專利名稱：用于轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的改進(jìn)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于向植物細(xì)胞原生質(zhì)體中引入感興趣的外來分子的方法。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞原生質(zhì)體和用于實施所述方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
遺傳改造是刻意創(chuàng)造活細(xì)胞遺傳物質(zhì)變化的方法，所述方法目的在于改造那種細(xì)胞或者由細(xì)胞構(gòu)成其一部分的器官或由細(xì)胞再生的器官的一種或多種遺傳編碼的生物學(xué)屬性。這些變化可以采取刪除部分遺傳物質(zhì)、加入外源性遺傳物質(zhì)或者像遺傳物質(zhì)中現(xiàn)有 核苷酸序列的替換的變化的形式。用于真核生物遺傳改造的方法為人們所知已超過20年，并且已發(fā)現(xiàn)其廣泛應(yīng)用于植物和動物細(xì)胞和微生物以改善農(nóng)業(yè)、人類健康、食品質(zhì)量和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域。遺傳改造的常見方法由向細(xì)胞基因組中加入外源性DNA片段組成，然后這將賦予那種細(xì)胞或其有機(jī)體除了通過已經(jīng)現(xiàn)有的基因編碼的屬性以外的新的屬性(包括其中現(xiàn)有基因的表達(dá)將因此被抑制的應(yīng)用)。盡管很多這樣的實例可以有效地獲得所需的屬性，但是這些方法不是非常準(zhǔn)確，因為無法控制外源性DNA片段插入其中的基因組位置(并因此無法控制最終的表達(dá)水平)，并且因為所需的效果將其自身體現(xiàn)在由原始的且均衡的基因組編碼的自然屬性之上。遇到的一個常見問題是，由于外源性DNA片段在宿主基因組DNA中的隨機(jī)整合，必要或有利的基因被失活或修飾，造成宿主所需特征的不必要的損失。相反，將導(dǎo)致預(yù)定義的基因組基因座中核苷酸的加入、刪除或轉(zhuǎn)化的遺傳改造的方法將允許現(xiàn)有基因的精確改造。隨著過去十年里基因組學(xué)的出現(xiàn)，現(xiàn)在有可能迅速且成本有效地地破譯動物、植物和細(xì)菌的基因組。這已經(jīng)導(dǎo)致大量的能夠與如動物的疾病易感性或植物的產(chǎn)量特征的表型有關(guān)的基因和調(diào)節(jié)序列。這將允許迅速建立序列的假定功能，但是一個基因?qū)σ环N觀察到的表型負(fù)責(zé)的最終證明必須通過創(chuàng)建顯示預(yù)期的改變的表型的突變系來獲得。不同于動物細(xì)胞，植物細(xì)胞由多糖和蛋白質(zhì)的混合物組成的厚厚的細(xì)胞壁包圍，而動物細(xì)胞可以輕易地服從外來分子的引入，植物細(xì)胞更加頑固并且需要稍微更加侵略性的方法。為了向植物細(xì)胞中引入外來分子的現(xiàn)有技術(shù)程序可以分為2種類別。第一類重組了采用通過刺穿植物細(xì)胞壁向植物細(xì)胞中機(jī)械引入感興趣的分子的所有方法。這能夠通過生物彈道遞送(biolistics delivery)來完成,其中將感興趣的分子包被在金屬珠(金或鎢)上，使用氣體加壓裝置將其推進(jìn)到細(xì)胞中。然而，這種方法的效率相當(dāng)?shù)筒⑶乙驗椴皇撬械募?xì)胞都被轉(zhuǎn)化，選擇是必須的，其限制了目標(biāo)的數(shù)目。另一種方法使用了連接到一個微型操縱器上的微-或納-針將化合物穿過細(xì)胞壁直接注射到植物細(xì)胞中。然而，微注射需要特殊設(shè)備和大量技巧。該方法同樣是單調(diào)的和費時的并且相較于生物彈道遞送幾乎沒有提供優(yōu)勢。但另一種方法使用了碳納米管，其含有感興趣的分子并且其末端包被有細(xì)胞壁消化酶。據(jù)說，納米管將局部地降解細(xì)胞壁并刺穿質(zhì)膜允許其內(nèi)容物遞送進(jìn)入宿主細(xì)胞。雖然與微注射或生物彈道轟擊(biolistics bombardment)相比侵略性較低，上述限制也適用于此。第二類重組了其中在引入感興趣的分子之前用酶將整個植物細(xì)胞壁移除的所有方法。細(xì)胞壁的完全移除破壞了細(xì)胞之間的聯(lián)系，產(chǎn)生了個體化細(xì)胞的均勻混懸物，其允許更均勻和更大規(guī)模的轉(zhuǎn)染實驗。這包括，但不僅限于，原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。因此，原生質(zhì)體的制備是一種產(chǎn)生數(shù)百萬細(xì)胞的非常可靠和廉價的方法，并且由于其靈活性、效率和產(chǎn)量，通常比其它方法優(yōu)選。幾乎能夠從每一種植物組織中分離原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的主要來源是葉肉組織，其每克鮮重產(chǎn)生大量的原生質(zhì)體。其它組織類型的使用主要取決于現(xiàn)有程序?qū)τ谒紤]的系統(tǒng)和實驗最終目標(biāo)的可用性。許多生物學(xué)過程，若非全部，是空間上和時間上調(diào)節(jié)的。一個細(xì)胞都有其自己的生物鐘，細(xì)胞周期是其最明顯的表現(xiàn)。每一個細(xì)胞將經(jīng)歷一系列發(fā)展階段如生長(G0、G2)、
DNA復(fù)制(S)、分裂(M)和靜止(G0)。因此，當(dāng)設(shè)計意圖與特異性通路相互作用的實驗時，其與處理所考慮的系統(tǒng)狀態(tài)有關(guān)。感興趣的分子的引入必須要仔細(xì)地定時以便匹配研究的方法。感興趣的分子或者必須在很長一段時間里在細(xì)胞環(huán)境中保持穩(wěn)定直至它可以執(zhí)行其活性或者必須在所研究的方法開始之前不久被遞送。例如，在通過向細(xì)胞中引入標(biāo)記的微管蛋白早前期帶(pre-prophase band)形成期間的微管動力學(xué)研究中，必須確定的一點是微管蛋白在早前期帶的形成之前不久被遞送，除非標(biāo)記的微管蛋白足夠穩(wěn)定以抵擋酶降解直至早前期帶形成開始。對于特定的實例，另一個考慮是向結(jié)構(gòu)中而非早前期帶中并入熒光微管蛋白，并因此需要在所需的時間遞送探針。不幸的是，除了細(xì)胞混懸培養(yǎng)物的極少數(shù)情況以外，原生質(zhì)體能夠從中衍生出來的葉肉細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)(GO)，并且只有當(dāng)采用一個適當(dāng)?shù)募に仄胶庥|發(fā)原生質(zhì)體時，它們將重新進(jìn)入細(xì)胞周期并積極地開始流動。一個靜止原生質(zhì)體經(jīng)過一輪細(xì)胞周期所需的時間在系統(tǒng)之間有很大不同，并且能夠從幾個小時到幾天。此外，一旦用于生成原生質(zhì)體的酶混合物被清洗掉，原生質(zhì)體就開始再形成其細(xì)胞壁，如果不采取預(yù)防措施來減緩或阻止細(xì)胞壁再形成，這將降低甚至完全阻止外來分子的引入。