專利名稱：花生GA20-氧化酶蛋白及其編碼基因AhGA20ox1與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及花生GA20-氧化酶蛋白及其編碼基因AhGA20oxl與應用，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
赤霉素(gibberellins,簡稱GAs)屬于四環二職類化合物,是一種植物激素,至今已發現 130 余種(參見 Israelsson et al.Plant Physiol, 135 (I) 221-30，2004)。赤霉素具有促進種子萌發、促進莖的伸長和葉的生長、誘導開花及種子和果實生長等多種生理功能，其對生長發育過程的調節是植物生存和作物生產必不可少的。二十世紀七十年代，育種家培育出植株矮化和抗倒伏的作物新品種，此品種的莖桿縮短，但是生物合成量不變，作物產量增加(參見Schwender etal.Biochem, 31673-80, 1996)。這些表型通常是由于赤霉素合成代謝或信號傳導的相關基因突變引起的。因此，研究赤霉素生物合成途徑基因的功能及其在作物改良中的應用具有
重要意義。根據赤霉素生物合成參與酶系的不同以及參與酶的細胞區隔化，將整個合成途徑分為以下3個步驟:第一步發生在高等植物的原質體內；第二步發生在內質網上；第三步發生在細胞質內，在不同酶的氧化作用下轉變為不同種類的GAs。赤霉素生物合成涉及多種酶的催化作用。其中，GA20-氧化酶催化生成了具有生物活性的GAs，因此，GA20-氧化酶是赤霉素生物合成途徑最重要的限速酶(參見Croker et al.Plant Physiol, 94 (I) 194-200, 1990;Martin et al.Planta, 200(2) 159-66, 1996)，對 GA20-氧化酶基因的克隆和功能確認，并最終應用于農作物種質創新具有重要價值。

在模式植物擬南芥和主要農作物如水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zea mays L.)等中進行了該基因的分離和功能鑒定(參見Spielmeyer etal.PNAS, 999043-9048, 2002; Appleford et al.Planta, 223568-582，2006)，人們對該基因也有了進一步的了解。在許多植物中該酶是由多基因家族編碼的，其氨基酸序列的同源性較低，家族的不同成員之間在表達上具有組織特異性。GA20-氧化酶基因的表達受到多種因素的調節。GA20-氧化酶基因在長日照下的轉錄水平高于短日照下的轉錄水平。當擬南芥從短日照轉到長日照后，GA20-氧化酶活性增加。高溫能促進GA20-氧化酶基因的表達，導致柑橘(Carrizo citrange)果實和葉片中有活性的GAl含量升高(參見Vidal et al.Planta, 217 (3) 442-8，2003)。GA20-氧化酶是典型的受負反饋調節的酶，在赤霉素生物合成突變體內轉錄水平非常高，而當外加活性GA處理時，GA20oxl的轉錄受到顯著的抑制(參見Yamaguchi et al.PlantCell,102115-2126，1998;Thomas et al.Proc.Natl.Acad.Sc1., 964698-4703，1999)。通過有效操控GA20-氧化酶基因的表達可實現植物株型的改變。抑制GA20-氧化酶基因的表達能得到矮化或半矮化的轉基因植株，解決了農作物高產和倒伏的矛盾(參見 Niki et al.Plant Physiol, 126 (3) 965-972, 2001; Sakamoto et al.NatBiotechnol,21909-913,2003;Xiao et al.Plant Growth Regul, 50179-189，2006)。而過量表達GA20ox能促進赤霉素的過量合成，導致單性結實、加快植株生長。例如，在番爺中過量表達該基因致單性結實，增加了果實產量(參見Garci a-Hurtado etal.J Exp Bot, 63 (16) 5803-13, 2012);在樹木中的應用可使木質部纖維細胞的數量增多、纖維變長，最終增加了轉基因植株的生物量(參見Eriksson et al.NatureBiotechnology, 18784-788，2000)。最新研究發現，GA20ox不僅參與植物株型的改變，還與植物抵抗病蟲害有關。水稻0sGA20oX3超表達植株不僅表現出種子萌發快、節間伸長生長旺盛、早花、成熟植株株高增高等赤霉素超量合成表型，在接種稻痕菌(Magnaporthegrlsea.)和紋枯菌(Rhizoctonia solan)后發病級數顯著高于野生型,說明0sGA20ox3作為一種負調控因子參與水稻幼苗對病原真菌的防衛反應(參見Oikawa et al.Plant MolBiol,55 (5)687-700, 2004;Qin et al.Mol Plant Microbe Interact, 26(2)227-39，2013)。