一種Si02基大孔材料固定化漆酶及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種8102基大孔材料固定化漆酶及其制備方法，屬于固定化酶制備【技術領域】。該固定化漆酶是以表面改性的塊體Si02大孔材料為載體，將漆酶通過靜電和配位作用固定在該載體上。其制備方法包括兩個步驟：載體的制備和漆酶的固定。載體制備：先將塊體8102大孔材料在水熱條件下用鋁酸鈉改性，再經離子交換得到表面固定多價金屬離子的載體成品。漆酶的固定：將載體浸入漆酶溶液，在室溫下振蕩吸附，經洗滌、干燥，得固定化漆酶成品。本發明提供了一種新型固定化漆酶，具有制備工藝簡單，成本低廉，漆酶活力回收率高，性質穩定等特點。
【專利說明】一種SiO2基大孔材料固定化漆酶及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于固定化酶制備【技術領域】，具體涉及一種SiO2基大孔材料固定化漆酶及 其制備方法。

【背景技術】
[0002] 漆酶（Laccase，E. C. 1. 10. 3. 2)是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于多種生物體 內。漆酶具有寬泛的底物專一性和較好的穩定性，能催化氧化多種難降解有機污染物，包括 酚類化合物、多環芳烴、多氯聯苯及其衍生物、除草劑、殺蟲劑等，它在廢水處理、生物傳感 器構建、生物制漿、食品加工以及有機合成等方面有重要應用價值。因此，國內外科學家在 生物、化學、物理、醫學等多領域對漆酶開展了廣泛的研究工作。
[0003] 游離的漆酶因在使用過程中易隨環境的變化變性失活、易混入產品和不易循環利 用等使其應用受到限制。對漆酶進行固定化是實現其重復利用、改善其穩定性的有效方法。 固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學的方法固定在有機或無機載體上，形成不溶于 水的具有酶活性的衍生物，在催化反應中，它以固相狀態作用于底物，反應完成后，容易與 水溶性反應物分離，可反復使用。固定化酶不但仍具有酶的高度專一性和高催化效率的特 點，且比水溶性酶穩定，可較長期使用，具有較高的經濟效益。
[0004] 自20世紀60年代，固定化酶技術的研究得到了蓬勃發展，迄今為止，已研究開發 了多種酶的固定化方法，包括物理吸附法、共價結合法、交聯法和包埋法等。近年來國際上 對漆酶的固定化進行了較為廣泛的研究，使用的載體包括殼聚糖、親水性微濾膜、SiO 2納米 顆粒、介孔SiO2和介孔碳等多種材料。但是現有的固定化漆酶普遍存在著生產成本高、力口 工工藝復雜、分離效果差等缺點，很難工業化應用。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種以大尺寸塊體SiO2基大孔材料 為載體的固定化漆酶的制備方法。
[0006] 本發明所提供的固定化漆酶的制備方法是，以我們前期制備的薄板狀（長10cm、 寬3cm、厚0· 3cm) SiO2大孔材料（參見專利200910095419. 9)為原料，將其切割成長、寬、 高為0. 2?0. 4cm的塊體；利用該大孔材料機械強度高、水熱穩定性好的特點，先在水熱條 件下用鋁酸鈉對其進行表面改性，再經離子交換得到表面固定多價金屬離子的改性大孔材 料；以表面固定多價金屬離子的大孔材料為載體，將漆酶通過靜電和配位作用固定在該載 體上。具體制備方法如下：
[0007] (1)載體的制備：稱取所需的干燥的塊體SiO2大孔材料置于含濃度為0. 1? 0. 5mol噸4鋁酸鈉溶液的水熱反應釜聚四氟乙烯內襯中，在120?180°C下反應2?24小 時，濾出大孔材料，用去離子水反復沖洗、干燥，浸入金屬鹽水溶液中振蕩4?6小時，濾出、 用去離子水反復沖洗、干燥，即得固定化酶所用的載體；
[0008] (2)漆酶的固定：將步驟（1)中得到的載體浸入用緩沖溶液配置的漆酶溶液中，在 5?30°C下振蕩5?12小時，濾出、用緩沖液洗滌至溶液中檢測不到蛋白，然后真空干燥即 得固定化漆酶成品。
[0009] 步驟（1)中所述的金屬鹽選自在水中易解離出多價金屬離子的水溶性金屬鹽，如 醋酸銅、醋酸鋅、三氯化鐵、二氯化錳、硫酸鎂等。
[0010] 步驟⑵中所述的漆酶溶液的濃度為〇· 05?2. Omg 值為4?8 ;緩沖溶 液可以是醋酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或兩種。
[0011] 本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果：（1)本發明提供的固定化漆 酶，制備工藝簡單，成本低廉；（2)本發明提供的固定化方法，漆酶活力回收率高，可以達到 95%以上；（3)本發明通過靜電和配位作用吸附固定漆酶，固定化漆酶性質穩定；(4)本發 明使用大尺寸的塊體材料固定化漆酶，便于從反應體系中分離出來、重復使用、應用于實際 生產中。

【具體實施方式】
[0012] 下面的實施例是對本發明的進一步說明，本發明的范圍不受實施例的限制。