因此，當(dāng)要遞送感興趣的分子時原生質(zhì)體不能置之不理直至它們達(dá)到適當(dāng)?shù)碾A段，必須積極地預(yù)防細(xì)胞壁的再形成同時應(yīng)該保留原生質(zhì)體的流動能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明已經(jīng)著手克服本領(lǐng)域的這些缺點并且已經(jīng)發(fā)明一種方法，在所述方法中能夠更加有效地并且以更加可控的方式控制和轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體和細(xì)胞周期。本發(fā)明人目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，兩個轉(zhuǎn)染步驟的組合允許原生質(zhì)體中幾個生物學(xué)過程的詳細(xì)控制。兩個轉(zhuǎn)染步驟的組合可以與細(xì)胞壁抑制劑的使用，和/或細(xì)胞時相(phase)同步步驟組合。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在第一轉(zhuǎn)染步驟中與某些通路相互作用和/或?qū)е码p鏈DNA斷裂并且在第二轉(zhuǎn)染步驟中采用外來分子進(jìn)行轉(zhuǎn)染的各種組合物的引入允許轉(zhuǎn)染過程改進(jìn)的效率和控制。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過向原生質(zhì)體中加入一種或多種非酶化學(xué)化合物，所述化學(xué)化合物干擾細(xì)胞壁的形成如通過抑制纖維素合成酶、纖維素沉積或捕捉新興的纖維素微纖絲，通過外來分子的遞送在時間上更加接近細(xì)胞周期中所需時相的可能性，外來分子引入的時機(jī)和效率能夠被增強(qiáng)和優(yōu)化。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過在特定的細(xì)胞時相同步細(xì)胞，可以實現(xiàn)增加的轉(zhuǎn)染。從更廣泛的方面講，錯配修復(fù)系統(tǒng)和/或NHEJ通路和/或DNA雙鏈斷裂的引入的(瞬時)抑制以及(ii)采用感興趣的外來分子如致突變的寡核苷酸的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)染，任選地與原生質(zhì)體系統(tǒng)中細(xì)胞壁再形成的瞬時抑制和/或細(xì)胞周期時相的同步結(jié)合是非常有價值的，當(dāng)細(xì)胞系統(tǒng)必須在細(xì)胞周期的特殊階段被轉(zhuǎn)染時，當(dāng)細(xì)胞在特定生物/生化過程中變得熟練時，所述過程在時間上遠(yuǎn)離原生質(zhì)體分離的時間點。此外，原生質(zhì)體系統(tǒng)中細(xì)胞壁再形成的瞬時抑制允許瞬時表達(dá)的質(zhì)粒的順序引入，其組合作用導(dǎo)致所需的結(jié)果。例如，如果某時引入ZFN構(gòu)建體，例如，在引入供體構(gòu)建體之前的4、6、12、18或24小時，基因靶向是更有效的。這允許ZFNs被表達(dá)并且誘導(dǎo)對于適當(dāng)?shù)幕虬邢蚴录匦璧腄SBs的發(fā)生。發(fā)明詳述在第一個方面中，本發(fā)明涉及用于向植物細(xì)胞原生質(zhì)體中引入一種或多種感興趣 的分子的方法，所述方法包含下列步驟-通過酶降解和/或從植物細(xì)胞中移除細(xì)胞壁來提供植物細(xì)胞原生質(zhì)體；-進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第一轉(zhuǎn)染，所述轉(zhuǎn)染采用i.能夠改變選自錯配修復(fù)系統(tǒng)、非同源性末端連接(non-homologous endjoining)的一種或多種通路的調(diào)節(jié)的第一組合物；和/或ii能夠誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的第二組合物-采用一種或多種感興趣的分子進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第二轉(zhuǎn)染；-允許細(xì)胞壁形成；其中第二轉(zhuǎn)染在第一轉(zhuǎn)染之后進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的是，術(shù)語“和/或”在本發(fā)明的范圍中意味著可以進(jìn)行采用第一組合物的轉(zhuǎn)染、或者采用第二組合物的轉(zhuǎn)染、或者采用二者的轉(zhuǎn)染。所以根據(jù)本發(fā)明的第一轉(zhuǎn)染，及其實施方案可以包含第一組合物或第二組合物或二者。在方法的第一步中，從植物細(xì)胞中提供原生質(zhì)體。使用用于產(chǎn)生植物細(xì)胞原生質(zhì)體的常用程序(例如，使用軟化霉素)能夠提供原生質(zhì)體。迄今為止，植物細(xì)胞原生質(zhì)體系統(tǒng)已被描述用于番爺(番爺(Solanum Lycopersicon))、煙草(煙草(Nicotianatabaccum))和許多其他(油菜(Brassica napus)、胡蘿卜(Daucus carota)、生菜(Lactucca sativa)、玉米(Zea mays)、本氏煙草(Nicotiana benthamiana)、矮牽牛(Petunia hybrida)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、亞洲水稻(Oryza sativa))。本發(fā)明通常適用于任何原生質(zhì)體系統(tǒng)，包括但不限于文中所列的那些。原生質(zhì)體可以源自(不活躍分裂的)葉肉細(xì)胞、從(活躍分裂的)分生組織培養(yǎng)物中和從(活躍分裂的)細(xì)胞混懸物。采用能夠改變一種或多種通路的調(diào)節(jié)的第一組合物能夠轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，所述通路選自錯配修復(fù)系統(tǒng)、非同源性末端連接通路。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染是瞬時的。優(yōu)選地，錯配修復(fù)系統(tǒng)、非同源性末端連接通路是下調(diào)的。優(yōu)選地，通過能夠調(diào)節(jié)這些通路的dsRNAs來完成通路的調(diào)節(jié)。用于適當(dāng)組合物的選擇和設(shè)計的實例和指導(dǎo)在下文中提供。在一個實施方案中，第一組合物能夠改變MutS、MutL, MutH, MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLHl、MLH2、MLH3、PMSl、DNA-PK 復(fù)合物 Ku70、Ku80、Ku86、Mrell、Rad50、RAD51、XRCC4、Nbsl 中一種或多種的調(diào)節(jié)。錯配修復(fù)系統(tǒng)許多損傷通過所謂的錯配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)得到修復(fù)。在大腸桿菌中，MMR由3種主要復(fù)合物組成，MutS、MutL和MutH。MutS參與錯配的識別和向第二復(fù)合物MutL (其募集MutH)發(fā)送信號。MutH具有切口(nick)活性，所述切口活性將在包含錯配的新合成的DNA鏈中引入切口。在新合成的鏈中的切口的存在給外切核酸酶發(fā)送信號，待降解的DNA延伸片段，包括錯配核苷酸。然后DNA聚合物將填充子鏈中的缺口。除了其功能通過MutL實現(xiàn)的MutH以外，在所有真核細(xì)胞中能夠發(fā)現(xiàn)大腸桿菌MMR基因的直系同源(為了回顧，參見Ko I ο dner&Mar s i shky 1999, Curr. Opin. Genet. Dev. 9 :89-96)。在植物中，存在有四種 MutS直系同源(MSH2、MSH3、MSH6 和 MSH7)和四種 MutL 直系同源(MLH1、MLH2、MLH3 和 PMSI)。由MutS a (MSH2: :MSH6異二聚體)完成堿基_堿基錯配對或單一超螺旋核苷酸的錯配識另O，然而由MutSP (MSH2::MSH3異二聚體)識別更大的超螺旋環(huán)出。MSH7基因已經(jīng)在植物