由此可見，GA20ox在植物的生長發育中發揮重要的作用，利用轉基因技術控制該基因的表達是改良作物品質的有效方法?；ㄉ俏覈匾挠土献魑镏唬覈ㄉ偖a占全國油料作物總產量的1/2。然而，我國花生產業仍面臨著十分嚴峻的問題，花生產量和含油量的進一步提高仍然是我國花生品種培育的最重要課題。加大生物技術在種質創新和品種培育中的力度是實現我國花生品種改良新飛躍的關鍵。然而，由于對花生重要農藝性狀形成的分子機理知之甚少，花生的分子生物學研究也遠落后于其他農 作物，為了促進花生在我國油料產業中發揮更重要的作用，緩解我國油料及食用油短缺的現狀，必須加快推動花生的分子生物學研究進程，在理論上闡明決定高產、優質與抗逆性狀的遺傳與分子基礎。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供花生GA20-氧化酶蛋白及其編碼基因AhGA20oxl 與應用。一種花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。編碼花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。一種重組載體，插入了核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示的編碼花生6八20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因。該載體可購買市售的載體，經過常規手段，將目的基因SEQ ID N0.2導入載體，SP可獲得含有SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的重組載體。一種重組細胞，含有上述編碼花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因或者上述
重組載體。上述編碼花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因、重組載體和/或重組細胞在改良花生或其他經濟作物品質中的應用。有益效果本發明首次發現了花生GA20-氧化酶蛋白及其編碼基因AhGA20oxl，通過構建AhGA20oxl過量表達載體轉化煙草，研究轉基因植株，確認了所克隆基因的功能。通過分析AhGA20oxl基因在花生不同組織以及在果針不同時期的表達差異，發現AhGA20oxl基因在花生生長發育過程中起重要作用；為闡明赤霉素影響花生莢果發育的分子機理提供了重要的理論依據，并且在高產、優質花生新品種培育方面具有重要指導意義，為利用轉基因技術通過控制赤霉素創新作物新種質奠定了基礎。


圖1、熒光定量PCR分析AhGa20oxl在花生不同組織中的表達量的柱狀圖；其中:JS、幼年莖(15天)，AS、成年莖(40天)，幾、幼年葉片(15天)，AL、成年葉片(40天)，JR、根，F、花，G0、未入土的果針，G3、入土 3天的果針，G9、入土 9天的果針，S、未成熟種子；圖2、植物表達載體pCAMBIA2300_AhGa20oxl的構建過程示意圖；圖3、通過PCR分·子檢測法，對AhGa20oxl轉基因煙草的鑒定；其中:1_10、AhGa20oxl轉基因煙草植株，經PCR顯示為陽性，為轉基因植株；11:陰性對照；M =Marker DL2000 (購自TaKaRa公司)；圖4、轉AhGA20oxl基因煙草與野生型煙草生長20天照片；其中:1:轉AhGA20oxl基因煙草；WT:野生型煙草。
具體實施方案下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護范圍不限于此。生物材料來源:煙草品種SRl購自山東魯生生物科技有限公司；魯花14花生種子購自山東種業集團有限公司；農桿菌EHA105購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心?；ㄉ贩N的種植:選取種仁飽滿、沒有病蟲害及霉變的花生籽粒作為種子。首先溫水浸種2 4h，然后種植于直徑15cm，深IOcm的花盆中。將花盆置于光照培養箱中，白天光照時間為16h，溫度(25±0.3)°C，濕度為80%;夜晚黑暗時間8h，溫度(20±0.3) °C，濕度為80%。一周左右子葉即可出土，在相應時間段進行樣品采集。以下實驗步驟及涉及的培養基均為本領域常規技術，試劑均為市售產品。實施例1:花生AhGa20oxl基因全長的克隆通過分析花生果針和莢果發育早期轉錄組高通量測序的信息，共查找到9條AhGa20oxl的Unigene。將短片段拼接成較長的基因片段，序列3’端缺失大概IOObp的序列，5’端缺失大概20bp左右的序列。通過5’ RACE和3’ RACE進行巢式PCR擴增，最終得到AhGa20oxl全長開放讀碼框。該基因長度1125bp，編碼一種花生GA20-氧化酶，其編碼374個氨基酸殘基。所推導的蛋白質氨基酸序列與大豆GmGA20ox蛋白(XP_003555361.1)、擬南芥 AtGA20ox2 蛋白(NP_199994.1)的同源性分別為 82.2% 和 66.2%。5’ RACE,3' RACE 反應分別使用的是 TaKaRa 公司的 5’-Full RACE KitCTaKaRa Code:D315)、3’-Full RACE CoreSet Ver.2.0 (TaKaRa Code:D314)試劑盒。具體步驟如下:1.1花生RNA的提取:
(I)參照CTAB-LiCl法，稱取0.2g新鮮花生組織(魯花14)，在液氮中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮，防止材料解凍。(2)將研好的組織迅速轉移至預熱(65°C)的含有600μ I CTAB提取液的Ep管中，立即劇烈渦旋振蕩30s，使其混勻。(3 ) 65 °C水浴2_5min，期間劇烈渦旋振蕩3_5次。(4)冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24:1)渦旋振蕩lmin，混勻，4°C，12000rpm 離心 15min。(5)將上清轉移到另一新的Ep管中，加入2μ I的DNase I，37°C水浴15min。(6)再加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24:1)渦旋振蕩lmin，混勻，4°C，12, OOOrpm 離心 15min。(7)將上清轉移到另一新的Ep管中，加入1/3體積的8M LiCl，使其終濃度為2M，4 °C過夜沉淀。(8) 4°C, 12, OOOrpm 離心 20min,棄上清。(9)分別用70%乙醇、無水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50 μ I DEPC-H2O,溶解沉淀。1.25’ RACE 獲得基因 5’ 端:步驟參照5’-Full RACE Kit (TaKaRa Code:D315)試劑盒說明書。通過已知片段序列，利用olige6.0軟件在此片段上設計與5’ RACE試劑盒中的outer引物和inner引物配對的基因特異性引物:
AhGA20oxl-5’race-outer:5’-CCAGTTCCCAAGGCGAGGTCAGGTT-3’ (SEQ ID N0.3)AhGA20oxl-5’race-1nner:5’-GCTCATCCCTAGAAGCTCCATTATCCCC-3’ (SEQ IDN0.4)使用TaKaRa LA Taq (TaKaRa Code:DRR02)進行巢式 PCR 反應。PCR 反應結束后，取10μ I的PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，確認5’ RACE PCR擴增產物，AhGA20oxl的5’端得到大約230bp的條帶，記作AhGA20oxl-5’。1.33’ RACE 獲得基因 3’ 端:步驟參照3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 (TaKaRa Code:D314)試劑盒說明書。通過已知片段序列，利用olige6.0軟件在此片段上設計與3’ RACE試劑盒中的outer引物和inner引物配對的基因特異性引物:AhGA20oxl-3’race-outer:5’-CCTGACCTCGCCTTGGGAACTGGA-3’ (SEQ ID N0.5)AhGA20oxl-3’race-1nner:5’-AACGGAAGGACGATAAGAT-3’ (SEQ ID N0.6)使用TaKaRa LA Taq (TaKaRa Code:DRR02)進行 PCR 反應。PCR 反應結束后，取10 μ I的PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，確認3’ RACE PCR擴增產物，AhGA20oxl的3’端得到大約210bp的條帶，記作AhGA20oxl_3’。1.4RACE擴增產物的切膠回收:電泳后切膠回收使用的是TaKaRa公司的TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.3.0 (TaKaRa Code:9762)試劑盒,步驟參照說明書,制得回收的DNA片段 I (5，RACE 產物)、DNA 片段 2 (3，RACE 產物)。1.5 將回收的 DNA 片段 1、DNA 片段 2 分別連接 pMD 18_T Vector (TaKaRaCode:6011)載體，構建成 pMD18-T-AhGA20oxl_5’、pMD18-T-AhGA20oxl_3’。
連接體系如下:
a、B收WDNA片段I或_收的DNA片段2 4.5 μ
b、pMD18-T||體0.5μ1
C、Solution I5 μ!
