一種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記及檢測方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記及檢測方法和應用，該分子標記位于豬的Orexin基因核苷酸序列中，在SEQIDNO：1的第516bp處有一個G516-A516的堿基突變。利用引物:TCATCTCATTTCCCCCTCCCAGC；和GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTATTTAGC對該基因進行擴增，酶切后可準確檢測豬的基因型。同時運用混合模型來統(tǒng)計分析Orexin基因SNP位點的基因型效應及其與飼料轉化效率性狀的關系，發(fā)現(xiàn)此多態(tài)位點與平均日增重、采食量、剩余采食量等飼料轉化效率性狀顯著相關，促進了對豬飼料轉化效率的研究進展。
【專利說明】一種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記及檢測方法和 應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于豬分子標記制備領域，具體涉及一種與豬飼料轉化效率性狀相關的分 子標記，還涉及一種基于與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記的檢測方法，還涉及一種 與豬飼料轉化效率性狀相關分子標記的應用。

【背景技術】
[0002] 畜牧業(yè)在現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展中占據(jù)著非常重要的地位，其在農業(yè)生產中所占有的比值 通常用來衡量一個國家和地區(qū)發(fā)展程度的重要指標。豬肉作為我國最主要的肉類來源，生 豬養(yǎng)殖產業(yè)在我國畜牧業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。在20世紀80年代中期，我國肉類產 量約2000萬噸，豬肉約占85%，2012年豬肉產量達到了 5335萬噸，約占肉類總量63. 63%。 雖然豬肉所占比重逐漸下降，但其始終占據(jù)主導地位。在養(yǎng)豬行業(yè)中，飼料成本占養(yǎng)豬總成 本的65-75%。因此，降低生豬養(yǎng)殖中的飼料消耗，提高飼料利用效率，降低飼料成本關系到 養(yǎng)豬企業(yè)發(fā)展，乃至生存。研究發(fā)現(xiàn)，豬的飼料轉化效率同采食量、平均日增重、肌內脂肪等 經(jīng)濟性狀顯著相關(趙克斌，提高生長育肥豬飼料轉化率降低飼料成本的策略.豬業(yè)科學， 2008,60-63)。因此，影響豬采食量、平均日增重、肌內脂肪等性狀的基因可作為研究豬飼料 轉化效率的候選基因。
[0003] 增食欲素 Orexin是一種重要的神經(jīng)肽，在小鼠的下丘腦中研究發(fā)現(xiàn)（Sakurai T，Ama miya A，Ishii M，et al.Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropepti des and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior[J]. Cell, 1998, 92(4):573-585;De Lecea L, Kilduff TS,Peyron C，Gao X，F(xiàn)oye PE，Danielson PE，F(xiàn)ukuhara C，Batt enberg EL, Gautvik VT, Bartlett FS,Frankel WN, van den Pol AN, Bloom FE,Gautvik KM，Sutcliffe JG. 〃The hypocret ins:Hypothalamus-specific peptides with neuroexcitatory a ctivity^[J]. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S.A，1998,95(1) :322 - 327)。外側下丘腦是攝食中樞，刺激此處時飽 食的動物還要采食，如損毀下丘腦外側區(qū)，動物體重下降、厭食以致死亡。這兩種現(xiàn)象表 明，下丘腦是調節(jié)進食和能量平衡的關鍵部位，Orexin在該區(qū)域的特異性分布（Sakurai T,Amamiya A，Ishii M，et al. Orexins and orexin receptors:a family of hypothala mic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavioHj]. Cell，1998, 92(4) :573-585)說明 Orexin 與可能攝食行為有關。
