一種生物膜γ-變形細菌的定量檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物膜γ-變形細菌的定量檢測方法，包括以下步驟：標準品γ-變形細菌的預處理；待測生物膜γ-變形細菌樣品的預處理；對標準品γ-變形細菌進行實時熒光定量PCR檢測，制作標準曲線方程y＝-ax+b，其中，y為循環閾值，x為DNA濃度以10為底的對數；再對待測生物膜γ-變形細菌進行實時熒光定量PCR檢測得到循環閾值，根據循環閾值及標準曲線得到樣品中γ-變形細菌DNA的濃度。與現有技術相比，本發明有效克服了傳統純化培養方法分析速度慢、制約因素多、低估生物多樣性、準確性低、主觀因素強等問題，以更加科學地監測水處理工藝及管網生物膜中致病菌的信息，反映飲用水系統中的潛在危害，為給水管網的水質凈化提供更加科學的依據。
【專利說明】—種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種細菌檢測方法，尤其是涉及一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]在水處理及管道輸送領域，微生物指標是水質監測的重要組成部分。目前的微生物檢測主要集中在水中的懸浮細菌，但實際上，在水處理各工藝及管網中都有生物膜的形成，成為水質穩定的隱患。給水系統中生物膜的形成，主要經由以下5個過程:(1)殘留細菌附著；⑵形成微生物群落，產生胞外聚合物；⑶群落自由擴展，形成穩定結構；⑷生物膜成熟，新菌種進入生物膜生長，有機和無機物質被結合，形成溶液梯度，導致生物膜空間的異相結構；(5)成熟的生物膜脫落。以上循環交替重復進行。
[0003]變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多病原菌，如大腸埃希氏菌、沙門氏菌、孤菌、螺桿菌等，變形細菌均為革蘭氏陰性菌。根據rRNA的不同，變形菌通常分為5類用希臘字母α、β、Υ、δ和ε命名。在給水系統中，變形細菌占有主導性。無論作為共生體還是病原體，變形細菌均與真核生物有著密切的交互作用。Y -變形菌包括一些醫學上和科學研究中很重要的類群，如腸桿菌科(Enterobatteraceae)、假單細胞菌科(Pseudomonadaceae)。很多重要的病原菌屬于這個綱，如沙門氏菌屬(Salmonella)、弧菌屬(Vibrio)、銅綠假單細胞菌(Pseudomonas aeruginosa),重要的指示微生物大腸桿菌也屬于此綱。
[0004]目前，國內對水處理工藝及管網生物膜生長和結構的研究較少，并且方法大多停留在細菌學指標階段，較多采用傳統純培養技術來檢測分析微生物，對于大多數微生物的樣本，微生物形態學僅能提供極少的線索。再者，基于培養的微生物檢測技術由于存在高度的選擇性和費時、費力等缺點，不能滿足分析微生物群落的結構與功能關系的需要。除此之外，許多有機體是不可培養的，生態系統中微生物多樣性難以被確定；傳統的分離計數技術也難以滿足對微生物群落結構變化進行動態監測的要求。對于微生物的深入研究，迫切需要更為準確、全面、靈敏的分析技術。

【發明內容】

[0005]本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種準備、靈敏的生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法。
[0006]本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:
[0007]—種生物膜Y -變形細菌的定量檢測方法，該方法包括以下步驟:
[0008]第一步、標準品Y -變形細菌的預處理:
[0009](I)將冷凍的Y -變形細菌標樣放入LB液體培養基中，37°C恒溫培養，得到復蘇的Y-變形細菌標樣；
[0010](2)大腸埃希氏菌感受態細胞的制備；
[0011](3)將復蘇的Y-變形細菌標樣轉化入大腸埃希氏菌感受態細胞中，并加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫培養；
[0012](4)通過質粒抽提試劑盒對步驟(3)所得物進行質粒提取，得到Y-變形細菌質粒原液；
[0013](5)利用超微量核酸蛋白測定儀測定步驟(4)所得的Y-變形細菌質粒原液的DNA含量；
[0014]第二步、待測生物膜Y-變形細菌樣品的預處理:
[0015](I)將從水處理工藝或管道內壁采集的生物膜樣品加入滅菌生理鹽水中，經超聲預處理，利用提取DNA試劑盒進行DNA的提??；
[0016](2)提取完畢后，直接采用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳或通過PCR擴增再電泳鑒定提取的DNA ；
[0017]第三步、實時熒光定量PCR檢測:
[0018](I)標準品Y -變形細菌的實時熒光定量PCR檢測:
[0019]根據Υ -變形細菌質粒原液的DNA含量，將Y -變形細菌質粒原液分別稀釋成DNA含量為109、IO8、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、104、IO3Copy/ μ I的Y -變形細菌質粒稀釋液，根據PCR反應體系測定對應的Y-變形細菌質粒稀釋液的循環閾值；
[0020]根據檢測結果得到Y -變形細菌的循環閾值與DNA含量的對應關系，制作標準曲線方程I = -ax+b，其中，y為循環閾值，X為DNA濃度以10為底的對數；
[0021](2)待測生物膜Y -變形細菌的實時熒光定量PCR檢測:
[0022]根據PCR反應體系測定預處理過的待測生物膜Y -變形細菌樣品的循環閾值，根據標準曲線得到樣品中Y-變形細菌DNA的濃度。
[0023]第一步中步驟(1)所述的Y-變形細菌標樣的復蘇方法如下:
[0024]將_80°C低溫保存的Y-變形細菌標樣取出，待Y-變形細菌標樣達到室溫后，加入LB液體培養基中，37°C恒溫培養24h后，得到復蘇的Y-變形細菌標樣。
[0025]第一步中步驟(2)所述的大腸埃希氏菌感受態細胞的制備方法如下:
[0026](a)從固體LB培養基上挑取大腸埃希氏菌的單菌落置于滅菌LB液體培養基中，37°C恒溫培養后，獲得新鮮大腸埃希氏菌菌液；
[0027](b)將新鮮大腸埃希氏菌菌液在低溫下高速離心，去除上清液，然后加入0°C的滅菌的氯化鈣溶液，充分混勻，并于散冰中靜置30min ;于4°C下高速離心5min，去除上清液；在離心管中繼續加入滅菌的氯化鈣溶液，散冰上輕柔地搖勻，得到大腸埃希氏菌感受態細胞菌液。
[0028]第一步中步驟(3)所述的將復蘇的Y-變形細菌標樣轉化入大腸埃希氏菌感受態細胞中，并加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫培養的具體方法如下:
[0029](a)大腸埃希氏菌感受態細胞菌液中加入復蘇的Y-變形細菌標樣，冰水浴30min后，40~45°C水浴熱激80~90s，再冰水浴2min后加入到LB液體培養基中，混勻后37°C恒溫復蘇lh，得到復蘇渾濁液；
[0030](b)將復蘇渾濁液離心，去除上清液，然后涂布到含氨芐青霉素的LB固體培養基上，37°C倒置LB固體培養基培養12~16h，得到Y -變形細菌轉化入大腸埃希氏菌后的新鮮Y-變形細菌菌落產物；
[0031](C)挑選新鮮Y-變形細菌菌落產物中的單個菌落加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫培養14~16h。
[0032]第三步中步驟(1)所述的PCR反應體系共25μ 1，包括12.5μ I市售的SYBR GreenRealtime PCR Master Mix、0.5 μ I正向引物、0.5 μ I反向引物、10 μ I滅菌去離子水及
1.5 μ I模板DNA，所述的模板DNA為變形細菌質粒稀釋液或預處理過的待測生物膜Y-變形細菌樣品。
[0033]所述的正向引物序列為5 ' -CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ’；所述的反向引物序列為5’ -TCTACGCATTTCACC/TGCTAC-3’。
[0034]第三步中步驟⑴所述的PCR反應的條件為:預變性條件為95°C保持3min ;變性擴增條件為95°C保持15s，延伸條件為60°C保持60s，該過程共循環40次；最后在72~99°C解離。
[0035]所述的含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，每100ml LB液體培養基含有200~250 μ I的氨芐青霉素，含氨芐青霉素的LB固體培養基中，每100ml LB固體培養基含有200~250 μ I的氨節青霉素。
[0036]在進行PCR檢測時，對結果進行擴增曲線、熔解曲線和標準曲線的分析，當R2 >0.99且擴增效率在0.9-1.1之間時，認為擴增有效且結果可信。