中得到鑒定，但是迄今為止未在動物中得到鑒定。MSH7與MSH6最相似并且同樣與MSH2形成異二聚體(MutS Y ) (Culligan&Hays,2000, Plant Cell :991-1002)。MMR 通路在圖 I中闡明，來自于 Li，2008Cell Research 18:85-98。目前，已經(jīng)提出用于植物原生質(zhì)體中特異性mRNA的瞬時抑制的方法(An等人2003Biosci. Biotechnol. Biochem. . 67 =2674-2677)并且現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對于植物中(內(nèi)源性)MMR基因的瞬時抑制而言，這是一種有價值的工具。可用于用來改變通路(比如dsRNA的產(chǎn)生)的調(diào)節(jié)的組合物的來自于與MMR通路有關(guān)的基因的序列(如MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1、MLH2、MLH3和PMS1)從公共數(shù)據(jù)庫中可得到，如對于AtMSH2GenBank登錄號AF002706. I以及文中其它部分所描述的。通過設(shè)計基于例如可得到的擬南芥序列并隨后鑒定所需的直系同源的引物能夠鑒定所需植物的特異性序列。毒性最強(qiáng)的損傷是DNA雙鏈斷裂(DSB) oDSB能夠來自于內(nèi)源性或外源性基因毒性藥物的作用，如活性氧種類-尤其是羥自由基-電離輻射或化學(xué)品(包括用于治療癌癥的化療藥物)。細(xì)胞過程如其它DNA損傷類型的修復(fù)，或DNA復(fù)制也引起DSB。例如，通過核苷酸-或堿基-切補(bǔ)修復(fù)的DNA修復(fù)涉及內(nèi)切核酸酶，其引入單鏈切口。兩條DNA鏈上單鏈切口或缺口的同時出現(xiàn)導(dǎo)致DSB的形成。在一個類似的方式中，復(fù)制叉上游的單鏈切口或缺口能夠通過DNA雙螺旋的解旋加工成DSB (Bleuyard等人，2006，DNA repair 5 :1-12)。存在兩個競爭性通路(圖2，來自于Branzei和Foiani，2008-8 (9) =1038-46)來修復(fù)DSBs，即非同源性末端連接(NHEJ)和同源重組(HR)。優(yōu)選通過在Gl時相過程中的非同源性末端連接(NHEJ)修復(fù)雙鏈斷裂(DSBs)并且通過在細(xì)胞周期的S和G2時相過程中的同源重組(HR)修復(fù)雙鏈斷裂(DSBs)。將Ku異二聚體結(jié)合到DSBs上觸發(fā)了 DNA-PK催化亞基的募集和通過NHEJ的DSBs的封閉。相比之下，在S和G2時相過程中發(fā)生的DSBs優(yōu)選通過MRE111-RAD50-NBS1復(fù)合物激活A(yù)TM。特異于細(xì)胞周期S和G2時相的較高周期素依賴性激酶(CDK)活性促進(jìn)DSB切除，暴露出的單鏈DNA(ssDNA)的3'突出。當(dāng)ssDNA的3'突出包被有復(fù)制蛋白A(RPA)時，它激活A(yù)TR ;在介導(dǎo)蛋白如RAD52的幫助下RPA能夠被RAD51移除并替換。這導(dǎo)致RAD51突觸前絲的形成，其通過入侵雙鏈體中同源區(qū)域以形成稱作D環(huán)的DNA連接(joint)來引發(fā)HR,所述D環(huán)能夠通過DNA合成進(jìn)一步延伸。通過DNA解旋酶的這種中間體的鏈置換將反應(yīng)引向合成依賴性鏈退火(SDSA)。或者，第二 DSB末端能夠被捕獲，引起雙Holliday交叉中間體，其能夠通過內(nèi)切核酸酶來解決或者通過解旋酶(BLM)和拓?fù)洚悩?gòu)酶(T0P3)的聯(lián)合作用來溶解。非同源性末端連接通路NHEJ是DSB修復(fù)的主要通路，并且涉及重新結(jié)合平末端或具有短突出的末端，并且以斷裂末端的識別和并置(juxtaposition)作為開始。這是通過由KU異二聚體(Ku70和Ku80 [或Ku86])和DNA-PK催化亞基(DNA-PKcs)組成的DNA-PK復(fù)合物促進(jìn)的。DSB末端的成熟由Artemis實現(xiàn)的(圖3,來自于Goodarzi等人,2006)并由Xrcc4/DNA連接酶IV復(fù)合物重新封閉。NHEJ是一個相對不精確的過程并且經(jīng)常伴隨著DNA序列的插入和刪除(Bleuyard等人，2006，Goodarzi 等人，2006The EMBOjournal 25 :3880-3889)。幾個基因已知在NHEJ中發(fā)揮作用，所述基因包括KU70、KU80和PARP-I。 可用于用來改變通路(比如dsRNA的產(chǎn)生)的調(diào)節(jié)的組合物的來自于與NHEJ通路有關(guān)的基因的序列從公共數(shù)據(jù)庫中可得到，如對于AtKU70的GenBank登錄號AF283759. I以及文中其它部分所描述的。通過設(shè)計基于例如可得到的擬南芥序列并隨后鑒定所需的直系同源的引物能夠鑒定所需植物的特異性序列。同源重纟目誦路HR是一種準(zhǔn)確的修復(fù)過程，其使用姐妹染色單體作為模板并因此保證了修復(fù)的保真度。通向HR修復(fù)的第一步是DSBs的切除以形成單鏈3'突出。通過由Mrell、Rad50和Nbsl蛋白質(zhì)組成的MRN復(fù)合物來實現(xiàn)末端加工。在輔助蛋白質(zhì)的幫助下，Rad51在單鏈末端上被募集并且促進(jìn)了同源雙鏈體的入侵(圖4，來自于Sugiyama等人，2006The EMBOjournal,1-10)。然后通過DNA合成和捕獲的第二 DSB末端來延伸捕獲的鏈，導(dǎo)致由內(nèi)切核酸酶來消除的雙-Holliday的形成，導(dǎo)致可通過解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的組合作用來消除的交叉的形成(Bleuyard 等人，2006 ；Branzei 和 Foiani，2008)。在一個實施方案中，可以采用能夠誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂的第二組合物進(jìn)行第一轉(zhuǎn)染。實例是鋅指核酸酶和大范圍核酸酶(Cellectis，法國)，和TAL效應(yīng)子核酸酶(Bosch等人(2009) Science 326 :1509-1512 ;Moscou 等人(2009) Science Vol326 :1501)。