[0004] Orexin A和Orexin B均是由prepro-orexin前體肽分泌，且能與G蛋白偶聯(lián)的 相關受體0X1R和0X2R結合，并激活0X1R和0X2R發(fā)揮生物作用。White等對大鼠下丘 腦吻側部注射OrexinA，發(fā)現(xiàn)攝食量顯著增加并呈劑量依賴性。在注射OrexinA之前禁 食時間分為：〇h、3h、12h和24h，并在注射前給予200ms / kg2-脫氧葡萄糖，結果發(fā)現(xiàn)攝 食量增加幅度同禁食時間長度呈正相關，攝食量同OrexinA注射劑量呈正相關。而且在 注射前使用2-脫氧葡萄糖導致了更強的攝食反應（White CL，Ishii Y，Mendoza T，Upton N，Stasi LP, Bray GA，York DA. Effe-ct of a selective 0X1R an-tagonist on food intake and body weight in two strains of rats that differ in susceptibility to dietary-induced obesity[J].Peptides，2005,26(11):2331_2338)。 Novak等在大 鼠外側下丘腦頭背部注射prepro-orexin前體肽后，發(fā)現(xiàn)大鼠攝食量增加，體力活動變 得更加頻繁，體溫上升，從而能量消耗增加，血糖水平升高（Novak CM. Levine JA. Daily intraparaventrieular orexin-A treatment induces weight loss in rats [J]. Obesity(Silver Spring)，2009. 17(8):1493-1498.)。同時，Orexin 表達量的升高能促進 胃酸分泌，提高動物機體采食量，而豬下丘腦腹內側核（VMH)是參與Orexin刺激胃酸分泌 的區(qū)域之一 (Eliassi A, Nazari M, Naghdi Ν. Role of the ventromedial hypothalamic orexin-lreceptors in regulation of gastric acid secretion in conscious rats[J]· J Neuroendocrin ol, 2009, 21 (3) :177-182.)。以上研究說明 了增加 Orexin基因的表達量， 能促進動物提高采食量。
[0005] 除了 Orexin外，下丘腦還產生如促生長激素神經(jīng)肽（Gal)、神經(jīng)肽Y (NPY)、黑色 素聚集激素（MCH)、黑皮質素受體-4 (MC4R)、刺鼠相關肽（AgRP)、瘦素（1印tin)、饑餓素 (Ghrelin)、瘦素（Leptin)、神經(jīng)肽B(NPB)、胰島素（Insulin)等能調節(jié)畜禽采食行為的因 子。下丘腦中的Orexin同NPY免疫陽性纖維相互支配，同時Orexin能通過促進NPY神經(jīng)元 活動增加采食量。Qi等發(fā)現(xiàn)在下丘腦中，Leptin能夠直接抑制Orexin表達，以上實驗表明 Orexin可以通過與其他激素互作調節(jié)動物個體的采食行為（Qi Y, Henry B. A, Oldfield, B. J. Clarke I. J. The action of leptin on appetite-regulating cells in the ovine hypothalamus:Demonstration of direct action in the absence of the arcuate nucleus[J]· Endocrinology, 2010, 151(5) :2106-2116)。
[0006] 剩余米食量（residual feed intake，RFI)是由 Koch 首次提出（Koch RM, Swiger LA,Chambers D,Gregory KE.Efficiency of feed use in beef cattle[J]. Anim Sci，1963,22:486-494)。是畜禽實際采食量與根據(jù)其自身狀況維持增重和生長所預測采 食量的差值（RFI=實際采食量-預測采食量)。剩余采食量是反映飼料轉化效率的可遺 傳性狀，獨立于生產水平、體格大小等性狀，考慮了動物的平均日增重和校正了個體的代 謝體重，被認為是測定飼料轉化效率的主要參考方法。研究表明飼料轉化效率高的動物 剩余米食量低或者為負值（Archer JA, Richardson EC, Herd RM, Arthur PF. Potential for selection to improve effciency of feed use in beef cattle:A review[J]. Australian Journal of Agriculture Research, 1999, 50(2):147-162)。
