人原代肝細胞與肝非實質細胞共培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種人原代肝細胞與肝非實質細胞共培養方法，該方法是將新鮮的肝組織經暴露的血管用灌注溶液I和灌注溶液II沖洗干凈；直至肝組織失去彈性消化完全；然后置于含有細胞洗液的培養皿中，篩選得到單細胞懸液；低密度接種到膠原包被的培養板或培養皿中培養，首先在生長因子的作用下形成100%融合度的單層共培養；最后置于加入含有2%DMSO的維持培養液培養；肝細胞堆積形成肝非實質細胞環繞、入侵生長的肝島狀結構。本發明利用常規的肝細胞分離技術，實現了長達120天的肝細胞體外長期培養與長達72天保持HBV易感性。并且該系統可發展為新的抗HBV藥物篩選與評價平臺，對抗病毒藥物研究具有重要價值。
【專利說明】人原代肝細胞與肝非實質細胞共培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞的培養方法，具體涉及一種簡易的、能長期維持人原代肝細胞特性與HBV易感性的肝細胞與肝非實質細胞共培養方法。
【背景技術】
[0002]肝臟細胞在功能分類上可分為肝實質細胞與肝非實質細胞，肝實質細胞即為肝細胞，履行肝臟大部分功能如消化功能、能量代謝、解毒等；而肝非實質細胞包括肝星形細胞，竇狀內皮細胞，肝上皮細胞，KupfTer細胞等，主要行使輔助肝細胞、肝臟免疫與肝臟結構支持等功能。目前為止，傳統的共培養方法是將純的原代肝細胞與純的肝非實質細胞按一定比例混合培養，在共培養過程中，肝細胞與肝非實質細胞恢復了部分細胞與細胞之間的自然通訊，因此，原代肝細胞的形態特征和生理功能可以得到最大限度的維持。然而，這種傳統的共培養系統有嚴重缺點，例如有限的細胞壽命、復雜繁瑣的純化步驟及至關重要的共培養細胞比例難以掌握。因此，急需開發一種在體外能使肝細胞分化特性得以長期維持的便捷的方法。利用原代肝細胞與肝非實質細胞混合物經低密度鋪板的共培養方法，可以形成肝細胞堆積的，肝非實質細胞環繞、入侵生長的島狀結構，該方法相對簡單易行，不需要繁瑣的肝細胞與非實質細胞純化過程，極大地延長了原代肝細胞的分化特性維持時間，最長維持時間長達120天。
[0003]乙肝病毒(英文縮寫為HBV)感染是一種常見病，中國約有1.7億的乙肝攜帶者，每年死于相關疾病的病人約一百萬。由于長期缺乏合適的抗HBV藥物篩選與評價平臺，HBV的治療策略與方法相對滯后。用于抗HBV藥物篩選與評價的細胞模型長期局限于肝癌細胞系如H印G2、H印G2.2.15、Huh7等等。由于這些細胞系去分化嚴重，與體內肝細胞相比在分化狀態上相差甚遠，所以在篩選與評價抗HBV藥物時不能反映藥物真實的抗病毒效果與細胞毒作用。更糟糕的是這些細胞系不支持HBV感染，不能用于抗HBV感染性藥物如小肽、抗體等研究。人原代肝細胞是H BV研究最為理想的細胞感染模型，大量的研究表明原代肝細胞能被HBV感染，但其在體外培養時很快失去分化特性，HBV的易感性通常也在I周內完全丟失，這嚴重制約了對HBV感染機制研究、藥物篩選與評價的細胞模型的建立。本發明專利所述方法，通過人原代肝細胞與肝非實質細胞的共培養，原代肝細胞的肝細胞特性如形態特征、白蛋白的表達得以長期維持，對HBV的易感性維持可達72天，極大地提升了人原代肝細胞用于抗HBV藥物篩選與評價的應用價值。
[0004]大量的研究表明，肝細胞移植對肝功能衰竭病人的治療效果卓著，可以極大緩解病人對供肝的需求，是一種很有應用前景的治療策略。由于肝細胞體外培養相對落后，實現肝細胞的體外擴增及肝細胞分化特性的長期維持仍然是擺在醫療工作者面前的難題。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題就是提供一種人原代肝細胞與肝非實質細胞共培養方法，在體外人原代肝細胞與肝非實質細胞混合物，經低密度鋪板與經培養形成了肝細胞堆積的，肝非實質細胞環繞、入侵生長的肝島狀結構，實現了長達120天的肝細胞體外長期培養與長達72天保持HBV易感性。
[0006]為解決上述技術問題，本發明一種人原代肝細胞與肝非實質細胞共培養方法，包括以下步驟:
[0007]I)新鮮的肝組織經暴露的血管用灌注溶液I灌注約30分鐘，直至肝組織中血液被沖洗干凈；
[0008]2)用37°C預熱的灌注溶液II灌注步驟I)中沖洗干凈的肝組織，直至肝組織失去彈性消化完全；
[0009]3)將步驟2)消化完全的肝組織轉移至含有細胞洗液的培養皿中，小心抖落消化好的細胞，形成細胞懸液；
[0010]4)將步驟3)中細胞懸液通過70 μ m的細胞篩，得到單細胞懸液；
[0011]5)將步驟4)獲得的單細胞懸液在50Xg和4°C條件下，離心5分鐘沉降肝細胞與肝非實質細胞，用上述細胞洗液重懸，重復離心三次，然后利用鋪板培養液重懸細胞；
[0012]6)利用臺酚藍染色法計算步驟5)中重懸細胞的細胞密度與細胞活力；
[0013]7)將步驟6)中單細胞懸液以< 8X IO4活細胞/cm2的細胞密度接種到膠原包被的培養板或培養皿中，膠原包被的目的是促進細胞貼壁與肝細胞特性的維持，加入鋪板培養液，搖勻，在37°C、5% CO2培養箱中培養以充分讓其貼壁；經4至6小時后，加入生長培養液培養，3至4天換I次生長培養液；