使用已知的技術(shù)將鋅指核酸酶如此設(shè)計以便它們優(yōu)選在所需的位置誘導(dǎo)雙鏈斷裂，其中第二轉(zhuǎn)染在與靶向突變有關(guān)的某些實施方案中旨在從致突變的寡核苷酸中引入突變。鋅指核酸酶是通常設(shè)計成用于切斷特定DNA序列的蛋白質(zhì)。鋅指結(jié)構(gòu)域包括當(dāng)通過鋅離子穩(wěn)定時折疊成特征性結(jié)構(gòu)的大約30個氨基酸。鋅指結(jié)構(gòu)域通過插入到DNA螺旋的大溝中能夠結(jié)合到DNA上。每一個鋅指結(jié)構(gòu)域通過鋅指α螺旋區(qū)域上的關(guān)鍵的氨基酸殘基能夠結(jié)合到具體的DNA三聯(lián)體(3bps)上。因此，通過改變這些關(guān)鍵的氨基酸，有可能改變鋅指對特定三聯(lián)體的識別特異性并從而創(chuàng)造鋅指構(gòu)建體，專門針對感興趣的序列。系統(tǒng)的靈活性來自于鋅指結(jié)構(gòu)域可以串聯(lián)到一起以結(jié)合到長的DNA序列上的事實。例如，串聯(lián)的6個鋅指結(jié)構(gòu)域識別了特異的18bps序列，序列在復(fù)雜的真核細(xì)胞基因組中足夠長以至于是獨特的。鋅指核酸酶(ZFN)由一系列融合至核酸酶Fokl的鋅指組成。ZFN被引入到細(xì)胞中，并且將識別并結(jié)合到特異的基因組序列上。因為Fokl核酸酶以二聚體的形式切割，所以需要第二 ZFN，其在切割位點對面的DNA鏈上識別特異的序列。然后在兩條靶向DNA序列之間進(jìn)行DNA切割或雙鏈斷裂(DSB) (Miller 等人，2007Nature Biotech 25(7) :778-785 ;Cathomen 和 Joung，2008Mol Therl6(7) :1200-1207 ;Foley 等人，2009PLoS ONE 4(2) :e4348)。在同源序列(其可以是姐妹染色單體或者是供體DNA構(gòu)建體)存在的情況下，DSB能夠通過HR來修復(fù)。不是姐妹染色單體被用于修復(fù)，而是信息從引入細(xì)胞的供體構(gòu)建體中被拷貝，借此這是基因靶向過程的基礎(chǔ)。供體構(gòu)建體包含與原來染色體基因座相比的改變，因此HR的過程中將這些改變并入基因組。第一轉(zhuǎn)染可能包含同時地或相繼地(一個接著一個)采用第一和第二組合物二者的轉(zhuǎn)染。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，進(jìn)行第二轉(zhuǎn)染以引入一種或多種感興趣的分子。感興趣的分子能夠選自化學(xué)品、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和肽。在某些實施方案
中，感興趣的分子選自dsRNA、miRNA、siRNA、質(zhì)粒、致突變的寡核苷酸，更優(yōu)選致突變的寡核苷酸。在某些實施方案中，可以使用編碼ZFN構(gòu)建體的質(zhì)粒作為感興趣的分子。然后，第二轉(zhuǎn)染步驟引入ZFN構(gòu)建體,其通過表達(dá)能夠誘導(dǎo)可用于足跡法(footprinting)的DSBs。在某些實施方案中，致突變的寡核苷酸能夠被用作感興趣的分子。一旦轉(zhuǎn)染到原生質(zhì)體中，致突變的寡核苷酸能夠提供原生質(zhì)體DNA的改變。優(yōu)選地，針對致突變的寡核苷酸的靶DNA來自于核DNA。或者，能夠使用葉綠體或線粒體DNA。原則上，能夠使用迄今為止本領(lǐng)域中描述的任何致突變的寡核苷酸，如RNA/DNA嵌合寡核苷酸、包括那些含有LNAs、硫代磷酸酯/鹽、丙炔替代物等的寡核苷酸。因此，致突變寡核苷酸作為感興趣的分子的使用提供了寡核苷酸介導(dǎo)的靶向核苷酸交換(ODTNE)。寡核苷酸介導(dǎo)的靶向核苷酸交換(ODTNE)寡核苷酸介導(dǎo)的靶向核苷酸交換(ODTNE)是指通過引入突變(如單點突變或刪除/插入)利用單鏈寡核苷酸來改正或改變基因組基因座，從而恢復(fù)原有的基因功能。這個概念是基因治療和個性化用藥的基礎(chǔ)并且在全球得到廣泛研究(Parekh-Olmedo等人，2002，Neuron 33:495-498；Madsen 等人，2008PNAS 105 :10，3909-3914 ；Leclerc 等人，2009BMC Biotechnology 9 :35，1_16)。影響ODTNE的有效性和效率的幾個參數(shù)已被鑒定，然而一些仍然需要驗證，目前十分確定的是，功能MMR系統(tǒng)抵消了 0DTNE(Igoucheva等人，200801igonucIeotides 18 :111-122 ;Kennedy Maguire 和 Kmiec,2007Gene 386:107-114;Papaioannou等人，2009J. Gene Med. 11 :267-274)。在該技術(shù)中起作用的ODTNE的使用以及寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和設(shè)計得到很好地描述，尤其在W098/54330、W099/25853、W001/24615、W001/25460、W02007/084294,W02007073149, W02007073166,W02007073170, W02009002150中。基于文中所公開的致突變的寡核苷酸的結(jié)構(gòu)特征和來自于靶序列(待改變的基因)的序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計出在第二轉(zhuǎn)染步驟中使用的所需的致突變的寡核苷酸。在本發(fā)明中使用的致突變的寡核苷酸具有與本領(lǐng)域中使用的其它致突變的寡核苷酸一致的長度，即典型地介于10-60個核苷酸之間，優(yōu)選20-55個核苷酸，更優(yōu)選25-50個核苷酸。使用致突變的寡核苷酸的本發(fā)明能夠用于例如改變細(xì)胞、通過恢復(fù)到野生型來改正突變、誘導(dǎo)突變、通過破壞編碼區(qū)使酶失活、通過改變編碼區(qū)來改造酶的生物活性、通過破壞編碼區(qū)來改造蛋白質(zhì)、改造miRNA靶、改造前體基因和很多更多的目的。在某些實施方案中，感興趣的分子是DNA構(gòu)建體。DNA構(gòu)建體是含有期望要被引入到細(xì)胞中(基因靶向)的序列信息的DNA序列。DNA構(gòu)建體可以是ZFN構(gòu)建體。轉(zhuǎn)染(第一和第二轉(zhuǎn)染二者)能夠使用本領(lǐng)域中描述的方法如電穿孔、生物彈道技術(shù)、PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等來完成。優(yōu)選PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。使用當(dāng)前水平的本領(lǐng)域方法可以實現(xiàn)常規(guī)的轉(zhuǎn)染如PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(優(yōu)選的)或生物彈道技術(shù)(Sporlein等人(1991) Theor. Appl. Genet. 