[0007] Boddicker通過隨機選擇40頭生長性能接近的約克夏豬為低RFI組、對照組，限 制飼喂飼料6周，比較兩組的生長性能、采食量和胴體組成。結果與對照組相比，低RFI組 消耗飼料比計劃所用飼料少7. 6%，且兩組的生長性能、胴體組成無明顯差異。表明在生產 實踐中，低RFI可降低畜禽采食量和提高飼料轉化效率，降低養(yǎng)殖成本且對畜禽的生產性 會泛無顯著影口向（Boddicker NJ. The effects of ad libitum and restricted feeding on Yorkshire pigs selected for reduced residual feed intake[J]. Graduate Theses and Dissertations, 2010:11760)。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記，該分子 標記為包含一個SNP位點，位于核苷酸序列SEQ ID NO. 1上，SEQ ID N0 :1的第516bp處有 一個G516-A516的堿基突變，導致Alu I -RFLP多態(tài)性。這個堿基突變位于Orexin基因第 1內含子中，不改變其翻譯的氨基酸序列。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種基于與豬飼料轉化效率性狀的分子標記 的檢測方法，該方法具有檢測準確、快速及成本較低等優(yōu)點。
[0010] 本發(fā)明還有一個目的在于提供了一種擴增與豬飼料轉化效率性狀的分子標記的 引物對，其序列為SEQ ID N0. 6和SEQ ID. 7所示，引物擴增出的DNA序列如SEQ ID N0. 3 所示。
[0011] 本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種與豬飼料轉化效率性狀的分子標記在豬 飼料轉化效率性狀相關分子標記輔助育種中的應用，該應用研究了與豬飼料轉化效率性狀 相關的基因，發(fā)現(xiàn)了一個與飼料轉化效率性狀相關的多態(tài)位點。
[0012] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施：
[0013] 一種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記的獲得：
[0014] (-）豬Orexin基因的引物設計與部分DNA序列擴增
[0015] 用豬Orexin基因序列信息（GenBank收錄號：NC_010454. 3)作為引物設計的模板 序列，利用生物學引物設計軟件01ig〇7.0設計引物，引物序列如下：
[0016] Orexin 正向引物：CATGTATCAGAGGCTATTTGCACOrexin 反向引物： ACCTGAAAACGGGCATGTCT。
[0017] (2)PCR 擴增反應：
[0018] 利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(購自美國invitrogen公司）從純種美系 大白閹割豬實驗群體(該群體來源于湖北金林育種場，）（屠宰測定與采樣分成21個批次進 行，測定個體數(shù)量共計236頭，全部為美系純種大白閹割公豬)耳組織中提取基因組DNA，具 體操作方法參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書進行。
[0019] PCR反應：反應總體積為30μ 1，其中豬DNA模板3. 0μ 1，PCRmixl5y 1，正向引物 和反向引物各0.6ηπι〇1/μ 1，最后加去離子水至總體積30μ KPCR反應條件為：95°C預變性 511^11后，循環(huán)30次951：變性3〇8、581：退火3〇8、721：延伸4〇8，最后721：延伸51^11。？0?產 物經(jīng)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了部分Orexin片段，長度為282bp，其序列為SEQ ID N0. 2 所示。
[0020] (3)PCR產物的純化、測序
[0021] PCR產物的純化：在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放 入1. 5ml離心管中，然后用PCR產物純化試劑盒(購自北京百泰克公司）純化PCR產物。將 純化后的DNA溶液送至上海英駿公司正反向測序。
[0022] 用引物擴增豬基因組DNA得到了 282bp特異性擴增片段，如圖2所示，正反向測序 結果發(fā)現(xiàn)該片段所在的Orexin基因 （SEQ ID NO. 1所示)的第516位發(fā)現(xiàn)一個G-A轉換(如 圖3所示),造成一個Alu I酶切位點ACiTT,，=
[0023] -種基于與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記的檢測方法，其步驟如下：
[0024] (1)引物序列
[0025] Orexin 的 SNP 分型引物：正向引物：5' TCATCTCATTTCCCCCTCCCAGC3'
[0026] 反向引物：5' GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTATTTAGC3'
[0027] 該引物擴增片段長度215bp，其序列為SEQ ID N0. 3所示。
[0028] (2)PCR擴增條件
