專利名稱：表達熱穩定纖維素酶基因融合體61f-eg1的畢赤酵母工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程，具體地說是從嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascusaurantiacus var.levisporus克隆出61家族糖苷水解酶基因61f和內切葡聚糖酶egl通過融合PCR構建的畢赤酵母工程菌株GS-61egl-134。
背景技術：
嗜熱子囊菌光抱變種Thermoascus aurantiacus var.levisporus 是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50°C條件下可以產生熱穩定的纖維素酶和61家族糖苷水解酶。嗜熱子囊菌光孢變種產生的61家族糖苷水解酶61F具有微弱的纖維素酶活性，通過使用接頭序列將61f和egl融合表達后，其內切纖維素酶活性明顯提高，為EGl活性的
2.7 倍。

發明內容
本發明從嗜熱子囊菌光抱變種Thermoascus aurantiacus var.levisporus獲得的61家族糖苷水解酶基因61f和內切葡聚糖酶基因egl，通過融合PCR得到61f_egl基因，該基因cDNA全長1638bp，編碼545個氨基酸。構建重組表達 質粒載體pPIC9K/61f_egl,利用電轉儀進行電擊轉化Pichiapastoris GSl 15，在MD和麗培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-61EG1-134。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28°C 200rpm/min搖床培養6d，純化后融合蛋白的表達量為4.32mg/ml，分子量為58.8KDa，酶活力為13.6U/ml，重組蛋白61F-EG1在60°C下是穩定的；70°C處理60min后仍保持90.34%的活性；80°C處理60min后保持75.65%的活性；90°C下半衰期為 50mino


:圖1融合蛋白61F-EG1的SDS-PAGE分析泳道1:純化的融合蛋白61F-EG1泳道2:低分子量蛋白標準(自上至下依次為116kDa，66.2kDa, 45KDa, 35kDa)圖2融合蛋白6IF-EGl與61F、EGl單獨表達時的酶活比較圖3融合蛋白61F-EG1最適反應溫度圖4融合蛋白61F-EG1熱穩定性圖5融合蛋白6IF-EGl最適反應PH
具體實施方式
實施方式1:嗜熱子囊菌光抱變種 Thermoascus aurantiacus var.levisporus 的分離鑒定(I)標本采集:從堆肥中采集。(2)分離培養:將采集標本取0.5克放置在PDA平板上50°C培養3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻。(3)鑒定:參考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻。實施方式2:糖苷水解酶基因61f和內切葡聚糖酶egl的基因融合(I)嗜熱子囊菌光抱變種 Thermoascus aurantiacus var.levisporus 總 RNA 的提取:參照Trizol試劑盒說明。(2)cDNA 第一條鏈的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0試劑盒說明書進行:取I g總RNA，加RNase Free ddH20至9.5 y L，將RNA樣品在75°C變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分:10mmol/L dNTP Mixture2 u L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 y L，25mmol/L MgCl24 u L, Oligod(T)-Adaptor PrimerlU L, RNase Inhibiter0.5 U L, AMV Reverse TranscriptaselU L(Final Volume20 u L),將反應液混合后，室溫下放IOmin,然后42°C溫育60min,再煮沸5min以滅活反轉錄酶。加入180 ii L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 y L，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備用。(3) 61f和egl基因的分離:根據已知的61f和egl的序列設計特異引物，在61f上游引物加入SnaB I酶 切位點，egl下游引物加入Not I酶切位點，在61f下游引物和egl上游引物添加linker，引物序列如下；61f-l:CC TACGTA CATGGCTTCGTTCAGAACA6If-2:ACCACCAGAACCACCACCAGAACCACCACCAGTATACAGAGG AGGAegl-1:TCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGCGAAAGTATTCC AATGGTegl-2:TT GCGGCCGC TCAAAGATAC GGAGTCAAA(4)基因克隆:取0.5iil PCR產物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照TAKARA公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5 a菌株，在表面涂有X — gal和IPTG的含氨卞青霉素(100 u g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。(5)質粒DNA的提取:堿法提取質粒DNA。(6)序列測定:在上海博尚生物工程有限公司進行。(7)基因融合:融合PCR體系為 61f PCR產物 I ii L、eglPCR產物 I ii L、10 x Buffer(Mg2+)2.5u LU0mmol/LdNTP2u L,0.5u L(2.5U)Taq DNA聚合酶、61f 上游引物和 egl 下游引物各 I y L、ddH2016ii L。融合PCR反應程序為 95°C4min ；95°C lmin，45°C lmin，72°C 2min,共32個循環；72°C延伸IOmin ;10°C保溫。(8)序列測定:在上海博尚生物工程有限公司進行。融合基因61f-eglcDNA全長1638bp，編碼 545 個氨基酸，包括 linkerGGSGGGSGGGSG。該序列如下:(A) SEQ ID NOl 的信息(a)序列特征:*長度:1638堿基對；*類型:核酸；*鏈型:雙鏈；*拓撲結構:線性
權利要求
1.一種表達嗜熱子囊菌光抱變種 Thermoascus aurantiacus var. levisporus61 家族糖苷水解酶與與內切纖維素酶融合體的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR及融合PCR方法從嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus aurantiacus var.levisporus獲得融合基因，將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，獲得表達重組質粒pPIC9K/61f-egl，轉化畢赤酵母GS115，從中篩出具有高纖維素酶活性的畢赤酵母工程菌株GS-61egl-134，該融合蛋白纖維素酶的活性是原始酶EG的2. 7倍。
全文摘要
本發明是一種融合表達嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus aurantiacus var.levisporus61家族糖苷水解酶61f和內切葡聚糖酶eg1融合基因的畢赤酵母工程菌Pichia pastoris GS-61eg1-134。通過RT-PCR及融合PCR方法從嗜熱子囊菌光孢變種T.aurantiacus var.levisporus獲得糖苷水解酶基因61f和內切葡聚糖酶eg1，將其通過融合PCR得到融合基因61f-eg1，構建酵母表達載體pPIC9K/61f-eg1，導入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一株高效表達融合蛋白的酵母工程菌GS-61eg1-134。該工程菌表達的酶的融合體相對于61f、eg1單獨表達時的酶的活性得到明顯的提高，達到10.89U/mL，比活力較內切纖維素酶EG1提高2.7倍。同時，融合蛋白表達量大，具有良好的熱穩定性，可廣泛用于纖維廢料及其它工業領域，具有重大經濟價值和社會價值。
文檔編號C12N1/19GK103255072SQ201310205200
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月28日 優先權日2013年5月28日
發明者李多川, 李安娜, 寧曉東, 田洪平 申請人:山東農業大學