評估解凍細胞的存活能力的方法
【專利摘要】本發明涉及一種評估解凍細胞的存活能力的方法，其中所述細胞是配子、胚胎、核體、推定的干細胞群體、干細胞前體群體或者干細胞群體。該方法包括將解凍細胞在包含眾多氨基酸的培養基中培育和測定該培養基中至少一種氨基酸的濃度變化。
【專利說明】評估解凍細胞的存活能力的方法
[0001]本申請是2007年I月26日提交的中國專利申請CN200780010271.3的分案申請，后者是PCT/GB2007/000277的中國國家階段申請。
[0002]為了 IVF過程中的成功率，刺激卵巢以產生多于一個的卵母細胞(oocyte)。結果，大多數IVF周期導致胚胎(embryo)的總數超過了用于在單個周期中轉移至個體患者的最適量(optimum)。對此問題合乎倫理和經濟的方法是胚胎冷藏(cryopreservation)。胚胎冷藏允許儲藏特大數量的(supernumeracy)優質胚胎直至它們能在后面的周期中被轉移，從而減少了達到懷孕所需的刺激卵巢藥物處理周期的數目，并因此減少了患卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome)的風險(Trounson, 1986),且提供了對多胎妊娠的防止。冷藏還允許在自發排卵周期或者雌激素和孕酮激素水平不超過天然存在的水平的周期中替換(replacement)解凍的胚胎，因此增加了每個患者的懷孕率。大多數的輔助受孕單位常規地提供前核的或早期卵裂期(early cleavage stage)的胚胎的冷藏。
[0003]利用了速度受控冷凍技術:在冷凍保護劑流體中緩慢冷卻胚胎，從體溫降至-196°C (此處所有的細胞過程停止)，在該溫度將它們儲藏于液氮容器中。所述的冷凍保護劑用于保護細胞免受損害。當將這些細胞解凍時，從液氮中取出它們，解凍，除去冷凍保護劑，和培養細胞。導致細胞損害以及危害解凍后功能和發育的幾個因素與冷卻和冷藏有關。細胞損害可由細胞內冰(intracellular ice)的形成然后該細胞內冰的快速冷卻引起；細胞外冰的形成也導致在未結冰部分電解質濃度的增加以及細胞脫水。利用膜溶質相互作用(membrane solute interaction)的體外模型檢測到:脫水和復水(re-hydration)導致脂質膜上的機械應力并引起物理變形和相(Phase)行為的改變。這些物理改變可在多種程度影響細胞:可改變細胞膜和細胞器；已顯示圍繞胚胎的透明帶(zona pellucida)在冷藏過程中遭受(一定量的)硬化，以及紡錘體進而染色體分離會受到損害。近來，已顯示一些基因受到冷凍和解凍過程的誘導，這說明該細胞積極響應刺激(insult)。與冷凍保護劑組合的緩慢冷凍允許通過減少細胞內冰和減少溶質濃度增加的影響來保護細胞免于上述有害的機制(mechanism)。所述細胞外冰驅動細胞經由平衡過程脫水。更快速的方法，即玻璃化(vitrification),使用高濃度(high level)的冷凍保護劑和非常快速的冷卻，以使細胞內冰的形成最小化。它是非平衡方法。
[0004]冷凍和冰形成導致雙層(即兩層)脂質膜的脫水。借助冷凍(with freezing)液體結晶至凝膠的相變導致磷脂的烴尾部的有序化成為更加緊密的和平行的陣列，這可引起對水和陽離子的滲透性增加、整合膜蛋白的分離、膜結合酶的活性降低、蛋白質的徑向擴散的降低。精子和卵母細胞很可能經歷類似的作用，盡管它們的脂質構成非常不同。成熟卵母細胞具有位于減數分裂的紡錘體處的微管。將溫度降至25°C于10分鐘使微管破裂，而且完全分裂(dissolution)發生于0°C。在小鼠中重新升溫導致微管的重建，但是這不發生于人中，因為缺乏成核細管聚合(nucleate tubule polymerization)所需的中心粒旁物質。因紡錘體解體，所得的卵母細胞往往可以具有非整倍性(aneuploidy)(即染色體數目異常)。冷凍還可通過降低透明帶的胰凝乳蛋白酶敏感性和皮質顆粒(cortical granule)而影響受精。實際上殼可能太“堅硬”。Linford和Meyers使用單細胞凝膠電泳顯示精子可能受到損傷。線粒體也易受冷藏損傷。在冷藏和隨后的培養過程中，卵母細胞DNA的退化似乎涉及細胞凋亡(apoptosis)過程,并檢測到典型標記(classic markers)和胱天蛋白酶(caspase)。因此細胞經歷程序性細胞死亡。感興趣的是，還激活了與應激反應有關的基因，包括與熱休克蛋白、氧化應激清除劑(scavenger)和涉及葡萄糖代謝的酶有關的基因。