[0037]每次PCR試驗均需進行標準曲線的同步測定，每個樣品選取2個平行樣，每次試驗需采用I組空白對照考察反應體系是否被污染。
[0038]所有試驗材料均需高溫滅菌處理后密封烘干使用；配置體系時需在無菌超凈臺中進行操作，由于SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑的熱感性，所有操作均需在冰上進行。
[0039]與現有技術相比，本發明選擇Y -變形細菌為研究對象進行定量分析研究，建立了基于SYBR Green I的實時熒光定量PCR技術檢測管網管壁生物膜微生物結構組成的方法，可準確檢測出Y-變形細菌的數量，從微觀角度定量了解生物膜的組成與結構。有效克服了傳統純化培養方法分析速度慢、制約因素多、低估生物多樣性、準確性低、主觀因素強等問題，以更加科學地監測水處理工藝及管網生物膜中致病菌的信息，反映飲用水系統中的潛在危害，從而為研究飲用水系統的微生物穩定性提供支撐，為給水管網的水質凈化提供更加科學的依據。
【具體實施方式】
[0040]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0041]實施例1
[0042](I) Y -變形細菌標樣的復蘇
[0043]將_80°C低溫保存的Y -變形細菌標樣取出，溶解至室溫，充分混合；取20 μ I液態Y-變形細菌標樣入2ml的LB液體培養基(培養基用前121°C高溫滅菌25min)，置于37°C恒溫搖床培養24h，轉速控制在160rpm。24h后得到新鮮活化的各個標樣菌液。
[0044](2)大腸埃希氏菌感受態細胞的制備
[0045]A、選用大腸埃希氏菌菌株，從LB平板上挑取單菌落置于Iml的滅菌LB液體培養基，于37°C恒溫搖床培養，轉速 控制在160rpm，24h后獲得新鮮大腸埃希氏菌菌液。
[0046]B、將新鮮培養的大腸埃希氏菌菌液充分混勻，取400 μ I菌液放入40ml液體LB培養基，37°C培養IOOmin ；
[0047]C、取50ml菌液,預冷低溫高速離心機至4°C,4°C下6000rpm高速離心5min,緩慢
去除上清液；
[0048]D、加Iml預冷的滅菌CaCl2溶液(冰水混合物中預冷至O度)，充分混勻；在混合液體中，繼續加入20ml左右CaCl2溶液；
[0049]E、將離心管于散冰中靜置30min ;于4°C下6000rpm高速離心5min，去除上清液；在離心管中繼續加入800 μ ICaCl2溶液，散冰上輕柔地搖勻。
[0050]由于感受態受溫度影響較大，故成功制備的感受態需完全置于散冰中低溫保存，并于制備之日起5日內盡快使用。
[0051](3)變形細菌標樣轉化入感受態細菌
[0052]為考察感受態效果，選用陽性質粒進行轉化試驗，具體操作如下:
[0053]Α、分別從以上800 μ I菌液中取80 μ I入2個1.5ml離心管，其中一個為陰性對照，不加入任何其他試劑；另一個加入I μ I拷貝數為10_9的陽性質粒，作為陽性對照。將離心管置于冰水混合物，冰水浴30min ；
[0054]B、將離心管水浴42°C熱激80~90s后，迅速置于冰水浴冷卻2min ；
[0055]C、加500 μ I的LB液體培養基，混勻后37°C恒溫160rpm復蘇Ih復蘇渾濁液室溫下13000rpm離心I min,去除500 μ I上清液,充分混勻后涂布到含氨節青霉素(100ml固體培養基加入200-250 μ I氨芐ΑΡ50)的LB固體平板，37°C倒置平板培養12~16h ；
[0056]D、培養后，觀察兩塊平板，若陰性平板無菌落，陽性板菌落較多則證明感受態制作效果良好。則將Y-變形細菌標樣與其連接:從感受態菌液中取80 μ I入多個1.5ml離心管，其中一個為陰性對照，不加入任何其他試劑，標記為空白樣；其它離心管中分別加入ΙμL的Y-變形細菌復蘇活化后的新鮮菌液，對應標記為Y-變形細菌。將以上離心管置于冰水混合物，冰水浴30min ;重復本節中的步驟B-C ；
[0057]培養后的平板為Y-變形細菌轉化入大腸埃希氏菌后的新鮮變形細菌菌落產物。
[0058](4)變形細菌標樣的挑菌培養
[0059]在滅菌的液體LB培養基中加入氨芐(40ml液體LB培養基+80 μ I氨芐ΑΡ50)，在上述Y-變形細菌平板中分別挑單個菌加入1ml液體LB培養基，置于1.5ml滅菌離心管中。將上述離心管置于37°C恒溫搖床培養14~16h,轉速控制在160rpm。