82,712-722 ;Mathur 和Koncz. Methods in Molecular Biology.Vol. 82 Arabidopsis protocols. J. Marinez-Zapater 和 J. Salinas 編輯 Humana PressInc. TotowaNJ. ;Golds 等人(1993) Bio/Technology 11,95-100)。基因靶向是一個非常強(qiáng)大的技術(shù)，其在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)中有許多應(yīng)用。它允許基因組的精確操縱，使生物學(xué)家能夠研究并開發(fā)基因功能。然而，HR在幾乎所有細(xì)胞類型中的效 率都是低的，因為它依賴于染色體基因座上DSB的存在。因此，ZFN的有用性是其在任何染色體基因座誘導(dǎo)DSB的能力，并且已被用于改善基因靶向效率100倍。一旦產(chǎn)生DSB，它可以通過NHEJ或者HR通路來修復(fù)。可以通過抑制NHEJ通路來增強(qiáng)HR的效率，并從而增強(qiáng)基因靶向的效率，從而DSB可以通過HR來修復(fù)。確實，這已被證明是在人類和真菌細(xì)胞的情況(Fattah 等人 2008Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 :8703-8708 ;Meyer 等人 2007J.Biotechnologyl28 :770-775 ；Bertolini 等人，2009Mol. Biotechnol. 41 :106-114)。NHEJ和HR之間的選擇也可能依賴于細(xì)胞周期時相，在Gl中，由于同源模板的缺失，NHEJ占主導(dǎo)地位，而HR在G2/M中更加活躍，在G2/M中存在有同源姐妹染色單體(Branzei和Foiani，2008, Nature綜述了分子生物學(xué))。植物育種中的ODTNE和ZFN植物育種通過常規(guī)雜交采用自然遺傳變異來改善植物性能。然而，自然的變異是有限的并且對于育種計劃而言需要很多年才能產(chǎn)生一個有價值的新品種。可以人工地和傳統(tǒng)地創(chuàng)造遺傳變異，這通過向宿主植物的基因組中引入許多突變的化學(xué)突變完成。少數(shù)突變將最終提供感興趣的表型并且能夠用于育種計劃。然而，這些方法具有缺點如需要許多回交以消除殘余的突變和由此類化學(xué)品引入的突變的有限的范圍。因此，如ODTNE和ZFN的技術(shù)代表了以定向且清晰的方式向植物中引入遺傳變異的有吸引力的解決方案。然而，將動物系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為植物系統(tǒng)代表了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)，尤其是復(fù)制已知用于促進(jìn)靶向基因改變的生理條件。功能MMR系統(tǒng)抵消了 ODTNE并且在使用siRNA敲除MSH2之后已經(jīng)觀察到基因修復(fù)的大量增加。然而，這些方法使用穩(wěn)定整合的siRNA構(gòu)建體，并且因此MSH2從本質(zhì)上被抑制，這是不利的，因為從長遠(yuǎn)來看，所得的突變表型將會導(dǎo)致植物死亡。ODTNE也已被顯示在細(xì)胞周期S時相中的細(xì)胞積累中被促進(jìn)。用于植物原生質(zhì)體中特異性mRNA的瞬間抑制的方法已被描述(An等人2003Biosci. Biotechnol. Biochem. . 67 :2674-2677)并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對于植物中(內(nèi)源性)MMR基因的瞬時抑制而言這可能是有價值的工具。使用化學(xué)品如羥基脲或艾菲地可寧很容易實現(xiàn)S時相中的細(xì)胞積累。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些各種參數(shù)與寡核苷酸遞送的協(xié)調(diào)可能掌控每個單獨參數(shù)的作用。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，本發(fā)明提供了 MMR抑制，而細(xì)胞在細(xì)胞周期的S時相中積累，隨后是寡核苷酸的引入以推動感興趣的基因的改正。
在引入供體構(gòu)建體之前，對于基因靶向采用相同的控制，在細(xì)胞周期的S/G2/M時相中增加的細(xì)胞比例是值得想望的，NHEJ被抑制、ZFN被表達(dá)且DSB被產(chǎn)生。在植物細(xì)胞中，外來分子在細(xì)胞中的引入并不像是在動物細(xì)胞中那么直接，因為存在有一個非常厚的細(xì)胞，為了感興趣的分子到達(dá)原生質(zhì)體需要將其移除。這通過采用纖維素酶和果膠酶的細(xì)胞壁酶消化來完成，但是一旦酶混合物被清洗掉，細(xì)胞將開始再形成細(xì)胞壁。因此，如果想要長時間保留原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)換性，例如至少10、30、60分鐘，或1、2、4、6、8、10、12、16或24小時，或以上；例如從10分鐘到24小時，關(guān)鍵在于避免細(xì)胞壁的再形成。方便地，存在有化學(xué)品，其影響細(xì)胞壁的合成并且能夠用于保持原生質(zhì)體裸露直至采用各種感興趣的分子轉(zhuǎn)染。在本申請中，我們提供的證據(jù)表明，使用這樣的細(xì)胞壁抑制劑允許向植物原生質(zhì)體中相繼引入外來分子，導(dǎo)致寡核苷酸介導(dǎo)的靶向基因改變和使用ZFN的基因靶向的效率改善。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，為了避免細(xì)胞壁的再形成，將非酶組合物加入到原生質(zhì)體培養(yǎng)物中。通過破壞、阻止、降低和/或延遲細(xì)胞壁的再形成直至細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞周期的適當(dāng)階段；更多的外來分子可以被遞送至細(xì)胞中，并且能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)染效率的提高。非 酶組合物的移除，例如通過清洗或采用不含抑制細(xì)胞壁再形成的化合物的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基來允許細(xì)胞壁形成并使細(xì)胞繼續(xù)細(xì)胞周期。取決于所需轉(zhuǎn)染的具體情況，可以向植物細(xì)胞原生質(zhì)體中加入非酶組合物。可以-在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時；-介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間，-在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時，或-在第二轉(zhuǎn)染之后加入組合物。可以-在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時，-介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間，-在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時，或-在第二轉(zhuǎn)染之后并且在允許細(xì)胞壁形成之前移除抑制或避免細(xì)胞壁形成的非酶組合物。以這種方式，考慮到所需的轉(zhuǎn)染，可以抑制細(xì)胞壁的再形成。例如，對于如圖5所示的在番茄ALS基因座的足跡形成而言，在第一轉(zhuǎn)染步驟之前加入組合物。在另一個實施例中(參見圖6和圖7)，(幾乎)與第一轉(zhuǎn)染同時加入組合物。同樣可能的是，允許在短暫的時間段(1-24小時)內(nèi)再形成細(xì)胞壁，然后在第一轉(zhuǎn)染之前停止細(xì)胞壁的進(jìn)一步形成。介于第一轉(zhuǎn)染和第二轉(zhuǎn)染之間的時間段能夠從至少10、30、60分鐘，或1、2、4、6、