[0005]盡管胚胎冷藏通常被認為是安全的方法(Wood)，仍然存在關于該技術的長期安全性的爭議(Winston和Hardy，2002)。這主要是小鼠中進行的研究的結果，其中已顯示胚胎冷凍可影響植入前后期發育(late preimplantation development)中的新陳代謝(Emiliani等,2000)和具有只在發育后期顯示的更精細的(subtle)長期效果(Dulioust等，1995)。也有報道人胚胎的冷凍改變了基因表達模式(Tachataki等，2003)。這些研究者發現第2天冷凍胚胎比第2天新鮮胚胎含有更少的結節性硬化基因(tuberous sclerosisgene)TSC2 的 mRNA。
[0006]對于冷藏技術用途的主要關注是凍傷造成的可能的胚胎損失，這意味著一些健康胚胎可以不存活于冷凍和解凍的應激。凍傷造成的胚胎損失的精確數目可變化，但非常可能的是冷凍會引起一些胚胎的損失，可能與冷藏的那些胚胎的25-50%—樣多。對此的一種解釋是冷藏甚至可以作為更有活力的胚胎的“選擇門(selection gate) ”，盡管這尚未得到證實。
[0007]對于冷藏的另一關注是由冷凍/解凍胚胎產生的兒童中先天缺損的潛在風險。在家畜工業中，大規模的胚胎冷凍和移植未導致先天缺損的增加。到目前為止，對那些出身于解凍胚胎的人后代(human offspring)的研究,未顯示相比于此群體的其余者懷孕結果出現異常性方面任何顯著的增加。
[0008]總的說來，冷藏導致植入可能性30?40 %的下降(Edgar等，2000和2005 ；El-Toukhy等，2003)。其它研究已顯示類似的冷凍解凍胚胎的臨床懷孕和植入率的范圍為10 至 30%和 5 至 15% (Van der Elst 等，1997 ;Kowalik 等，1998 ;Ubaldi 等，2004)。在冷凍周期中的胚胎轉移成功率的降低歸因于這樣的事實:冷藏胚胎必須另外忍受冷凍和解凍過程，該過程通常在本領域中被認為會改變內環境穩定(homeostasis)、新陳代謝、細胞完整性和發育潛能(developmental potential)。已知新陳代謝是早期胚胎健康所固有的,且當胚胎受到應激時新陳代謝立即擾亂(Houghton和Leese, 2004 ；Lane和Gardner, 2005綜述)。限制冷藏的成功的最重要因素之一是歸因于冷凍過程中冰晶形成的解凍后胚胎存活率(Liebermann等,2002),所述冰晶形成被認為損傷細胞膜和導致裂球(blastomere)裂解(Pal 等，2004)。
[0009]考慮到以上所述毫無疑義的是，盡管第一例冷藏之后成功的懷孕報導于1983，但冷藏的方法依然是相對新的且對胚胎和后續的后代的長期影響是未知的。冷藏的主要缺點是利用冷凍/解凍胚胎引起懷孕的成功率通常低于在“新鮮周期”中的成功率，植入可能性大體上下降30至40%。這些差異說明胚胎的冷凍和解凍會對胚胎的存活能力具有有害的影響。當處于冷凍狀態時冷藏胚胎可保持其存活能力的時間長度也是未知的。
[0010]IVF的成功取決于用于轉移入子宮的最好胚胎的選擇。在轉移前，解凍胚胎，并檢查每個胚胎從而確定它是否醫學上適于轉移(能生存的，正常發育的胚胎)。沒有用于胚胎質量的準確試驗，且"優質的胚胎"的區別是主觀的評估。目前使用形態學標準選擇胚胎。形態學評估包括計數胚胎中的細胞數和建立其“等級”;通常在I至4或者I至5級。然后可將等級和細胞數的測量組合從而給出具體胚胎的“得分”。對胚胎的評分是高度技巧性的工作，且花費一般臨床胚胎學家約3個月去學習。形態學評估的主要問題是其涉及的高度主觀性。它不提供發育潛能的穩健檢驗(robust test)，因為每個啟動的處理周期只有23%的平均成功率(REF，HFEA)。