[0060](5)變形細菌標樣質粒的提取
[0061]采用質粒抽提試劑盒進行質粒提取。提取方法按試劑盒說明所述進行。
[0062](6) Y -變形細菌定量雙鏈DNA含量的測定
[0063]利用超微量核酸蛋白測定儀測定Y-變形細菌DNA含量。
[0064](7)實時熒光定量PCR (RTFQ-PCR)檢測
[0065]根據β -變形細菌的DNA含量測定結果，將變形細菌質粒原液分別稀釋至109、108、IO7, IO6, ΙΟ5、104、IO3Copy/ μ I。根據本發明所述RTFQ-PCR反應體系、條件測定對應的β -變形細菌標準曲線，取IO3COpy/μ I~IO7COpy/μ I的稀釋濃度為已知濃度。
[0066](8)根據檢測結果得到標準曲線方程y = -ax+b。其中，y為循環閾值(Ct值)，x為DNA濃度以10為底的對數。以a接近于3.33且b在38-40之間為最佳。
[0067](9)樣品預處理[0068]向從水處理工藝或管道內壁采集的生物膜樣品中加入40ml滅菌生理鹽水，置于超聲振蕩儀處理，超聲功率23w，超聲時間2min。
[0069](10) DNA 提取
[0070]利用提取DNA試劑盒進行DNA的提取。操作方法按試劑盒說明所述進行。提取完畢后，直接采用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳或通過PCR擴增再電泳鑒定提取的DNA，在相應位置條帶明亮且無雜帶則可進行下一步操作。
[0071](11)實時熒光定量PCR (RTFQ-PCR)檢測
[0072]按照本發明所述RTFQ-PCR反應體系、條件測定DNA樣品，根據標準曲線得到樣品中Y-變形細菌DNA的濃度。
[0073]實施例2
[0074]一種生物膜Y -變形細菌的定量檢測方法，該方法包括以下步驟:
[0075]第一步、標準品Y -變形細菌的預處理:
[0076](I)將-80°C低溫保存的Y -變形細菌標樣取出，待Y -變形細菌標樣達到室溫后，加入LB液體培養基中，37°C恒溫培養24h后，得到復蘇的Y-變形細菌標樣；
[0077](2)大腸埃希氏菌感受態細胞的制備:
[0078](a)從固體LB培養基上挑取大腸埃希氏菌的單菌落置于滅菌LB液體培養基中，37°C恒溫培養后，獲得新鮮·大腸埃希氏菌菌液；
[0079](b)將新鮮大腸埃希氏菌菌液在低溫下高速離心，去除上清液，然后加入0°C的滅菌的氯化鈣，充分混勻，并于散冰中靜置30min ;于4°C下高速離心5min，去除上清液；在離心管中繼續加入滅菌的氯化鈣，散冰上輕柔地搖勻，得到大腸埃希氏菌感受態細胞菌液；
[0080](3)將復蘇的Y-變形細菌標樣轉化入大腸埃希氏菌感受態細胞中，并加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫培養:
[0081](a)大腸埃希氏菌感受態細胞菌液中加入復蘇的Y-變形細菌標樣，冰水浴30min后，40~45°C水浴熱激80~90s，再冰水浴2min后加入到LB液體培養基中，混勻后37°C恒溫復蘇lh，得到復蘇渾濁液；
[0082](b)將復蘇渾濁液離心，去除上清液，然后涂布到含氨芐青霉素的LB固體培養基上，37°C倒置LB固體培養基培養12~16h，得到Y -變形細菌轉化入大腸埃希氏菌后的新鮮Y-變形細菌菌落產物；
[0083](C)挑選新鮮Y-變形細菌菌落產物中的單個菌落加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫培養14~16h ；
[0084]其中，含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，每100ml LB液體培養基含有200~250 μ I的氨芐青霉素，含氨芐青霉素的LB固體培養基中，每100ml LB固體培養基含有200~250 μ I的氨節青霉素。
[0085](4)通過質粒抽提試劑盒對步驟(3)所得物進行質粒提取，得到Y -變形細菌質粒原液；
[0086](5)利用超微量核酸蛋白測定儀測定步驟(4)所得的Y-變形細菌質粒原液的DNA含量；
[0087]第二步、待測生物膜Y -變形細菌樣品的預處理:
[0088](I)將從水處理工藝或管道內壁采集的生物膜樣品加入滅菌生理鹽水中，經超聲預處理，利用提取DNA試劑盒進行DNA的提??；
