專利名稱：一種生產法尼烯的菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于合成生物學領域，涉及一種生產法尼烯的菌株及其應用。
背景技術：
法尼烯最早從蘋果樹中分離得到，在植物防御方面起到重要作用。由于其是一種重要的化工原料，例如可用于人工合成橡膠，更重要的是法尼烯是一種優良生物能源法尼烷的前體，具有廣闊的市場價值，近年來受到了人們的廣泛關注。法尼烯在植物中的含量非常低，無法以提取天然產物的方式來用于化工市場，因而利用微生物生產法尼烯似乎成為人們利用這一化合物的最佳方式。微生物發酵最大的瓶頸在于如何實現工業化，而工業化的必要條件是其產量需要滿足可以工業化的水平。但是現在僅克隆到了少數幾種法尼烯合酶，而且其在微生物中的蛋白表達情況都不理想，利用微生物生產法尼烯一直緩慢前行，未能實行工業化生產。現有報道(Wang，C.，et al.，2011.Metabolic engineering of Escherichia coli for a -farnesene production.MetabolicEngineering.13，648-655)法尼烯的最高產量僅為 0.38g/L。

發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種生產法尼烯的菌株。本發明的另一目的在于提供上述生產法尼烯的菌株的應用。本發明的再一 目的在于提供一種利用上述菌株生產法尼烯的方法。本發明的目的還在于提供一種提高原核生物生產法尼烯能力的方法。一種生產法尼烯的菌株，含有甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和部分或全部經過密碼子優化的法尼烯合成的相關基因；所述的甲羥戊酸途徑的相關基因包括(I)將乙酰輔酶A縮合為乙酰乙酰輔酶A的基因atoB、(2)將乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合為HMG-CoA的基因ergl3、(3)將HMG-CoA還原為甲羥戊酸的基因thmgl、(4)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的基因ergl2、(5)將甲羥戊酸-5-磷酸磷酸化為甲羥戊酸_5_焦磷酸的基因erg8、(6)將甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧生成異戊烯焦磷酸的基因mvdl和(7)將異戊烯焦磷酸異構為二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi ;所述的法尼烯合成的相關基因包括(I)將異戊烯焦磷酸分子和二甲基烯丙基焦磷酸分子組合以形成法尼基焦磷酸的基因ispA和(2)將法尼基焦磷酸轉化為法尼烯的基因afs。所述的甲羥戊酸途徑的相關基因優選為來源于大腸桿菌BL21 (DE3)的atoB(CP001509.3:2216470-2217654)、idi (CP001509.3:2863926-2864474)和來源于釀酒酵母 INVSCl 的 ergl3 (329138949:19060-20535)、 tHMGl (329138949:115734-117239)、ergl2 (329138949:684467-685798)、erg8 (329138949:712316-713671)、mvdl(329138953:701895-703085)。所述的ispA基因優選為來源于大腸桿菌BL21(DE3)的ispA(CP001509.3:405603-406502)所述的afs基因優選為以來源于蘋果屬的Malus x domestica(apple)的afs基因(Q84LB2)為基礎進行密碼子優化得到，其序列如SEQ ID N0.1所示。