總體積IOliI將上述a、b、c反應物混勻，16°C反應過夜，用于轉化大腸桿菌DH5a。1.6大腸桿菌感受態細胞的制備:(I)挑取E.coil DH5 a (購自天根生化科技有限公司)單菌落接種到約5ml的LB液體培養基，于37°C，250rpm震蕩培養過夜。(2)次日將此菌液以lwt%的接種量轉移至IOOml的LB液體培養基中，繼續培養至吸光度OD6qq=0.4左右。(3)將此菌液冰浴lOmin，在無菌條件下轉移至預先冰冷的50ml離心管中，4°C、5000rpm離心IOmin,收集菌體。(4)重懸于 IOml 預冷的 0.lmol/L 的 CaC12 中，冰浴 lOmin,4 °C、5000rpm 離心IOmin,收集菌體。(5)重懸于2ml (含15wt%甘油)的預冷的0.lmol/L的CaCl2中，分裝成100 μ I/管，-70°C保存備用。1.7 轉化:( I)從_70°C冰箱取出大腸桿菌感受態細胞置于冰上溶解。(2)將10 μ I連接體系加至感受態細胞中，充分混勻，冰上放置30min。(3) 42°C熱激90s，在此過程中不要晃動離心管。(4)熱激完畢后立即取出放于冰上2min。(5)加入 600 μ I 的 LB 液體培養基，37°C，200rpm 孵育 lh。(6)將菌液涂布在氨芐霉素(Amp，50mg/L)抗性的LB固體平板上，37°C培養12h。(7)將平板放入4°C保存。1.8質粒的提取:(I)用滅菌的牙簽挑取單克隆菌斑，放入添加氨芐霉素(Amp，50mg/L)的LB液體培養基中，于37°C，250rpm震蕩培養過夜。(2)將菌液轉移到離心管中，室溫8000rpm離心2min，收集菌體。(3)倒去上清液，將離心管倒扣在吸水紙上，使殘余的液體流出。(4)加入100 μ I預冷的溶液I，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩重懸菌體，其中所述溶液 I 配方為:50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl (ρΗ8.0)、10mmol/L EDTA (ρΗ8.0)。(5)加入200 μ I新鮮配制的溶液II，輕柔顛倒混勻10次，冰浴5min，其中所述溶液 II 配方為:0.2mol/L NaOH、lwt%+二烷基硫酸鈉(SDS)。

(6)加入150 μ I預冷的溶液III,輕柔地顛倒10次,冰浴5min, 4°C 12000rpm離心lOmin,其中所述溶液III配方為:5mol/L乙酸鉀60ml、3mol/L冰乙酸11.5ml、H2028.5ml、ρΗ5.2ο(7)將上清轉移到另一干凈的離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(體積比為 25:24:1),反復混勻，4°C 12000rpm 離心 IOmin0(8)將上清轉移到另一干凈的離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(體積比為24:1),反復混勻，4°C 12000rpm 離心 IOmin0(9)將上清轉移到干凈的離心管中，加入等體積預冷(_20°C)的異丙醇，混勻后-20°C沉淀 Ih, 4。。12000rpm 離心 IOmin0(10)倒掉上清，加入500 μ 170%的乙醇洗滌沉淀兩次，空氣中干燥。(11)加入TE溶液和2 μ I RNaseA, 37°C消化0.5h，制得質粒。1.9質粒的酶切檢測:(I)用pMD18-T載體兩端的酶切位點BamH I ,Pst I對質粒進行雙酶切酶切體系:
權利要求
1.一種花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.編碼花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.一種重組載體，插入了核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示的編碼花生6々20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因。
4.一種重組細胞，含有權利要求2所述編碼花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因或者權利要求3所述的重組載體。
5.權利要求2所述編碼花生GA20-氧化酶AhGa20oxl蛋白的基因、權利要求3所述重組載體和/或權利要求4所述重組細胞在改良花生或其他經濟作物品質中的應用。
全文摘要
本發明涉及花生GA20-氧化酶蛋白及其編碼基因AhGA20ox1與應用。一種花生GA20-氧化酶AhGA20ox1蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。編碼花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因與應用。本發明為闡明赤霉素影響花生莢果發育的分子機理提供了重要的理論依據，并且在高產、優質花生新品種培育方面具有重要指導意義，為利用轉基因技術通過控制赤霉素創新作物新種質奠定了基礎。
文檔編號C12N5/10GK103255112SQ201310207109
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月29日 優先權日2013年5月29日
發明者王興軍, 王成祥, 侯蕾, 安靜, 趙術珍, 夏晗, 趙傳志, 李愛芹 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心