[0089](2)提取完畢后，直接采用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳或通過PCR擴增再電泳鑒定提取的DNA ；
[0090]第三步、實時熒光定量PCR檢測:
[0091](I)標準品Y -變形細菌的實時熒光定量PCR檢測:
[0092]根據Υ -變形細菌質粒原液的DNA含量，將Y -變形細菌質粒原液分別稀釋成DNA含量為109、IO8、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、104、IO3Copy/ μ I的Y -變形細菌質粒稀釋液，根據PCR反應體系測定對應的Y-變形細菌質粒稀釋液的循環閾值；
[0093]PCR 反應體系共 25 μ 1，包括 12.5 μ I 市售的 SYBR Green Realtime PCR MasterMix、0.5 μ I正向引物、0.5 μ I反向引物、10 μ I滅菌去離子水及1.5 μ I模板DNA,模板DNA為Y-變形細菌質粒原液或預處理過的待測生物膜Y-變形細菌樣品；正向引物序列為5' -CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ’ ；反向引物序列為 5 ’ -TCTACGCATTTCACC/TGCTAC-3 ’。PCR 反應的條件為:預變性條件為95°C保持3min ;變性擴增條件為95°C保持15s，延伸條件為60°C保持60s，該過程共循環40次；最后在72~99°C解離。
[0094]根據檢測結果得到Y -變形細菌的循環閾值與DNA含量的對應關系，制作標準曲線方程I = -ax+b，其中，y為循環閾值，X為DNA濃度以10為底的對數；
[0095](2)待測生物膜Y -變形細菌的實時熒光定量PCR檢測:
[0096]根據PCR反應體系測定預處理過的待測生物膜Y -變形細菌樣品的循環閾值，根據標準曲線得到樣品 中 Y-變形細菌DNA的濃度。
[0097]在進行PCR檢測時，對結果進行擴增曲線、熔解曲線和標準曲線的分析，當R2 >
0.99且擴增效率在0.9-1.1之間時，認為擴增有效且結果可信。
[0098]每次PCR試驗均需進行標準曲線的同步測定，每個樣品選取2個平行樣，每次試驗需采用I組空白對照考察反應體系是否被污染。
[0099]所有試驗材料均需高溫滅菌處理后密封烘干使用；配置體系時需在無菌超凈臺中進行操作，由于SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑的熱感性，所有操作均需在冰上進行。
【權利要求】
1.一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 第一步、標準品Y-變形細菌的預處理: (1)將冷凍的Y-變形細菌標樣放入LB液體培養基中，37°C恒溫培養，得到復蘇的Y-變形細菌標樣； (2)大腸埃希氏菌感受態細胞的制備； (3)將復蘇的Y-變形細菌標樣轉化入大腸埃希氏菌感受態細胞中，并加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫培養； (4)通過質粒抽提試劑盒對步驟(3)所得物進行質粒提取，得到Y-變形細菌質粒原液； (5)利用超微量核酸蛋白測定儀測定步驟⑷所得的Y-變形細菌質粒原液的DNA含量; 第二步、待測生物膜Y-變形細菌樣品的預處理: (1)將從水處理工藝或管道內壁采集的生物膜樣品加入滅菌生理鹽水中，經超聲預處理，利用提取DNA試劑盒進行DNA的提??； (2)提取完畢后，直接采用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳或通過PCR擴增再電泳鑒定提取的DNA ； 第三步、實時熒光定量PCR`檢測: (1)標準品Y-變形細菌的實時熒光定量PCR檢測: 根據Y-變形細菌質粒原液的DNA含量，將Y-變形細菌質粒原液分別稀釋成DNA含量為109、IO8、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、104、IO3Copy/ μ I的Y -變形細菌質粒稀釋液，根據PCR反應體系測定對應的Y-變形細菌質粒稀釋液的循環閾值； 根據檢測結果得到Y -變形細菌的循環閾值與DNA含量的對應關系，制作標準曲線方程y = -ax+b，其中，y為循環閾值，X為DNA濃度以10為底的對數； (2)待測生物膜Y-變形細菌的實時熒光定量PCR檢測: 根據PCR反應體系測定預處理過的待測生物膜Y -變形細菌樣品的循環閾值，根據標準曲線得到樣品中Y -變形細菌DNA的濃度。
