河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明是一種用于河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測試劑盒，其組成為：反應液A，1支，其組成為：10×Lampbuffer，dNTP，硫酸鎂水溶液，甜菜堿水溶液，引物Vaes-F3、Vaes-B3、Vaes-FIP、Vaes-BIP，BstDNA酶，10×熒光染料SYBRGreenⅠ，陽性對照試樣，陰性對照試樣和超純水。本發明還涉及應用該試劑盒進行檢測的方法。本發明試劑盒具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低、操作方法更簡單，適于水產養殖場現場快速檢測。本發明方法解決了現有技術時間長、工作量大、交叉污染、操作復雜、需要復雜儀器等缺陷，為水產動物疾病檢測提供了新的技術平臺，能較好滿足目前對河口弧菌引起的疾病的現場檢測的迫切需要。
【專利說明】河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種水生動物病原河口弧菌的檢測試劑盒，特別是一種用于河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測試劑盒；本發明還涉及一種應用前述試劑盒進行檢測的方法。
【背景技術】
[0002]河口弧菌(yibrio是由Tison等于1983年從海水、牡販、蛤及蟹中首次分離并命名，該菌一直被認為是環境菌株，直到2006年Labreuche等將該菌活細胞和胞外產物注射牡蠣，揭示了其病原性。有記述該菌存在于波羅的海、西班牙及香港等多地海岸。2008年Garnier等報道該菌可引起太平洋牡販Crassostrea gigas感染發病并造成大量死亡。2010年張曉君等對連云港市某半滑舌鰨養殖場所發生的細菌性疾病進行檢驗，病魚主要癥狀為體表及鰭基出血，胃腸道出血，尾鰭腐爛，有腹水，個別病魚腸道有白濁物，個別病魚腸管脫出肛門外，發病池累積死亡率達到50%，經病原細菌學檢驗表明為河口弧菌感染。可見河口弧菌能夠引起半滑舌鰨等海水養殖魚類及牡蠣等貝類感染發病，制約了水產養殖業的發展。該菌傳統的檢驗方法包括形態學檢測、生理生化特征檢測等，這些檢測手段不僅工作量大，而且耗時長，不能滿足水產養殖生產上的診斷要求。[0003]溶血素(hemolysin)是多數病原菌的重要致病因子之一，其分解破壞宿主組織成分，以利于病原菌進一步侵襲，破壞血細胞，導致溶血。目前已在殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌及河口弧菌等多種病原菌的胞外產物中檢測到。編碼溶血素的基因序列具有保守性和變異性，具設計PCR引物的保守區域，是種間鑒定及檢測的良好分子祀標。環介導恒溫擴增技術(LAMP, loop-mediated isothermalamplification)是2000年由Notomi等發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法,它具有很高的特異性和靈敏度，且反應在恒溫下進行，快速簡便，擴增產物量大，肉眼、電泳、濁度儀均可進行檢測，不需昂貴的儀器。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供了一種新的用于河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測試劑盒，其靈敏度高、特異性強、操作簡便，在水產養殖動物處于帶菌狀態或大規模爆發河口弧菌引起的細菌性疾病之前能進行準確的檢測。
[0005]本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種應用前述試劑盒進行檢測的方法。
[0006]本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種用于河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測試劑盒，其特點是，其組成為:
(I)反應液A，I支，其體積百分比組成為:
①10XLampbuffer，14.9% ;其中 Lampbuffer 的組成為:200mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM (NH4) 2S04,20mM MgSO4，質量濃度 1% 的 Trition X-100，Lampbuffer 的 pH 為 8.8 ；
②dNTP, 13.5%，濃度為 IOmM ；
③硫酸鎂水溶液，22%，濃度為25mM；④甜菜堿水溶液，22%，濃度為8mol/L；
⑤Vaes-F3，2.8%,濃度為 IOuM,
上游外部引物 Vaes-F3 為:GACC CAGC AACA GATT GG ；
⑥Vaes-B3，2.8%,濃度為 10uM，
下游外部引物 Vaes-B3 為:TCGT TAGT CCAG ATCG AATG ；
⑦Vaes-FIP，11%，濃度為 10uM，
上游內部引物 Vaes-FIP 為:ACAG ACGA CCAC CAGT AACC-GTGG GCAT TGGA TGAA CA;
⑧Vaes-BIP，11%，濃度為 IOuM,