在解釋該低成功率(盡管是形態學上良好的胚胎的轉移)的可能原因中有子宮內膜的接受能力(Bourgain和Devroey, 2003 ;Devroey等,2004 ；Lukassen等，2004)以及導致連接區收縮增加的創傷性胚胎轉移(Lesny和Killick的綜述，2004)。很多的數據表明:在不同培養基中培養的胚胎的基因表達圖式發生改變但是其形態學上顯示正常(Ho 等，1995 ；Rizos 等，2003 ；Rinaudo 和 Schultz, 2004 ；Lee 等，2004)。因此胚胎可能具有正常的形態但在其生物化學方面具有改變，這使得目前胚胎學家不可能選擇絕對最好的胚胎用于轉移。
[0011]在顯微鏡分析之后，只有約50%的冷凍胚胎符合轉移的要求。據認為，未能存活于冷藏和解凍過程的那些胚胎可能產自活力較差的卵母細胞或精子。冷凍胚胎轉移過程的實際周期與在IVF周期中獲得的“新鮮”胚胎的實際周期相同。
[0012]共同未決的專利申請W001/53518顯示在分裂過程中氨基酸的消耗/出現(“轉化”)預示備用的“新鮮”人胚胎體外發育至胚泡期(blastocyst stage)的能力(Houghton等，2002)以及導致轉移后懷孕和產生活的后代的能力(Brison等，2004)。這些發現是與一般理論一致的:在發育的早期決定了發育能力，且植入前發育的早期中的擾動可具有長期的牽連(implication) ο
[0013]因為冷藏技術能提供輔助避孕的實際優點，所以存在著對可靠地評估解凍后的卵或胚胎的發育能力的需求。
[0014]冷藏不是良性的方法，且細胞的許多功能可受到影響。因而對已經歷冷藏過程的胚胎的選擇標準不同于在“新鮮”胚胎的選擇中所使用的那些標準。冷凍過的胚胎一般生長較慢，因此形態學上非常不同于新鮮胚胎。當有著大量的胚胎可用于轉移時，對用于選擇最好胚胎的有效參數的需求是極為重要的。植入多胚胎已導致無法接受的高比率的多胞胎(multiple birth)。輔助受孕的目的是制造健康嬰兒，因此減少多胎妊娠率是主要目的，且轉移單個胚胎是理想的。鑒定具有高植入潛能的胚胎的能力將允許更有效地選擇胚胎用于胚胎轉移和在不降低總的懷孕率的條件下降低多胎妊娠的可能性。對用于選擇最有可能發育至足月的解凍胚胎的有效參數的需求是極其重要的。

【發明內容】

[0015]根據本發明，本文提供了一種評估解凍細胞的存活能力的方法，其中所述細胞為配子(gamete)、胚胎(embryo)、核體(karyoplast)、推定的干細胞群體、干細胞前體群體或者干細胞群體，所述方法包括在含有眾多氨基酸的培養基中培育解凍細胞和測定該培養基中至少一種氨基酸的濃度變化。
[0016]出人意料的是，已發現單個人胚胎在氨基酸方面的解凍后新陳代謝可用于預測發育至胚泡期的能力。
[0017]本發明的方法同樣適用于其它哺乳動物物種諸如牛和豬。牛胚胎是人的良好模型:牛和人一樣通常為單排卵(monovulator)。牛胚胎的直徑還與人胚胎(?140 μ )大約相同，且具有作為氧、丙酮酸和葡萄糖消耗和/或乳酸生成測量的大致相似的能量代謝模式。體外生成(IVP)牛受精卵(zygote)在體外達到胚泡期的比例(20-40% )與人受精卵(20-50% )大約相同，且受精卵基因組激活啟動于緊密相關的階段(在人中4-8細胞；在牛中8-16細胞階段)。在桑椹胚(morula):胚泡轉變過程中，豬胚泡的氨基酸新陳代謝模式(profile)在質量上和數量上類似于由人胚胎給出的，這說明豬胚泡也是人的良好模型。
[0018]該方法同樣容易適用于不同細胞類型，例如配子(處于任意發育階段)、核體、推定的干細胞群體、干細胞前體群體或者干細胞群體。這些細胞類型都可被冷凍，且適用本發明的普通原理。以最廣的意義使用術語存活能力(viability)，其中包括胚胎發育至胚泡期，胚胎的成功植入和植入前篩選方法。
[0019]在本發明的一個實施方案中，如果變化滿足預定標準，則該方法包括選擇所述的用于進一步發育的解凍細胞的步驟。優選該預定的標準是至少一種氨基酸的增加或減少。