優選的，所述的生產法尼烯的菌株為含有質粒pMHl、質粒pFZ81和質粒pFZ38的大腸桿菌；所述的質粒PMHl以pBBRlMCS為骨架載體、啟動子為Iac啟動子、復制子替換為pl5A復制子,包含atoB、ergl3和thmgl基因，pMHl的序列(不含骨架載體序列)如SEQ IDN0.2所示；所述的質粒pFZ81以pBBRlMCS-2為骨架載體、啟動子為Iac啟動子、復制子為質粒自帶的pBBRlMCS復制子,包含ergl2、erg8、mvdl和idi基因，pFZ81的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0.3所示；所述的質粒pFZ38以pET21a(+)為骨架載體、啟動子為T7啟動子、復制子PBBR322高拷貝復制子，包含afs和ispA基因，pFZ38的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0.4所示。更優選的，所述的生產法尼烯的菌株為含有質粒pMHl、質粒pFZ81和質粒pFZ71的大腸桿菌；所述的質粒PFZ71以pET21a(+)為骨架載體、啟動子為T7啟動子、復制子PBBR322高拷貝復制子，包含afs、ispA和idi基因，pFZ71的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0.5 所示。上述生產法尼烯的菌株在生產法尼烯中的應用。利用上述生產法尼烯的菌株生產法尼烯的方法，包含如下步驟:將上述生產法尼烯的菌株種子液接入含碳源的的培養基中進行原核表達得到法尼烯。原核表達時，加入誘導劑IPTG2-4小時后再加入正癸烷進行雙相發酵。原核表達時MVA途徑合成法尼烯各蛋白的比例優選為AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ER38: MVDl: Idi: IspA:臉H: 2-16: 2-30:: 2-20: 4-600: 20-40: 2-11 ；更優選的，AtoB: ERGI3: tHMGl: ERGI2: ERG8: MVDl: Idi: IspA: AFS=1: 10: 2: 5: 5: 2: 5: 2: 2。一種提高原核生物生產法尼烯能力的方法，通過對法尼烯合成的相關基因進行密碼子優化，包括afs, erg8, ergl2和ergl3等基因；或使通過MVA途徑合成法尼烯各蛋白的比例更加接近優化比例AtoB: ERGl3: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi: IspA: AFS=1: 10: 2: 5: 5: 2: 5: 2: 2 的進一步改造；或過表達 id1、erg8、mvdl、ergl3、ergl2 和thmgl中的任一或多個基因可以實現。本發明相對于現有技術具有如下優點和效果:代謝通路中各個蛋白并不是按照等摩爾情況才是最高效的，而是應該按照一定比例來最大化反應速率，本發明利用體外重建體系研究確定了 MVA途徑合成法尼烯各蛋白的最佳比例為 AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi: IspA: AFS=I: 10: 2: 5: 5: 2: 5: 2: 2，然后通過更加理性的合成生物學手段改造通過MVA途徑生產法尼烯的各蛋白的比例，通過控制這些蛋白的比例，在最短時間內能快速的提高法尼烯的產量，該方法比傳統基因工程利用隨機改變代謝通路上的蛋白表達量更具有目標性，因而實驗更加理性、快速、有效。同時本發明通過密碼子優化合成法尼烯合成相關基因afs，使得這些基因能夠更容易在異源宿主內進行表達。通過這些技術使法尼烯搖瓶產量達到Ig/L以上，具有很好的工業運用前景。


圖1是甲羥戊酸途徑示意圖。圖2是法尼烯合成途徑示意圖。圖3是Idi利于萜類化合物生產示意圖。圖4是MVA途徑合成法尼烯各蛋白優化比例對反應速率的影響圖。圖5是質粒pMHl示意圖。圖6是質粒pFZ81示意圖。圖1是質粒pFZ35示意圖。圖8是質粒pFZ38示意圖。圖9是質粒pFZ71示意圖。圖10是本發明法尼烯產生菌株(F0、F1和F5)示意圖，H)通過MEP途徑生產法尼烯，Fl和F5通過MEP和MVA途徑生產法尼烯。圖11是本發明法尼烯產生菌株(F0、F1和F5)搖瓶發酵生產法尼烯結果圖。
具體實施例方式以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。通過從大腸桿菌和釀酒酵母基因組DNA中擴增相應基因構建了用于大腸桿菌表達的甲羥戊酸途徑。隨后經密碼子優化和基因合成構建了從異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)生產法尼烯的通路，并實現了重組大腸桿菌高效生產法尼烯。相關反應途徑見圖1和圖2。實施例中所用到的引物如表I所示:表I引物列表