[0029] PCR反應總體積10μ 1，其中豬基因組DNA模板1μ 1，正反向引物各0. 2ηπιο1/μ 1， PCR η?χ5μ 1，最后加入去離子水至總體積10μ 1。PCR反應條件為：95°C預變性5min后，循 環(huán)30次951：變性3〇8、581：退火3〇8、721：延伸4〇8 ;最后721：延伸51^11。？0?產物經(jīng)2% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0030] (3)RFLP 檢測
[0031] PCR產物酶切反應體積是10 μ 1，其中PCR產物5 μ 1，去離子水3. 5 μ 1， lOXbufferly 1，限制性內切酶Alu I為0. 5μ 1(1〇υ/μ 1)，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng) 箱放置12h，用3. 5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
[0032] 酶切產生三種基因型，GG基因型只有215bp -條帶，AA基因型有179bp和36bp兩 條帶，雜合子GA基因型有215bp、179bp和36bp三條帶(其中36bp目的帶太小未出現(xiàn))。一 種與豬飼料轉化效率性狀的分子標記在豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記輔助育種中 的應用，其步驟是：
[0033] 采集樣品的平均日增重、采食量、預測采食量、剩余采食量、飼料轉化率及肌內脂 肪6項指標。根據(jù)采集樣品的群體結構，運用混合模型來統(tǒng)計分析Orexin基因 SNP位點的 基因型效應及其與飼料轉化效率性狀的關系：
[0034] Yf μ +genotypei+ ε u+G
[0035] 其中，為處理后性狀值，μ為總體均值，ε ij為隨機誤差，G為批次效應，假定服 從N(0,〇2)分布。即可分析出基因型效應，完成基因型效應的多重性比較。采用SPSS16. 0 軟件(AsiaAnalytics China)進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。
[0036] 統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)該基因的A>G突變基因型，與平均日增重極顯著相關（P=0. 009)，與 米食量極顯著的相關（P = 〇. 0007)，與預測米食量呈顯著相關（P = 〇. 016)，與剩余米食量 顯著相關（P = 〇. 027)。通過最小二乘均數(shù)對基因型為AA、GG、AG的個體進行兩兩比較，結 果表明GG、GA基因型平均日增重、日采食量、預測采食量、剩余采食量高于AA型基因型個 體。
[0037] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0038] 本發(fā)明利用現(xiàn)有的PCR-RFLP技術，在Orexin基因第516bp處發(fā)現(xiàn)一個G/A突變， 且發(fā)現(xiàn)此多態(tài)位點與平均日增重、采食量、剩余采食量等飼料轉化效率性狀顯著相關，促進 了對豬飼料轉化效率的研究進展。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1為一種本發(fā)明技術流程圖。
[0040] 圖2為一種豬Orexin基因基因組擴增電泳結果不意圖。
[0041 ] M ：DL2000分子量標記；
[0042] 圖3為一種本發(fā)明中豬Orexin基因測序發(fā)現(xiàn)的G > A突變。
[0043] 圖4為一種豬Orexin基因外顯子的Alu I -RFLP的三種基因型（GG GA AA)電泳 結果示意圖。
[0044] M :50bpDNA 分子量標記；P :PCR 產物。

【具體實施方式】
[0045] 實施例1 :
[0046] -種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記的獲得：
[0047] (-）豬Orexin基因的引物設計與部分DNA序列擴增
[0048] 用豬 Orexin 基因序列信息（NCBI :ID :397305, GenBank 收錄號：NC_010454. 3)作 為引物設計的模板序列，利用生物學引物設計軟件01ig〇7. 0設計引物，引物序列如下：
[0049] Orexin正向引物：CATGTATCAGAGGCTATTTGCAC (該引物對用來尋找Orexin基因的 多態(tài)位點）
[0050] Orexin 反向引物：ACCTGAAAACGGGCATGTCT。
[0051] (2)PCR 擴增反應：
[0052] 利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(購自美國invitrogen公司）從純種美系 大白閹割豬實驗群體(該群體來源于湖北金林育種場）（屠宰測定與采樣分成21個批次進 行，測定個體數(shù)量共計236頭，全部為美系純種大白閹割公豬)耳組織中提取基因組DNA，具 體操作方法參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書進行。