[0020]優選培養基包含補充有葡萄糖、L-乳酸、丙酮酸和氨基酸的生理混合物的Earle' s平衡鹽溶液。優選使用HPLC然后是以鄰苯二甲醒(o-phthaldialdehyde)的衍生化來測量已用(spent)培養基中的氨基酸的濃度。
[0021]在該方法的一種實施方案中，產生氨基酸消耗或生成模式。優選氨基酸消耗或生成模式整體上用作評估解凍細胞的存活能力的選擇標記。在本發明的一個實施方案中，最有活力的(most viable)解凍細胞的選擇基于一組氨基酸(通常包括2至7種氨基酸)，這組氨基酸的消耗或生成模式是該物種的健康、發育中的解凍細胞的指示。或者，最有活力的解凍細胞的選擇基于單一的氨基酸，其消耗或生成模式是該物種的健康、發育中的細胞的指示。
[0022]優選解凍細胞源于任何的生物體，該生物體包括人、牛、豬、羊、任何家畜或稀有和受脅(threatened)物種。在優選的實施方案中，該方法用于人。
[0023]優選用于選擇標記的氨基酸包括包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸中的一種或它們的組合。
[0024]優選該方法包括評估解凍的哺乳動物植入前胚胎發育至胚泡期和/或成功植入的能力，所述方法包括:
[0025](i)將解凍的哺乳動物植入前胚胎在包含眾多氨基酸的培養基中培育，以及；
[0026](ii)測定該培養基中至少一種氨基酸的濃度的增加和/或減少以測定氨基酸轉化(turnover)，其中有著較小范圍的氨基酸轉化的解凍的哺乳動物植入前胚胎與發育至胚泡期和/或成功植入關聯。
[0027]優選該方法還包括選擇所述的解凍的哺乳動物植入前胚胎用于進一步發育至胚泡期和/或植入的步驟。
[0028]優選解凍的哺乳動物植入前胚胎發育至胚泡期和/或成功植入是在將解凍的哺乳動物植入前胚胎轉移至培養基之后24小時、10小時、6小時或更少時間內完成的。
[0029]優選使用該方法評估解凍的哺乳動物植入前胚胎用于植入和引起臨床懷孕的能力。通過植入之后15天的血清hCG檢測胚胎轉移后的臨床懷孕并通過在5周時胎心的存在來確認(Brison等，2004)。
[0030]優選從發育的第I天直至第4天來評估解凍的哺乳動物植入前胚胎。
[0031]在本發明的一個實施方案中，該方法還包括基于氨基酸模式選擇解凍的植入胚胎和將所選的解凍的哺乳動物植入前胚胎引入生物體的子宮(uterine tract)中。[0032]在本發明的一個實施方案中，解凍的哺乳動物植入前胚胎是源于體外成熟的卵的哺乳動物植入前胚胎。或者，解凍的哺乳動物植入前胚胎是源于體內成熟的卵的哺乳動物植入前胚胎。
[0033]在本發明的一個實施方案中，通過胞質內精子注射(ICSI)制備解凍的哺乳動物植入前胚胎。
[0034]在本發明的一個實施方案中，該方法包括測定至少一種氨基酸(包括利用包含2至7種氨基酸的氨基酸組)的濃度的增大和/或減少，其氨基酸的轉化是該物種的解凍的哺乳動物植入前胚胎發育至胚泡期和/或成功植入的能力的指示。
[0035]因此，本發明提供一種評估解凍的哺乳動物植入前胚胎發育至胚泡期和/或成功植入的能力的方法，所述方法包括將單個解凍的哺乳動物植入前胚胎在包含眾多氨基酸的培養基中培育，測定該培養基中至少一種氨基酸的濃度變化，其中該濃度變化是解凍的哺乳動物植入前胚胎發育至胚泡期和/或成功植入的能力的指示。
[0036]本發明還提供一種區別有發育能力(developmentally competent)和發育停止的(arresting)等級I胚胎的方法，其包括將等級I胚胎在含有眾多氨基酸的培養基中培育和測定該培養基中至少一種氨基酸的濃度的變化。
[0037]發明詳述
[0038]只通過實施例并參考【專利附圖】

【附圖說明】了本發明:
[0039]圖1從發育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎的氨基酸消耗和出現。對于發育至胚泡期的胚胎η = 21 ;而對于在胚泡期前發育停止的胚胎η = 25。*Ρ < 0.05 ;**Ρ< 0.01 ;***Ρ < 0.001不同于O的顯著性(significance from zero)。具有相同上標的豎條是顯著不同的；a 和 b，P = 0.001 ；c, P = 0.0025 ；d, P = 0.016 ；e, P = 0.032 ；f, P =
