單核體，與孢子單核體不同，原生質體單核體是在原生質體制備過程中從花臉香蘑異核菌絲體中直接得到的單核單倍體的無性后代，因此花臉香蘑的原生質單核體只有兩種形式的交配型AxBx和AyBy兩對。在常規的雜交育種中，只有交配型不同的單核菌株是雜交可育的，因此交配型的鑒定是雜交育種的前提和必要條件。本發明對研究花臉香蘑的遺傳育種及生產實踐具有重要意義。本發明適用于食用菌生產、菌種選育等相關專業領域對花臉香蘑原生質體原生質單核體的鑒別及遺傳育種等方面的研究。


圖1為用本發明引物對IS-857C對部分花臉香蘑原生質體單核體的PCR擴增產物電泳圖。 圖中I至12對應的菌株依次為:110號，58號，99號，67號，55號，137號，179號，69 號，104 號，139 號，100 號，雙核菌株；M:DNA Marker。圖2為用引物ISSR引物ISSR-UBC857對花臉香蘑原生質體單核體進行PCR的電泳圖。圖中I至12對應的菌株依次為:110號，58號，99號，67號，55號，137號，179號，69 號，104 號，139 號，100 號，雙核菌株；M:DNA Marker。圖3為交配型不同的兩株花臉香蘑原生質體單核體的菌絲之間產生的鎖狀聯合照片。圖中箭頭示鎖狀聯合。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的花臉香蘑均為花臉香蘑(Lepista sordida) CFCC89562,公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會林業微生物中心(中國林業微生物菌種保藏管理中心，China Forestry Culture Collection Center 英文縮寫 CFCC,簡稱林業微生物中心)獲得。在下文中，均簡稱花臉香蘑。1、下述實施例中的花臉香蘑原生質體單核體均通過原生質體單核化獲得，具體方法如下:1.1培養基MM緩沖液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為50mM馬來酸緩沖液(pH5.5);所述溶質及其在MM緩沖液中的濃度如下:0.5M甘露醇。液體MCM培養基:將酵母提取物2g、胰蛋白胨2g、葡萄糖20g、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀0.5g和磷酸氫二鉀Ig溶于水并用水定容至1L。固體MCM平板:在液體MCM培養基中添加瓊脂，使其濃度為20g/L。固體再生平板(RM)的制備方法:在液體MCM培養基中添加山梨醇和瓊脂，使其濃度分別為IM和20g/L。1.2原生質體制備I)取花臉香蘑菌絲于液體MCM培養基中，160rpm、25°C培養4天(3-5天均可)，用3層無菌擦鏡紙過濾并收集菌絲，然后用0.6M甘露醇水溶液洗滌2-3次。2)將步驟I)的花臉香蘑菌絲(約Ig)懸浮于1.5%溶壁酶溶液(將1.5g溶壁酶用
0.6M甘露醇水溶液溶解并定容至IOOmL ;溶壁酶購自廣東碧德生物科技有限公司，產品目錄號出(1_8110001023)，在水浴搖床(321:、60印111)中溫浴2小時，用3層無菌擦鏡紙過濾并收集濾液。3)將步驟2)的濾液3000rpm離心IOmin并收集沉淀。4)將步驟3)的沉淀用MM緩沖液洗滌三次后，懸浮于100 μ I MM緩沖液中，即為原生質體溶液。1.3原生質單核體的獲得將獲得的原生質體用麗緩沖液稀釋至濃度為IO3-1O4個/mL，均勻涂布于RM上，28 °C靜置培養10-14天；待生長出來單菌落后用無菌接種針轉接至固體MCM培養基上，28 V培養5-7天。將獲得的原生質單核體依次編號，并在放大1000倍的顯微鏡(Olympus BX51)下觀察，如果沒有發現鎖狀聯合，則該菌株為花臉香蘑原生質體單核體。共得到30株花臉香蘑原生質體單核體，它們的編號分別為36、42、50、53、55、58、61、65、66、67、69、71、72、75、81、82、86、87、88、99、100、104、110、111、113、117、119、137、139、179。2、鑒別花臉香蘑原生質體單核體的交配型是否相同待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同是指將待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體在一起培養，該待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的菌絲之間不產生鎖狀聯合；待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型不同是指將待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單 核體在一起培養，該待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的菌絲之間產生鎖狀聯合。1.3中的30株花臉香蘑原生質體單核體間的交配型按照下述體細胞不親和性實驗方法鑒別:PDA培養基:200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水IOOOml煮沸半個小時，紗布過濾，取濾液再加20g葡萄糖和20g瓊脂，121°C滅菌20分鐘。將兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質體單核體一起接種到PDA培養基上，兩者之間間開2cm，25°C培養10天進行觀察。如果肉眼觀察兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質體單核體的菌絲長在一起，通過顯微鏡觀察進一步確認交接處的菌絲沒有鎖狀聯合，該兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同。如果肉眼觀察兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質體單核體的菌絲交匯的地方有拮抗線，則挑取拮抗線上的菌絲，接種至PDA培養基上25°C培養5天后，再通過顯微鏡觀察是否有鎖狀聯合，若無鎖狀聯合，該兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同；若有鎖狀聯合，該兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質體單核體的交配型不同。圖3顯示了交配型不同的兩株花臉香蘑原生質體單核體的菌絲之間產生的鎖狀聯合。按照該方法鑒別1.3得到的30株花臉香蘑原生質體單核體的交配型，結果如表I和2所示。表I和表2中，“ V ”表示兩個菌株之間體細胞不親和性實驗結果表明兩個菌株的交配型不同X ”表示兩個菌株之間體細胞不親和性實驗結果表明兩個菌株的交配型相同。表1.體細胞不親和性實驗方法鑒別花臉香蘑原生質體單核體間的交配型是否相同的結果
權利要求
1.鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的方法，包括如下步驟:分別以待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR弓丨物對進行PCR擴增，檢測所得到的PCR產物的大小，根據PCR擴增產物的大小按照下述方法確定所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型: 如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物均含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同或候選為交配型相同，如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物均不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同或候選為交配型相同；如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體中的一株待鑒別的花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物含有500bp-800bp的DNA片段，另一株待鑒別的花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型不同或候選為交配型不同。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述500bp-800bp的DNA片段為765bp的DNA片段。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增采用的引物退火條件為57°C退火30s。
4.根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增中采用的PCR反應溫度程序:94°C預變性5min ;94°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸40s，30個循環；72°C延伸7min。
5.權利要求1-4中任一所述的方法在花臉香蘑育種中的應用。
6.鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的PCR引物對，其特征在于:所述引物對的名稱為IS-857c，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。
7.含有權利要求6所述的PCR引物對的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的試劑。
8.含有權利要求6所述的PCR引物對的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的試劑盒。
9.權利要求6所述的PCR引物對、權利要求7所述的試劑或權利要求8所述的試劑盒在鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型中的應用。
10.權利要求6所述的PCR引物對、權利要求7所述的試劑或權利要求8所述的試劑盒在花臉香蘑育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了鑒別花臉香蘑原生質體單核體交配型的方法及其專用引物對IS-857c。該方法包括分別以待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進行PCR擴增，檢測所得到的PCR產物的大小，如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的PCR產物均含有或均不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型相同；如果其中的一株含有500bp-800bp的DNA片段，另一株不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質體單核體的交配型不同。
文檔編號C12Q1/68GK103224991SQ20131018803
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月20日 優先權日2013年5月20日
發明者許峰, 劉宇, 耿小麗, 王守現, 趙爽, 李登進, 王鵬, 王蘭青 申請人:北京市農林科學院