8、10、12、16、24小時，至數(shù)天，例如至96小時，或者甚至更多來變化。典型地，時間段是從I小時到72小時，優(yōu)選從2到48小時，更優(yōu)選從4至42小時，甚至更優(yōu)選介于12和36小時之間。通過向原生質(zhì)體培養(yǎng)基中加入一種或多種化學(xué)(即非酶的)化合物來完成干擾細(xì)胞壁的(再)形成(通過抑制、破壞、延遲和/或降低)，例如，化學(xué)化合物抑制纖維素沉積或捕捉新生的纖維素微絲從而阻止其并入到有組織的細(xì)胞壁中(Parekh-Olmedo等人(2003)Ann. NY Acad. Sci. 1002,43-56 ；Anderson 等人(2002) J. Plant Physiol. 159,61-67 ；Meyer和Herth(1978)Chemical inhibition of cell wall formation and cytokinesis,but notof nuclear division,in protoplasts of Nicotiana tabacum L. cultivated in vitro.Plant 142(3),253-262)。在本發(fā)明中使用化學(xué)化合物在本申請中是指“細(xì)胞壁形成抑制劑”。這些化學(xué)化合物能夠阻止、破壞、抑制和/或延遲纖維素細(xì)胞壁的形成，在文中表示“抑制細(xì)胞壁的形成”。只有在不存在細(xì)胞壁形成或者至少存在細(xì)胞壁形成降低的情況下，可以允許原生質(zhì)體培養(yǎng)物經(jīng)歷其正常的發(fā)展周期。由于原生質(zhì)體已經(jīng)經(jīng)歷其發(fā)展周期并且已經(jīng)到達(dá)這樣一種時相，在該時相時期望的是DNA的合成開始，細(xì)胞壁形成抑制劑基本上能夠從原生質(zhì)
體培養(yǎng)物中移除，例如通過清洗或者通過培養(yǎng)基的替換。因此，從抑制劑被加入的時刻開始，采用細(xì)胞壁形成抑制劑處理原生質(zhì)體禁止了細(xì)胞壁的形成，例如，至少12-60小時，或24-48小時。因此，在足夠的時間里抑制細(xì)胞壁的形成允許在細(xì)胞周期的某一時間使用常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)，當(dāng)處于這一時間時細(xì)胞通常是不接受轉(zhuǎn)染的。典型地，抑制劑的使用不會影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。優(yōu)選地，在考慮之中的化學(xué)品應(yīng)該避免細(xì)胞壁的再形成而不顯著地干擾細(xì)胞周期的進(jìn)程或者在所使用的濃度下對原生質(zhì)體有害。在本文中，“不顯著地干擾”意味著化學(xué)品允許以至少50%、至少75%、優(yōu)選85%、更優(yōu)選95%的其正常速度(即在不存在化學(xué)品的情況下)繼續(xù)細(xì)胞周期的進(jìn)程。在本文中，“有害”意味著至少50%、至少75%、優(yōu)選85%、更優(yōu)選95%的原生質(zhì)體沒有受到化學(xué)品以不同于尤其是此處所描述的抑制細(xì)胞壁再形成的任何其它方式產(chǎn)生的影響。各種化學(xué)品干擾細(xì)胞壁的形成。那些化學(xué)品中有許多通常用作除草劑。例如，2,6-二氯苯臆(DCB) (DeBolt 等人(2007)Plant Physiology 145, 334-338 ;Anderson 等人(2002)J.Plant Physiol. 159，61-67)是一種眾所周知的除草劑，其通過抑制纖維素合成酶因此破壞細(xì)胞板的形成(Vaughn等人(1996)Protoplasma 194,117-132)。DCB已被證明抑制纖維素合成酶復(fù)合物的運動性而不影響其遞送到質(zhì)膜(DeBolt等人(2007)Plant Physiology 145,334-338)。此外,優(yōu)選的細(xì)胞壁形成抑制劑不影響細(xì)胞周期的進(jìn)程(Galbraith 和 Shields(1982)The effect ofinhibitors of cell wall synthesison tobacco protoplast development. Physiologia Plantarum 55(I), 25-30 ;Meyer 和Herth(1978)Chemical inhibition of cell wall formation and cytokinesis, but notof nuclear division,in protoplasts of Nicotiana tabacum L. cultivated in vitro.Plant 142 (3)，253-262)，或者僅在有限程度內(nèi)，因為細(xì)胞周期的進(jìn)程對于本技術(shù)而言當(dāng)然是重要的。DCB不限制細(xì)胞周期的進(jìn)程，因此是優(yōu)選的細(xì)胞壁形成抑制劑。其它的化學(xué)品包括除草劑異卩惡草胺(DeBolt等人(2007)Plant Physiology 145,334-338)，其抑制質(zhì)膜中纖維素合成酶復(fù)合物的整合并且破壞現(xiàn)有的那些。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，纖維素合成抑制劑是一種纖維素合成酶抑制劑。在另一個實施方案中，化學(xué)品干擾了負(fù)責(zé)纖維素合成的基因，如CESA基因。卡爾科弗盧爾白(也稱為熒光增白齊Li)與纖維素微絲競爭以阻止其整合到配位網(wǎng)絡(luò)(coordinated network)中(Roncero和Duran (1985) Journal of Bacteriology 163 (3), 1180-1185, Haigler 等人(1980) Science210(4472) ,903-906)。其它的細(xì)胞壁形成抑制劑是例如纖維素生物合成酶抑制劑，如腈、苯甲酰胺和/或三唑羧基酰胺除草劑、微管裝配抑制劑如二硝基苯胺、氨基磷酸鹽/酯、吡啶、苯甲酰胺和/或苯基二甲酸除草劑和/或纖維素沉積抑制劑。在某些實施方案中，纖維素生物合成抑制劑選自二氯苯腈、氯硫酰草胺、氟胺草唑、三唑芬酰胺(triazofenamide)、多沙唑啉A (phtoxazolin A)、多拉霉素(Phtoramycin)、沙司多素A(thaxtominA)、布雷菲德菌素A。在某些實施方案中,微管裝配抑制劑選自柯多素(cobtorin)、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟靈)、丁樂靈、敵樂胺、乙丁烯氟靈、安磺靈、二甲戊樂靈、氟樂靈、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺=拿草特、牧草胺DCPA (氯酞酸二甲酯)。在某些實施方案中，纖維素沉積抑制劑是二氯喹啉酸。在某些實施方案中，細(xì)胞壁形成抑制劑選自莫林(morlin) (7_乙氧基_4_甲