0.0448。
[0040]圖2從發育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎的總氨基酸的生成、消耗、轉化和余額(balance)。*P < 0.05 < 0.01 < 0.001顯著不同于發育停止的胚胎。
[0041]圖3從發育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎所利用的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和。***p < 0.001顯著不同于發育胚胎。
[0042]圖4發育停止或發育至胚泡期的單獨的冷凍解凍的胚胎所利用的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和。
[0043]圖5從發育的第2天至第3天等級I解凍的人胚胎的氨基酸消耗和出現。對于發育至胚泡期的胚胎η = 6 ;對于在胚泡期前發育停止的胚胎η = 13。*Ρ < 0.05 < 0.01 ；***Ρ < 0.001不同于O的顯著性。具有相同上標的豎條是顯著不同的；a, P = 0.014 ；b, P=0.024 ；c, P = 0.029 ；d, P = 0.035 ；e, P = 0.0493 ；f, P = 0.050。
[0044]圖6從發育的第2天至第3天等級I解凍的人胚胎的總氨基酸生成、消耗、轉化和余額。*P <0.05顯著不同于發育停止的胚胎。
[0045]方法
[0046]獲得被告知的患者同意捐贈用于研究的備用冷凍人胚胎得自在St James’ sHospital, Leeds的輔助受孕單位進行體外受精(IVF)的患者。該工作得到了 HumanFertilisation and Embryology Authority (人受孕和胚胎管理局)(HFEA)以及合作機構的倫理委員會(Ethics Committees)的完全倫理批準。[0047]如前所述(Balen，2001)進行卵巢刺激和卵母細胞收集。通常，使用長期垂體脫敏規程(long pituitary desensitisation protocol),以及鼻內那法瑞林(nafarelin)給藥，然后是用人絕經期促性腺激素(hMG, Menogon, Ferring Pharmaceuticals Ltd)或者重組FSH(Puregon, Organon Laboratories Ltd)進行促性腺激素刺激。簡而言之，在hCG給藥36h后通過卵泡吸引術收集卵母細胞并于37°C在5% CO2中在Med1-Cult IVF培養基浸油(Med1-Cult)中培養。在hCG后約40小時，用最終濃度為70，000活動精子每毫升來授精卵母細胞-丘復合體(oocyte-cumulus complex),并培育過夜直至通過兩前核的存在來確認受精(授精后第I天)。在受精卵用于研究前，將受精卵同上在70μ I的Med1-Cult IVF培養基浸油的液滴中培育。在授精后第2天轉移最多3個胚胎，將任何剩余的胚胎冷凍并存儲于液氮中用于可能的將來用途。根據HFEA的指導，胚胎只可存儲5年，因此每年(on ayearly basis)聯系患者以確定他們是否愿意將他們的胚胎繼續存儲、放棄或捐贈用于研究。將這些捐贈用于研究的胚胎以干式運輸(in a dry shipper)運輸至York以用于本研究。