下游內部引物 vh-BIP 為:ACAG CGTT GTGA AGAG ACAC T-CCTA TTGT CTGC TGCG AA;
(2)反應液B:8000U 的 Bst DNA 酶，I 支；
(3)反應液C:10X熒光染料SYBR Green I，1支；
(4)河口弧菌基因組DNA的陽性對照試樣，I支；
(5)健康魚組織總DNA的陰性對照試樣，I支；
(6)超純水，I支。
[0007]本發明還提供了一種河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測方法，其特點是，該方法應用了以上技術方案所述的試劑盒；其步驟如下:
(1)DNA抽提:取ImL待檢樣品增菌液12000 r/min離心Imin,棄上清,將菌體懸浮于100 V- L的滅菌蒸懼水中，100°C煮沸IOmin,冰浴中冷卻后12000 r/min離心IOmin,取上清作為PCR模板DNA ；
(2)LAMP擴增:向反應管中加入反應液A18iiL，超純水5 yL，模板DNA lyL，95°C水浴5min，冷卻；再加入反應液B I yL;63°C孵育60 min，80°C滅活10 min;同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照采用健康魚組織總DNA的陰性對照試樣，陽性對照采用河口弧菌基因組DNA的陽性對照試樣；
(3)顯色檢測:再向反應管中加入反應液CIuL;觀察顯色結果，顯綠色的為河口弧菌陽性，顯粉色的為河口弧菌陰性。
[0008]本發明所涉及的病原河口弧菌(K/Ario aestuarianus ) TSl已經在公開文獻((Molecular and phenotypic characterization of Vibrio aestuarianus, a pathogenof the cultured tongue sole, Cynoglossus semilaevis Gunther〉〉中所公開(菌株TSl),上述公開文獻發表于《Journal of Fish Diseases》，2011, 34:57_64。菌株TSl的DNA序列長度及Genebank登錄號見下表:
【權利要求】
1.一種用于河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒的組成為: (1)反應液A，I支，其體積百分比組成為: ①10XLampbuffer，14.9% ;其中 Lampbuffer 的組成為:200mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM (NH4) 2S04,20mM MgSO4，質量濃度 1% 的 Trition X-100，Lampbuffer 的 pH 為 8.8 ；
②dNTP, 13.5%，濃度為 IOmM ； ③硫酸鎂水溶液，22%，濃度為25mM； ④甜菜堿水溶液，22%，濃度為8mol/L； ⑤Vaes-F3，2.8%,濃度為 10uM， 上游外部引物 Vaes-F3 為:GACC CAGC AACA GATT GG ；
⑥Vaes-B3，2.8%,濃度為 10uM， 下游外部引物 Vaes-B3 為:TCGT TAGT CCAG ATCG AATG ； ⑦Vaes-FIP，11%，濃度為 10uM， 上游內部引物 Vaes-FIP 為:ACAG ACGA CCAC CAGT AACC-GTGG GCAT TGGA TGAA CA; ⑧Vaes-BIP，11%，濃度為 IOuM, 下游內部引物Vaes-BIP為:ACAG CGTT GTGA AGAG ACAC T-CCTA TTGT CTGC TGCG AA; (2)反應液B:8000U 的 Bst DNA 酶，I 支； (3)反應液C:10X熒光染料SYBR Green I，I支； (4)河口弧菌基因組DNA的陽性對照試樣，I支； (5)健康魚組織總DNA的陰性對照試樣，I支； (6)超純水，I支。
2.一種河口弧菌的環介導恒溫擴增快速檢測方法，其特征在于，應用權利要求1所述的試劑盒；其步驟如下: (1)DNA抽提:取ImL待檢樣品增菌液12000 r/min離心Imin,棄上清,將菌體懸浮于.100 V- L的滅菌蒸懼水中，100°C煮沸IOmin,冰浴中冷卻后12000 r/min離心IOmin,取上清作為PCR模板DNA ； (2)LAMP擴增:向反應管中加入反應液A18iiL，超純水5 yL，模板DNA lyL，95°C水浴5min，冷卻；再加入反應液B I u L ;63°C孵育60 min，80°C滅活10 min ;同時進行陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照采用健康魚組織總DNA的陰性對照試樣，陽性對照采用河口弧菌基因組DNA的陽性對照試樣； (3)顯色檢測:再向反應管中加入反應液CI y L ;觀察顯色結果，顯綠色的為河口弧菌陽性，顯粉色的為河口弧菌陰性。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614455SQ201310276906
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年7月3日 優先權日:2013年7月3日
【發明者】張曉君, 徐加濤, 閻斌倫, 秦國民 申請人:淮海工學院