[0053] PCR反應：反應總體積為30μ 1，其中豬DNA模板3. 0μ 1，PCRmixl5y 1，正向引物 和反向引物各0.6ηπι〇1/μ 1，加入去離子水至總體積30μ 1。PCR反應條件為：95°C預變性 5min 后，循環(huán) 30 次 95°C變性 30s、58°C退火 30s、72°C延伸 40s，最后 72°C 延伸 5min。PCR 產物經(jīng)1 (W/V) %瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了部分Orexin片段，長度為282bp，其序列為 SEQID N0. 2 所示。
[0054] (3)PCR產物的純化、測序
[0055] PCR產物的純化：在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放 入1. 5ml離心管中，然后用PCR產物純化試劑盒(購自北京百泰克公司）純化PCR產物，按 照試劑盒說明書操作，具體步驟是按照l〇〇mg膠塊加入400 μ 1 GS Buffer的比例加入GS Buffer，置50°C溫育10min，使瓊脂糖膠塊完全溶化，每兩分鐘顛倒混勻一次；將溶化的膠 液轉入到離心吸附柱，并將離心吸附柱置于廢液收集管中，l〇〇〇〇rpm離心30s，棄去廢液； 將離心吸附柱置回廢液收集管中，加入500 μ 1 Wash Buffer于離心吸附柱中，lOOOOrpm離 心30s，棄濾液。以同樣的方法再用500 μ 1 Wash Buffer溶液洗滌一次；將離心吸附柱置 會廢液收集管中，最高速度離心lmin ;小心取出離心吸附柱，將其套入一個無菌的1. 5ml離 心管中，在吸附膜中央加入30μ 1雙蒸水，室溫靜置2-10min后，最高速度離心lmin ;取出 離心吸附柱，將1. 5ml離心管（DNA溶液）置于-20°C保存?zhèn)溆谩⒓兓蟮腄NA溶液送至 上海英駿公司正反向測序。
[0056] 用引物擴增豬基因組DNA得到了 282bp特異性擴增片段，如圖2所示，正反向測序 結果發(fā)現(xiàn)該片段所在的Orexin基因 （SEQ ID NO. 1所示)的第516位發(fā)現(xiàn)一個G-A轉換(如 圖3所示)，造成一個Alu I酶切位點(AG'CH ?
[0057] 實施例2 :
[0058] -種基于與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記的檢測方法，其步驟如下：
[0059] PCR-RFLP診斷方法建立
[0060] (1)引物序列
[0061] Orexin 的 SNP 分型引物：正向引物：5' TCATCTCATTTCCCCCTCCCAGC3'
[0062] 反向引物：5, GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTATTTAGC3'
[0063] 該引物擴增片段長度215bp，其序列為SEQ ID NO. 3所示。
[0064] (2)PCR擴增條件
[0065] PCR反應總體積10μ 1，其中豬基因組DNA模板1μ 1，正反向引物各0. 2ηπιο1/μ 1， PCRmix5 μ 1，最后加入去離子水至總體積10 μ 1。PCR反應條件為：95°C預變性5min后，循 環(huán)30次951：變性3〇8、581：退火3〇8、721：延伸4〇8 ;最后721：延伸51^11。？0?產物經(jīng)2% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0066] (3)RFLP 檢測
[0067] PCR產物酶切反應體積是10 μ 1，其中PCR產物5 μ 1，去離子水3. 5 μ 1， lOXbufferly 1，限制性內切酶Alu I為0. 5μ 1(1〇υ/μ 1)，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng) 箱放置12h，用3. 5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
[0068] 酶切產生三種基因型，GG基因型只有215bp -條帶，AA基因型有179bp和36bp兩 條帶，雜合子GA基因型有215bp、179bp和36bp三條帶(其中36bp目的帶太小未出現(xiàn))，如 圖4所示。
[0069] 實施例3 :
[0070] -種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記在不同豬群體多態(tài)性檢測中的應用， 其步驟是：
[0071] 利用PCR-Alu I -RFLP檢測了純種美系大白閹割豬實驗群體(該群體來源于湖北 金林育種場）（236個美系純種大白閹割公豬群體)。該突變位點在實驗群體中的基因型和 基因頻率如表1所示，檢測結果顯示，Orexin基因在實驗群體中存在三種基因型，其中AA型 個體有18頭，GA型個體有85頭，GG型個體有133頭，酶切分型的檢測結果與測序結果相 符，本發(fā)明的檢測方法可靠。此結果表明Orexin基因在純種美系大白閹割豬實驗群體中 等位基因 G占優(yōu)勢。
[0072] 實施例4 :
[0073] -種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記與飼料轉化效率性狀的關聯(lián)分析