[0048]使用Sydney IVF解凍試劑盒(Cook, Queensland, Australia)將胚胎解凍并置于浸礦油的10 μ IEBSS培養基液滴中約3小時，該EBSS培養基補充有0.5%的HSA，ImM的葡萄糖,0.47mM的丙酮酸(pyruvate)，5mM的乳酸(lactate)和氨基酸的接近生理的混合物(aclose to physiological mixture of amino acid) (Tay 等，1997)。每個患者的胚胎在治療組和所評估的胚胎的發育等級和階段之間隨機化(Houghton等，2002)。然后將這些胚胎在空氣中于37°C在含有5%的0)2和20%或者5%的O2的增濕氣氛中在4μ I的相同培養基液滴中單獨地培養24h (從第2天至第3天)。在培育后，評估胚胎的形態學，并將胚胎單獨置于10 μ I預平衡的培養基液滴中，并在5%或20%的O2下培育直至發育的第5天。將已用的培養基儲存于-80°C。又一次評估發育階段和等級，然后將胚胎在5%或20%的O2下的4μ I預平衡的培養基液滴中單獨放置24h直至發育的第6天。在將胚胎從液滴中移出之前，評價胚胎發育階段和等級。將已用的培養基儲存于_80°C。
[0049]氨基酸分析
[0050]將無胚胎的對照液滴在與含有胚胎的那些液滴相同的培養皿(dish)中培育，從而允許在整個培養周期中氨基酸濃度的任何非特異性變化。解凍已用培養基，并用23 μ I的HPLC級水稀釋2 μ I等分試樣。利用附接于Jasco F920熒光探測儀和4.5x250mm的Hypersil 0DS-16 柱(Jones Chromatography)的 Kontron500 通過反相 HPLC 進行氨基酸分析，如前所述(Houghton等,2002)。簡單地說,通過使25 μ I樣品與等體積的試劑(10 μ I的2-巰基乙醇和5ml的鄰苯二甲醛(OPA)試劑)自動反應來完成衍生化。以1.3毫升/分鐘的流速操作洗脫梯度。溶劑A由18ml的四氫呋喃(Fisher Chemicals), 200ml的甲醇和800ml的乙酸鈉(83mmol/l, ρΗ5.9)組成。溶劑B由800ml的甲醇和200ml的乙酸鈉(83mmol/l,pH5.9)組成。利用該方法不可能檢測到脯氨酸和半胱氨酸。
[0051]統計分析
[0052]利用Anderson-Darling正態檢驗來分析所有的數據以確定它們是否為正態分布。利用1-樣品t-檢驗或I樣品Wilcoxon檢驗來檢驗氨基酸消耗/出現的數據不同于O的顯著性，這取決于該數據是否正態分布的。利用Student’ s t_檢驗或Mann-Whitney U檢驗分析發育停止的胚胎和發育中的胚胎的氨基酸模式間的差異。通過Student’ s t-檢驗分析氨基酸消耗、出現、轉化和余額之間的差異。
[0053]結果
[0054]第2天至第3天解凍胚胎的氨基酸轉化
[0055]培養基顯著地消耗了絲氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸(圖1)，同時出現天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。隨后未能發育至胚泡期的解凍胚胎消耗了谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸，而生成了天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。發育至胚泡期的那些解凍胚胎和胚泡形成前發育停止的那些胚胎之間在谷氨酰胺(P = 0.001)、丙氨酸(P = 0.001)、甘氨酸(P = 0.0025)、谷氨酸(P = 0.016)、精氨酸(P = 0.032)和賴氨酸(P = 0.0448)的利用上存在顯著的差異(圖1)。
[0056]出乎意料的是，隨后未能發育至胚泡期的一群冷凍/解凍的第2天至第3天的胚胎比發育至胚泡期的那些含有更多的等級I胚胎(表I)，但是隨后發育至胚泡的等級I胚胎與胚泡形成前發育停止的等級I胚胎之間，在每胚胎的裂球平均數上不存在差異。同樣地，在這兩組之間不存在總平均裂球數之間的差異(表I)。
[0057]總的來說，在胚泡期之前發育停止的胚胎在氨基酸轉化、消耗(P = 0.011)和生成(P = 0.009)顯著更多的氨基酸方面，比它們發育中的對等物(counterpart)在代謝上更活躍(圖2)。有趣的是，已發現發育中的胚胎在它們的氨基酸轉化方面是平衡的，也就是說，消耗量等于生成量；然而發育停止的胚胎具有負的余額，也就是說，從培養基中消耗的氨基酸多于它們生成的氨基酸(圖2)。發育至胚泡期的那些胚胎和在胚泡形成前發育停止的那些胚胎之間，在從第2天到第3天谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和上存在著顯著的差異(P < 0.001)(圖3)。使用單獨胚胎的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和，可能以91%準確性預測哪些胚胎將發育至胚泡期(圖4)。