權利要求
1.一種生產法尼烯的菌株，其特征在于含有甲羥戊酸途徑和部分或全部經過密碼子優化的法尼烯合成的相關基因；所述的甲羥戊酸途徑的相關基因包括thmgl、ergl2、erg8、mvdl和idi基因；所述的法尼烯合成的相關基因包括和a/s基因。
2.根據權利要求1所述的生產法尼烯的菌株，其特征在于:所述的ah基因經過密碼子優化，其序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求1所述的生產法尼烯的菌株，其特征在于:生產法尼烯的菌株為含有質粒pMHl、質粒pFZ81和質粒pFZ38的大腸桿菌或含有質粒pMHl、質粒pFZ81和質粒pFZ71的大腸桿菌； 所述的質粒PMHl以pBBRlMCS為骨架載體、復制子為pl5A、啟動子為Iac啟動子、包含atoB、ergl3 和 thmgl 基因； 所述的質粒PFZ81以pBBRlMCS-2為骨架載體、復制子為pBBRlMCS復制子、啟動子為Iac啟動子、包含ergl2、erg8、mvdl和idi基因； 所述的質粒PFZ38以pET21a(+)為骨架載體、復制子為pBBR322高拷貝復制子、啟動子為T7強啟動子、包含a/s和ispA基因； 所述的質粒PFZ71以pET21a(+)為骨架載體、復制子為pBBR322高拷貝復制子、啟動子為T7強啟動子、包含和idi基因。
4.根據權利要求3所述的生產法尼烯的菌株，其特征在于:所述的質粒pMHl的序列如SEQ ID N0.2 所示；所述的質粒pFZ81的序列如SEQ ID N0.3所示；所述的質粒pFZ38的序列如SEQ ID N0.4所示；所述的質粒pFZ71的序列如SEQ ID N0.5所示。
5.權利要求1-4任一項所述的菌株在生產法尼烯中的應用。
6.利用權利要求1-4任一項所述的生產法尼烯的方法，其特征在于包含如下步驟:將權利要求1-3任一項所述的菌株種子液接入含碳源的培養基中進行原核表達得到法尼烯。
7.根據權利要求6所述的生產法尼烯的方法，其特征在于:原核表達時，加入誘導劑IPTG 2-4小時后再加入正癸烷進行雙相發酵。
8.根據權利要求6所述的生產法尼烯的方法，其特征在于:原核表達時MVA途徑各蛋白比例為 AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi: IspA: AFS=l-56: 2-16: 2-30: 1-5: 1-5: 2-20: 4-600: 20-40: 2-11。
9.根據權利要求6所述的生產法尼烯的方法，其特征在于:原核表達時MVA途徑各蛋白比例為 AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi: IspA: AFS=1: 10: 2: 5: 5: 2: 5: 2: 2。
10.一種提高原核生物生產番茄法尼烯的方法，其特征在于包含如下方法:對法尼烯合成的相關基因進行密碼子優化；或使MVA途徑各蛋白更加接近AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi: IspA: AFS =1: 10: 2: 5: 5: 2: 5: 2: 2 的進一步改造；或過表達Id1、ERG8、MVDl、ERG13、ERG12和tHMGl中的任一或多個基因。
全文摘要
本發明公開了一種生產法尼烯的菌株及其應用，屬于合成生物學領域。生產法尼烯的菌株含有甲羥戊酸途徑和經過密碼子優化的法尼烯合成的相關基因；經密碼子優化的法尼烯合成基因afs序列如SEQIDNO.1所示。該菌株可用于生產法尼烯，將其種子液接入含碳源的培養基中進行原核表達得到法尼烯。對法尼烯合成的基因進行密碼子優化或使甲羥戊酸途徑合成法尼烯各蛋白更加接近AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2可以進一步促進生產法尼烯。本發明使法尼烯產量大幅提高達到1g/L以上。
文檔編號C12N1/21GK103243065SQ20131020942
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月30日 優先權日2013年5月30日
發明者劉天罡, 朱發銀, 鄧子新 申請人:武漢大學