[0013] 實施例1 :
[0014] (1)稱取Ig塊狀SiO2大孔材料于80°C下干燥2h，置于含50ml、0.3mol · I/1鋁酸 鈉溶液的水熱反應釜聚四氟乙烯內襯中，在120°C下反應12小時，自然冷卻后，用8?10目 的篩網濾出，用去離子水反復沖洗，干燥后得到改性SiO 2大孔材料Al-Si02。
[0015] (2)將Al-SiO2浸入飽和醋酸銅溶液中振蕩4小時，濾出、用去離子水反復沖洗、干 燥，即得固定化酶用的載體Cu 2+-Al-Si02。
[0016] (3)稱取Ig Cu2+-Al-SiO2，浸入50ml用pH = 4. 5緩沖溶液配置的蛋白濃度為 0. Img · πιΓ1的粗漆酶溶液中，在25°C、轉速為50r · rniiT1的搖床中振蕩5小時、用8?10 目的篩網濾出，用緩沖液洗滌至上清液中檢測不到蛋白，即得固定化漆酶。該固定化漆酶的 酶活回收率為100. 4%，酶活為59. 2U · g4(定義一分鐘使1 μ mol的ABTS氧化所需的酶量 為一個酶活單位U)，固定化漆酶具有良好的操作穩定性，與底物ABTS反應反復操作10批次 后剩余酶活為初始酶活的72. 7%。
[0017] 實施例2:
[0018] ⑴同實施例1(1)。
[0019] (2)將Al-SiO2浸入0.5mol i1醋酸鋅溶液中振蕩5小時，濾出、用去離子水反復 沖洗、干燥，得固定化酶用的載體Zn2+-Al-Si0 2。
[0020] (3)稱取0· Ig Zn2+-Al-SiO2，浸入5ml用pH = 4. 0緩沖溶液配置的蛋白濃度為 0. 05mg · πιΓ1的粗漆酶溶液中，在25°C、轉速為50r · rniiT1的搖床中振蕩5小時、濾出，用 緩沖液洗滌至上清液中檢測不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活回收率為95. 4%，酶活為 20. OU · g'與底物ABTS反應反復操作10批次后剩余酶活為初始酶活的71. 2%。
[0021] 實施例3:
[0022] (1)同實施例 1(1)。
[0023] (2)將Al-SiO2浸入0.5mol噸―1三氯化鐵溶液中振蕩4小時，濾出、用去離子水反 復沖洗、干燥，得固定化酶用的載體Fe 3+-Al-Si02。
[0024] (3)稱取Ig Fe3+-Al-SiO2，浸入50ml用pH = 4. 0緩沖溶液配置的蛋白濃度為 0. 05mg · mr1的粗漆酶溶液中，在25°C、轉速為50r · mirr1的搖床中振蕩5小時、濾出，用 緩沖液洗滌至上清液中檢測不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活回收率為96. 8%，酶活為 27. 5U · g'與底物ABTS反應反復操作10批次后剩余酶活為初始酶活的77. 4 %。
[0025] 實施例4 :
[0026] (1)同實施例 1(1)。
[0027] (2)同實施例 2 (2)。
[0028] (3)稱取Ig Zn2+-Al-SiO2，浸入50ml用pH = 4. 0緩沖溶液配置的蛋白濃度為 2. Omg · πιΓ1的粗漆酶溶液中，在25°C、轉速為50r · HiirT1的搖床中振蕩6小時、濾出，用緩 沖液洗滌至上清液中檢測不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活為76. 2U · g'
【權利要求】
1. 一種SiO2基大孔材料固定化漆酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 載體的制備：稱取所需的干燥的塊體SiO2大孔材料置于含濃度為0. 1? 0. 5mol噸4鋁酸鈉溶液的水熱反應釜聚四氟乙烯內襯中，在120?180°C下反應2?24小 時，濾出大孔材料，用去離子水反復沖洗、干燥，浸入金屬鹽水溶液中振蕩4?6小時，濾出、 用去離子水反復沖洗、干燥，即得固定化酶所用的載體； (2) 漆酶的固定：將步驟（1)中得到的載體浸入用緩沖溶液配置的漆酶溶液中，在5? 30°C下振蕩5?12小時，濾出、用緩沖液洗滌至溶液中檢測不到蛋白，然后真空干燥即得固 定化漆酶成品。
2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（1)中所述的金屬鹽選自在水中 易解離出多價金屬離子的水溶性金屬鹽。
3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（2)中所述的漆酶溶液濃度為 0· 05 ?2. Omg · ml 工、pH 值為 4 ?8。
【文檔編號】C12N11/14GK104212789SQ201310226114
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月29日 優先權日:2013年5月29日
【發明者】梁云霄, 張群, 張瑞豐, 張育淇, 劉曉貞, 劉燕, 金林鈴 申請人:寧波大學