[0058]當確定了等級I胚胎的氨基酸模式時，隨后發育至胚泡期的那些胚胎與在胚泡形成前發育停止的那些等級I胚胎相比，在氨基酸消耗/出現上存在顯著差異(圖5)。兩組間具體的差異存在于賴氨酸(P = 0.014)、甘氨酸(P = 0.024)、色氨酸(P = 0.029)、精氨酸(P = 0.035)、谷氨酸(P = 0.0493)和谷氨酰胺(P = 0.050)的利用上。應注意的是:等級I發育停止的胚胎和發育中的胚胎之間，在裂球平均數上不存在顯著的差異(表I)。在總氨基酸的消耗、出現或者氨基酸的余額上，等級I胚胎不顯示顯著的差異(圖6)。然而，發育停止的等級I胚胎在氨基酸轉化方面比發育至胚泡期的那些胚胎在代謝上更活躍。
[0059]表1:解凍后胚胎的等級分布和平均裂球數
【權利要求】
1.一種評估解凍細胞的存活能力的方法，其中所述細胞是配子、胚胎、核體、推定的干細胞群體、干細胞前體群體或者干細胞群體，所述方法包括在含有眾多氨基酸的培養基中培育解凍細胞和測定該培養基中至少一種氨基酸的濃度變化。
2.根據權利要求1的方法，其還包括如果所述變化滿足預定的標準則選擇所述的解凍細胞用于進一步發育的步驟。
3.根據權利要求1或2的方法，其中培養基包含Earle's平衡鹽溶液，所述Earle' s平衡鹽溶液補充有葡萄糖、L-乳酸、丙酮酸以及氨基酸的生理混合物。
4.根據任意前述權利要求的方法，其中使用HPLC然后是以鄰苯二甲醛的衍生化來測量在已用的培養基中氨基酸的濃度。
5.根據任意前述權利要求的方法，其中產生了氨基酸消耗或生成模式。
6.根據權利要求5的方法，其中所述氨基酸消耗或生成模式整體上用作評估解凍細胞的存活能力的選擇標記。
7.根據權利要求6的方法，其中最有活力的解凍細胞的選擇是基于通常包括2至7種氨基酸的一組氨基酸，這組氨基酸的消耗或生成模式是該物種的健康、發育中的解凍細胞的指示。
8.根據權利要求6的方法，其中最有活力的解凍細胞的選擇是基于單一的氨基酸，其消耗或生成模式是該物種的健康、發育中的細胞的指示。
9.根據任意前述權利要求的方法，其中所述解凍細胞源于任意的生物體，該生物體包括人、牛、豬、羊、任意家畜或者稀有和/或受脅物種。
10.根據權利要求9的方法，其中該方法用于人。
11.根據權利要求10的方法，其中用于選擇標記的氨基酸包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸中的一種或它們的組合。
12.根據權利要求10的方法，其中用于選擇標記的氨基酸是谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸。
13.—種區分有發育能力的和發育停止的等級I胚胎的方法，其包括在含有眾多氨基酸的培養基中培育等級I胚胎和測定該培養基中至少一種氨基酸的濃度變化。
14.根據權利要求13的方法，其還包括如果所述變化滿足預定的標準則選擇所述的等級I胚胎用于進一步發育的步驟。
15.根據權利要求13或權利要求14的方法，其中產生了氨基酸消耗或生成模式。
16.根據權利要求15的方法，其中所述氨基酸消耗或生成模式整體上用作評估細胞的存活能力的選擇標記。
17.根據權利要求16的方法，其中最有活力的細胞的選擇是基于一組氨基酸，優選賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。
【文檔編號】C12N5/073GK103529218SQ201310225929
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2007年1月26日 優先權日:2006年1月27日
【發明者】亨利·J·利斯, 弗蘭切斯卡·D·霍頓 申請人:諾沃塞勒斯有限公司