基色滿-2-酮)、異噁草胺(CAS 82558-50-7，N-[3-(I-乙基-I-甲基丙基)-I，
2-噁唑-5-基]-2，6- 二甲氧基苯甲酰胺)、AE F150944 (N2-(l-乙基-3-苯丙
基)-6-(1-氟-I-甲基乙基)-1,3,5, - 二嗪-2,4- 二胺)、二氯苯臆(二氯節(jié)臆)、卡爾科
弗盧爾和/或卡爾科弗盧爾白(4，4'-雙((4-苯胺基-6-雙(2-羥乙基)氨基-S-三
嗪-2-基)氨基)-，2，2'-芪二磺酸及其鹽)、安磺靈(CASRN-19044-88-3，4-( 二丙氨
基)-3，5- 二硝基苯磺酰胺)、5_叔丁基-氨基甲酰氧基-3- (3-三氟甲基)苯基-4-噻唑烷
酮、香豆素、3，4脫氫脯氨酸權(quán)利要求
1.用于向植物細(xì)胞原生質(zhì)體中引入一種或多種感興趣的分子的方法，其包含如下步驟 -通過酶降解和/或從植物細(xì)胞中移除細(xì)胞壁來提供植物細(xì)胞原生質(zhì)體； -進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第一轉(zhuǎn)染，所述轉(zhuǎn)染采用 i.能夠改變選自錯配修復(fù)系統(tǒng)、非同源性末端連接的一種或多種通路的調(diào)節(jié)的第一組合物；和/或 ii能夠誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的第二組合物， -采用一種或多種感興趣的分子進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第二轉(zhuǎn)染； -允許細(xì)胞壁形成； 其中第二轉(zhuǎn)染在第一轉(zhuǎn)染之后進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中能夠誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的第二組合物選自鋅指核酸酶、大范圍核酸酶或TAL效應(yīng)子核酸酶、編碼鋅指核酸酶的DNA構(gòu)建體、編碼大范圍核酸酶的DNA構(gòu)建體、編碼TAL效應(yīng)子核酸酶的DNA構(gòu)建體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中第一組合物和第二組合物基本上同時提供給植物細(xì)胞原生質(zhì)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中第一組合物在第二組合物之前加入。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中第二組合物在第一組合物之前加入。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項所述的方法，其中調(diào)節(jié)的改變是一種或多種通路的下調(diào)，優(yōu)選通路的瞬時下調(diào)。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包含采用抑制或阻止細(xì)胞壁(再)形成的非酶組合物接觸植物細(xì)胞原生質(zhì)體 -在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時；或 -介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間，或 -在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時；或 -在第二轉(zhuǎn)染之后， 并且所述方法進(jìn)一步包含移除抑制或阻止細(xì)胞壁形成的非酶組合物的步驟 -在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時，或 -介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間，或 -在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時，或 -在第二轉(zhuǎn)染之后， 并且在允許細(xì)胞壁形成之前。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項所述的方法，其進(jìn)一步包含同步植物細(xì)胞或植物細(xì)胞原生質(zhì)體的細(xì)胞周期時相的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中同步通過采用同步化劑接觸植物細(xì)胞或植物細(xì)胞原生質(zhì)體來完成，優(yōu)選 -在由植物細(xì)胞形成植物細(xì)胞原生質(zhì)體之前或與其同時；或 -在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時；或 -在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時；或 -介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包含移除同步化劑的步驟-在由植物細(xì)胞形成植物細(xì)胞原生質(zhì)體之前；或 -在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時；或 -在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時；或 -介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間；或 -在第二轉(zhuǎn)染之后或與其同時。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任意項所述的方法，其中同步步驟與采用抑制或阻止細(xì)胞壁(再)形成的非酶組合物接觸植物細(xì)胞原生質(zhì)體的步驟獨立地(如在其之前、在其之后或與其同時)進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中抑制細(xì)胞壁形成的非酶組合物含有一種或多種細(xì)胞壁形成抑制劑，所述細(xì)胞壁形成抑制劑選自 a.纖維素生物合成抑制劑； b.微管裝配抑制劑； c.纖維素沉積抑制劑； d.其它細(xì)胞壁形成抑制劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中纖維素生物合成抑制劑選自二氯苯腈、氯硫酰草胺、氟胺草唑、三唑芬酰胺、多沙唑啉A、多拉霉素、沙司多素A、布雷菲德菌素A。