[0074] 本實施例的豬群來自本湖北金林育種場純種美系大白閹割豬，屠宰測定與采樣分 成21個批次進行，測定個體數(shù)量共計236頭，全部為美系純種大白閹割公豬。
[0075] 所分析的性狀主要是與飼料轉化效率性狀相關的性狀，包括：平均日增重、采食 量、預測采食量、剩余采食量、飼料轉化率及肌內脂肪6項指標。根據(jù)采集樣品的群體結構， 申請人:運用混合模型來統(tǒng)計分析Orexin基因 SNP位點的基因型效應及其與飼料轉化效率 性狀的關系：
[0076] Yij=μ +genotypei+ ε u+G
[0077] 其中，Yij為處理后性狀值，μ為總體均值，ε ij為隨機誤差，G為批次效應，假 定服從N(0, 〇2)分布。即可分析出基因型效應，完成基因型效應的多重性比較。采用 SPSS16. 0軟件(軟件來自于AsiaAnalytics China)進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。
[0078] 對豬Orexin基因 Alu I -RFLP多態(tài)性位點與部分飼料轉化效率性狀進行關聯(lián)分 析，由表1知：在236個個體中GG基因型有133個，GA基因型有85個，AA基因型有18個。
[0079] 本實施例采用SPSS16. 0軟件中的廣義線性模型對豬Orexin基因的A>G突變位點 的多態(tài)在美系大白閹割豬群體中對飼料轉化效率性狀進行了初步的關聯(lián)分析。初步分析結 果見表1。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)該基因的A>G突變基因型，與平均日增重極顯著相關（P=0. 009)， 與米食量極顯著的相關（P = 〇. 0007)，與預測米食量呈顯著相關（P = 〇. 016)，與剩余米食 量顯著相關（P = 0. 027)。通過最小二乘均數(shù)對基因型為AA、GG、AG的個體進行兩兩比較， 結果表明GG、GA基因型平均日增重、日采食量、預測采食量、剩余采食量高于AA型基因型個 體。
[0080] 表lOrexin基因多態(tài)性位點基因型與飼料轉化效率性狀的關聯(lián)分析檢測
[0081]

【權利要求】
1. 一種與豬飼料轉化效率性狀相關的分子標記，含有SNP位點，其特征在于，所述的 SNP位點位于SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列中，SEQ ID N0:1的第516 bp處有一個 G516-A516的堿基突變。
2. 權利要求1所述的分子標記，其特征在于，分子標記的引物序列為：正向引物：5' TCATCTCAITTCCCCCTCCCAGC 3' ；反向引物：5'GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTAITTAGC 3,。
3. -種基于權利要求1所述的分子標記的檢測方法，其特征在于，其步驟是： (1) 引物序列 Orexin 的 SNP 分型引物：正向引物：5' TCATCTCAITTCCCCCTCCCAGC 3' 反向引物：5' GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTAITTAGC 3' (2) PCR擴增條件 PCR反應總體積10μ 1，其中豬基因組DNA模板1μ 1，正反向引物各0. 2ηπι〇1/μ 1， PCRmix 5 μ 1，最后加入去離子水至總體積10 μ 1 ;PCR反應條件為：95°C預變性5min后，循 環(huán)30次951：變性3〇8、581：退火3〇8、721：延伸4〇8 ;最后721：延伸51^11屮0?產物經(jīng)2% W/V瓊脂糖凝膠電泳檢測； (3) RFLP 檢測 PCR產物酶切反應體積是10μ 1，其中PCR產物5μ 1，去離子水3. 5μ l，10Xbuffer Ιμ?，限制性內切酶Μ? I為0.5μ1 (lOU/μΙ)，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置 12h，用3. 5%W/V瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照； 酶切產生三種基因型，GG基因型只有215bp -條帶，AA基因型有179bp和36bp兩條 帶，雜合子GA基因型有215bp、179bp和36bp三條帶，其中36bp目的帶不出現(xiàn)。
4. 權利要求1所述的分子標記在豬飼料轉化效率性狀相關分子標記輔助育種中的應 用。
5. 權利要求2所述的分子標記的引物序列在豬飼料轉化效率性狀相關分子標記輔助 育種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104250646SQ201310260434
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月27日 優(yōu)先權日:2013年6月27日
【發(fā)明者】李長春, 成宏, 趙書紅, 李新云, 朱猛進, 經(jīng)璐 申請人:華中農業(yè)大學