2.根據權利要求1所述的一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，第一步中步驟(1)所述的Y-變形細菌標樣的復蘇方法如下: 將-80°C低溫保存的Y-變形細菌標樣取出，待Y-變形細菌標樣達到室溫后，加入LB液體培養基中，37°C恒溫培養24h后，得到復蘇的Y -變形細菌標樣。
3.根據權利要求1所述的一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，第一步中步驟(2)所述的大腸埃希氏菌感受態細胞的制備方法如下: (a)從固體LB培養基上挑取大腸埃希氏菌的單菌落置于滅菌LB液體培養基中，37°C恒溫培養后，獲得新鮮大腸埃希氏菌菌液； (b)將新鮮大腸埃希氏菌菌液在低溫下高速離心，去除上清液，然后加入0°C的滅菌的氯化鈣溶液，充分混勻，并于散冰中靜置30min ;于41:下高速離心5min，去除上清液；在離心管中繼續加入滅菌的氯化鈣溶液，散冰上輕柔地搖勻，得到大腸埃希氏菌感受態細胞菌液。
4.根據權利要求1所述的一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，第一步中步驟(3)所述的將復蘇的Y-變形細菌標樣轉化入大腸埃希氏菌感受態細胞中，并加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫培養的具體方法如下: (a)大腸埃希氏菌感受態細胞菌液中加入復蘇的Y-變形細菌標樣，冰水浴30min后，`40~45°C水浴熱激80~90s，再冰水浴2min后加入到LB液體培養基中，混勻后37°C恒溫復蘇lh，得到復蘇渾濁液； (b)將復蘇渾濁液離心，去除上清液，然后涂布到含氨芐青霉素的LB固體培養基上，`37°C倒置LB固體培養基培養12~16h，得到Y -變形細菌轉化入大腸埃希氏菌后的新鮮Y-變形細菌菌落產物； (c)挑選新鮮Y-變形細菌菌落產物中的單個菌落加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫培養14~16h。
5.根據權利要求1所述的一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，第三步中步驟(1)所述的PCR反應體系共25μ 1，包括12.5μ I市售的SYBR Green RealtimePCR Master Mix、0.5 μ I正向引物、0.5 μ I反向引物、10 μ I滅菌去離子水及1.5 μ I模板DNA,所述的模板DNA為Y -變形細菌質粒稀釋液或預處理過的待測生物膜Y -變形細菌樣品O
6.根據權利要求5所述的一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，所述的正向引物序列為5 ' -CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ’；所述的反向引物序列為5’ -TCTACGCATTTCACC/TGCTAC-3’。
7.根據權利要求1所述的一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，第三步中步驟⑴所述的PCR反應的條件為:預變性條件為95°C保持3min ;變性擴增條件為95°C保持15s，延伸條件為60°C保持60s，該過程共循環40次；最后在72~99°C解離。
8.根據權利要求4所述的一種生物膜Y-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，所述的含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，每100ml LB液體培養基含有200~250 μ I的氨芐青霉素；所述的含氨芐青霉素的LB固體培養基中，每100ml LB固體培養基含有200~`250 μ I的氨芐青霉素。
【文檔編號】C12Q1/06GK103865995SQ201310207695
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年5月29日 優先權日:2013年5月29日
【發明者】李偉英, 白濤, 沈程程, 李文明, 喬羽 申請人:同濟大學