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中微管裝配抑制劑選自柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟靈)、丁樂靈、敵樂胺、乙丁烯氟靈、安磺靈、二甲戊樂靈、氟樂靈、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺=拿草特、牧草胺DCPA (氯酞酸二甲酯)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中纖維素沉積抑制劑是二氯喹啉酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中其它細(xì)胞壁形成抑制劑選自莫林(7-乙氧基-4-甲基色滿-2-酮)、異噁草胺(CAS 82558-50-7, N-[3-(I-乙基-I-甲基丙基)-1，2-噁唑-5-基]-2，6- 二甲氧基苯甲酰胺)、AE F150944(N2-(l-乙基-3-苯丙基)-6-(1-氟-I-甲基乙基)-1，3, 5, - 二嗪-2，4- 二胺)、二氯苯臆(二氯節(jié)臆)、卡爾科弗盧爾和/或卡爾科弗盧爾白(4，4'-雙((4-苯胺基-6-雙(2-羥乙基)氨基-S-三嗪-2-基)氨基)-，2，2'-芪二磺酸及其鹽)、安磺靈(CASRN —19044-88-3，4-( 二丙氨基)-3，5- 二硝基苯磺酰胺)、5_叔丁基-氨基甲酰氧基-3-(3-三氟甲基)苯基-4-噻唑燒酮、香豆素、3，4脫氫脯氨酸、
17.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項所述的方法，其中第一組合物能夠改變MutS、MutL,MutH, MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLHl、MLH2、MLH3、PMSI、DNA-PK 復(fù)合物 Ku70、Ku80、Ku86、MrelI、Rad50、RAD51、XRCC4、Nbsl、PARP-l 中一種或多種的調(diào)節(jié)。
18.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項所述的方法，其中第一組合物包含dsRNA。
19.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項所述的方法，其中第二轉(zhuǎn)染中的一種或多種分子選自化學(xué)品、0嫩、! 嫩、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、1111 ^、^1 ^、1^1 ^、肽、質(zhì)粒、脂質(zhì)體、致突變的寡核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求8-11所述的方法，其中細(xì)胞周期時相的同步在細(xì)胞周期的S時相、M時相、Gl和/或G2時相中同步原生質(zhì)體。
21.根據(jù)權(quán)利要求8-11或20所述的方法，其中細(xì)胞周期時相的同步通過營養(yǎng)剝奪如磷酸鹽饑餓、硝酸鹽饑餓、離子饑餓、血清饑餓、蔗糖饑餓、植物生長素饑餓來完成。
22.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中同步化劑選自艾菲地可寧、羥基脲、胸苷、秋水仙堿、柯多素、二硝基苯胺、氟草胺(乙丁氟靈)、丁樂靈、敵樂胺、乙丁烯氟靈、安磺靈、二甲戊樂靈、氟樂靈、甲基胺草磷、抑草磷氟硫草定、噻草啶炔苯酰草胺=拿草特、牧草胺DCPA (氯酞酸二甲酯)、含羞草堿、茴香霉素、α鵝膏蕈堿、洛伐他汀、茉莉酸、脫落酸、甲萘醌、隱地蛋白、熱、過氧化氫、高錳酸鈉、吲哚美辛、環(huán)氧霉素、乳胞素、icrfl93、奧羅莫星、洛克韋汀、波荷明、星孢菌素、K252a、R田酸、草藻滅、咖啡因、MG132、周期素依賴性激酶和周期素依賴性激酶抑制劑中的一種或多種。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任意項所述的方法，其中介于第一轉(zhuǎn)染和第二轉(zhuǎn)染之間的時間段是至少10、30、60分鐘、1、2、4、6、8、10、12、16或24小時，但優(yōu)選96小時以下，優(yōu)選所述時間段是從I小時至72小時，更優(yōu)選從2至48小時，甚至更優(yōu)選從4至42小時，仍然甚至更優(yōu)選介于12和36小時之間。
24.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意項所述的方法，其中介于第一轉(zhuǎn)染和第二轉(zhuǎn)染之間的時間段是至少10、30、60分鐘、1、2、4、6、8、10、12、16或24小時，但優(yōu)選96小時以下，優(yōu)選所述周期是從I小時至72小時，更優(yōu)選從2至48小時，甚至更優(yōu)選從4至42小時，仍然甚至更優(yōu)選介于12和36小時之間并且其中所述方法進(jìn)一步包含采用抑制或阻止細(xì)胞壁(再)形成的非酶組合物接觸植物細(xì)胞原生質(zhì)體 -在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時；或 -介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間，或 -在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時；或 -在第二轉(zhuǎn)染之后， 并且所述方法進(jìn)一步包含移除抑制或阻止細(xì)胞壁形成的非酶組合物的步驟 -在第一轉(zhuǎn)染之前或與其同時，或 -介于第一和第二轉(zhuǎn)染之間，或 -在第二轉(zhuǎn)染之前或與其同時，或 -在第二轉(zhuǎn)染之后， 并且在允許細(xì)胞壁形成之前。
25.植物細(xì)胞原生質(zhì)體，其采用如權(quán)利要求19所定義的外來分子轉(zhuǎn)染。
26.用于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體的試劑盒，其包含選自第一組合物、第二組合物、抑制或阻止細(xì)胞壁形成的非酶組合物、同步化劑中的兩種或多種以及感興趣的外來分子中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于向植物細(xì)胞原生質(zhì)體中引入一種或多種感興趣的分子的方法，所述方法通過提供植物細(xì)胞原生質(zhì)體，采用能夠改變選自錯配修復(fù)系統(tǒng)和非同源性末端連接的一種或多種通路的調(diào)節(jié)的組合物和/或能夠引入DSBs的組合物進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第一轉(zhuǎn)染，采用一種或多種感興趣的分子如致突變的寡核苷酸進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第二轉(zhuǎn)染和允許細(xì)胞壁形成來實現(xiàn)。
文檔編號C12N15/10GK102791865SQ201080057861
公開日2012年11月21日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者B·G·J·菲倫斯-翁斯滕克, F·呂西耶, P·本多克 申請人:凱津公司