[0014]8)培養28至35天，加入含有2%DMS0的維持培養液，3至4天換I次維持培養液；
[0015]9)培養30至40天，肝細胞堆積形成肝非實質細胞環繞、入侵生長的肝島狀結構；
[0016]其中，所述灌注溶液I為具體配方為:8.00g/l氯化鈉、0.40g/l氯化鉀、3.57g/l羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氫二鈉、0.06g/l磷酸二氫鉀、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸納、2mM乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸，調pH至7.4 ;
[0017]所述灌注溶液II的具體配方為:8.00g/l氯化鈉、0.40g/l氯化鉀、3.57g/l羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氫二鈉、0.06g/l磷酸二氫鉀、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸納、5mM氯化鈣、0.3g/l IV型膠原酶，調pH至7.4 ;
[0018]所述細胞洗液為:在商業化購買的DMEM培養液(購至美國GIBCO公司)使用前加入10% v/v胎牛血清，100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素；
[0019]所述鋪板培養液為:在商業化購買的William’ s E medium (簡稱WE,購至美國GIBCO公司)使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羥乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氫鈉，550mg/l丙酮酸鈉，0.2mM抗壞血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，10_7M地塞米松,ITS+premix,100units/ml 青霉素，100mg/ml 鏈霉素，5% v/v 胎牛血清；其中，ITS+premix 含有 6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亞油酸；
[0020]所述生長培養液為:在商業化購買的WE使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羥乙基哌嗪乙磺酸,17mM碳酸氫鈉,550mg/l丙酮酸鈉,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸,14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，20ng/ml表皮生長因子;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亞油酸；[0021]維持培養液為:在商業化購買的WE使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羥乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氫鈉,550mg/l丙酮酸鈉,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml 青霉素，100mg/ml 鏈霉素,2% v/v DMSO ;其中，ITS+premix 含有 6.25 μ g/ml 胰島素，6.25 μ g/ml 轉鐵蛋白，6.25ng/ml 亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亞油酸。
[0022]作為優選方案，所述步驟6)中，確定細胞密度與細胞活力的方法為:將細胞懸液與0.4% m/v臺酚藍染色液以1:1的體積比混勻，迅速將20μ1混合液加入到計數板中且將該計數板插入相應的計數儀中，儀器讀出相應的細胞密度與細胞活力，0.4%臺酚藍染色液具體配置方法為:0.4g臺酚藍固體完全溶解到100ml的磷酸緩沖液溶液中(英文縮寫為PBS)，具體配方為:8.0g/Ι氯化鈉，0.2g/l氯化鉀，3.58g/l十二水磷酸氫二鈉，0.24g/l磷酸二氫鉀，PH7.2至7.4，高壓蒸汽滅菌，4°C保持備用。
[0023]作為優選方案，所述膠原包被的培養板或培養皿的制備方法:將172 μ I冰醋酸加入到100ml去離子水中，再加入終濃度為50 μ g/ml的IV型鼠尾膠原，在無菌條件下，0.22 um濾膜過濾除菌后，4°C保持待用；將該工作液以5 μ g/cm2的包被量加入到需要包被處理的培養板或培養皿中，常溫孵育；1小時后，將膠原工作液吸出，自然晾干后封口 4°C保藏；用前，膠原包被的培養板或培養皿需用PBS清洗一次，以去除殘留的醋酸。
[0024]本發明的有益效果在于:
[0025]其一，本發明利用常規的肝細胞分離技術，分離到肝細胞與肝非實質細胞的混合物，以低密度的方式鋪板，經生長因子刺激，最后形成100%融合度的單層細胞培養，實現了人原代肝細胞與肝非實質細胞的體外擴增，有望發展為新的肝細胞移植的細胞來源；
[0026]其二，本發明相對于常規的共培養方法更簡便，不需要純化肝細胞與肝非實質細胞的封鎖操作；
[0027]其三，該共培養體系在 DMSO的誘導下，肝細胞堆積成肝非實質細胞環繞、入侵的肝島狀結構，島上的肝細胞可以長期維持原代肝細胞性狀，最長培養周期可達120天，克服了原代肝細胞壽命短的缺陷；
[0028]其四，本發明得到的島上的肝細胞在DMSO的維持下，HBV的易感性可以維持長達72天，這極大地克服了肝原代細胞對HBV的易感性在I周內丟失的缺陷，初步建立了新穎的抗HBV侵染藥物篩選與評價的體外細胞模型，該共培養方法為醫療用肝細胞來源的體外擴增與長期肝細胞特性維持提供了可能，并且該系統可發展為新的抗HBV藥物篩選與評價平臺，對抗病毒藥物研究具有重要價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為共培養肝細胞在不同培養時間點的形態學觀察；
[0030]圖2為肝島狀結構的形態學觀察與免疫熒光檢測；
[0031]圖3為HBV感染長期培養的肝細胞；
[0032]圖4為肝島狀結構形成與HBV成功感染模式圖。
【具體實施方式】
[0033]為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。
[0034]1.兩步膠原酶灌注法分離人原代肝細胞與肝非實質細胞:
[0035]兩步膠原酶灌注法第一步:新鮮的肝組織材料經暴露的血管用灌注溶液I灌注約30分鐘，直至肝組織中血液被沖洗干凈。灌注溶液I的具體配方為:8.00g/l氯化鈉、0.40g/I氯化鉀、3.57g/l羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氫二鈉、0.06g/l磷酸二氫鉀、Ig/I葡萄糖、ImM丙酮酸納、2mM乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸，調pH至7.4，用0.22 μ m微孔濾器過濾除菌，4°C儲存。
[0036]兩步膠原酶灌注法第二步:用37°C預熱的灌注溶液II灌注直至肝組織失去彈性。灌注溶液II的具體配方為:8.00g/l氯化鈉、0.40g/l氯化鉀、3.57g/l羥乙基哌嗪乙磺酸、
0.06g/l 二水磷酸氫二鈉、0.06g/l磷酸二氫鉀、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸納、5mM氯化鈣、
0.3g/l IV型膠原酶(購至美國Sigma公司),調pH至7.4,用0.22 μ m微孔濾器過濾除菌,4°C儲存。
[0037]將消化好的肝組織轉移到含有細胞洗液的培養皿中，小心抖落消化好的細胞，形成細胞懸液。細胞洗液為商業化購買的DMEM培養液(購至美國GIBCO公司)，使用前加入10%v/v胎牛血清(購至美國GIBCO公司)，100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素。再將該細胞懸液通過70 μ m的細胞篩，以獲得單細胞懸液。將單細胞懸液轉移至離心機中離心以沉降肝細胞與肝非實質細胞，離心條件為:50Xg，4°C，5分鐘。用細胞洗液重懸，重復以上離心三次。最后，利用鋪板培養液重懸細胞，再利用臺酚藍染色法計算細胞密度與細胞活力。重懸細胞的鋪板培養液為商業化購買的William’ s E medium (簡稱WE，購至美國GIBCO公司)，使用前加入IOmM尼克酰胺,20mM輕乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氫鈉，550mg/l丙酮酸鈉，0.2mM抗壞血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，IO^7M地塞米松，ITS+premix (含有6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，
5.35 μ g/ml亞油酸)，100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素,5% v/v胎牛血清(購至美國GIBCO 公司)。
[0038]2.細胞濃度與細胞活力的檢測:
[0039]將細胞懸液與0.4% m/g臺酚藍染色液以1:1的體積比混勻，迅速將20 μ I混合液加入到計數板中(購至美國Counterstar公司)且將該計數板插入相應的計數儀中，儀器讀出相應的細胞密度與細胞活力。0.4%臺酚藍染色液具體配置方法為0.4g臺酚藍固體溶解到100ml的磷酸緩沖液溶液中(英文縮寫為PBS，具體配方為:8.0g/Ι氯化鈉，0.2g/l氯化鉀，3.58g/l十二水磷酸氫二鈉，0.24g/l磷酸二氫鉀，pH7.2至7.4，高壓蒸汽滅菌，4°C保持備用)。
[0040]3.人原代肝細胞與肝非實質細胞混合物低密度鋪板與培養:
[0041]經方法(I)分離得到的單細胞懸液，以小于等于8X IO4的活細胞/cm 2的密度接種到膠原包被的培養板或培養皿中，加入適量鋪板培養液，搖勻，在37°C、5% CO2培養箱中培養以充分讓細胞貼壁。鋪板培養液為商業化購買的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM輕乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氫鈉,550mg/l丙酮酸鈉,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺，IO^7M地塞米松，ITS+premix (含有6.25 μ g/ml胰島素,6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亞油酸)，100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，5%v/v胎牛血清(購至美國GIBCO公司)。4至6小時后，將鋪板培養液吸出，加入新鮮生長培養液，每3至4天換I次新鮮培養液。生長培養液為商業化購買的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羥乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氫鈉，550mg/l丙酮酸鈉，0.2mM抗壞血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，IO^7M地塞米松，ITS+premix (含有6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，
5.35 μ g/ml亞油酸)，100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素,20ng/ml表皮生長因子(購至美國BD公司)。培養約一個月后，典型單層培養已經形成，加入含2% v/v DMSO的維持培養液，3至4天換一次新鮮培養液。維持培養液為商業化購買的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺,20mM輕乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氫鈉，550mg/l丙酮酸鈉,0.2mM抗壞血酸_2_磷酸，14mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺，10-7Μ地塞米松,ITS+premix(含有6.25 μ g/ml胰島素,6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亞油酸)，IOOunits/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素,2% v/v DMS0。培養約一個月后,肝細胞堆積形成肝非實質細胞環繞、入侵生長的肝島狀結構。該共培養系統一般還可培養長達兩個月。
[0042]檢測與分析
[0043]1.對該共培養系統進行肝細胞特性檢測:
[0044]—方面，用相差顯微鏡形態學觀察在不同培養時間點的肝細胞形態；另一方面，利用免疫熒光的方法鑒定白蛋白的表達。
[0045]白蛋白免疫熒光的具體方法是:以六孔板的一孔為例，細胞培養至兩個月時，吸去舊培養液，用常溫PBS洗一次,立即用冰冷的4%多聚甲醒Iml (具體配方為:稱取4g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入80ml去離子水，放入37°C恒溫水浴箱，每隔I至2小時搖晃混勻，16至24小時后多聚甲醛會完全溶解，補充去離子水至100ml，調節pH值至7.2)，常溫固定10至15分鐘；用PBS在水平搖床上洗3次，每次5分鐘；為增強抗體與細胞內蛋白的結合，使用Iml含0.25% v/v TritonlOO的PBS溶液常溫處理45分鐘；用PBS在水平搖床上洗3次，每次5分鐘；封閉，加入適量封閉液(含有5% v/v山羊正常血清，2% m/v BSA的PBS溶液)，常溫水平搖床孵育至少 I小時；利用含3% v/v山羊正常血清的PBS溶液稀釋抗體，白蛋白兔多抗(購至美國Proteintech公司)稀釋比例為1: 400,4°C搖床孵育過夜；再用含3%山羊正常血清的PBS溶液在水平搖床上洗3次，每次10分鐘，以去除非特異結合的抗體；二抗為山羊抗兔IgG偶聯DyLight-488 (購至美國Thermo Fisher Scientific Inc公司)，以1: 400稀釋到含3%山羊正常血清的PBS溶液，于暗處避光常溫孵育I小時，此后操作一律避光；再用含3%山羊正常血清的PBS溶液在水平搖床上洗2次，每次10分鐘，第三次清洗時加入1: 1000的DAPI (購至瑞士 Roche公司)用于細胞核染色，常溫孵育10分鐘；再清洗一次以清洗掉殘留的DAPI，10至20分鐘；加入適量含3%山羊正常血清的PBS溶液防止在觀察時細胞因干燥變形。最后，利用Leica DFC425C熒光顯微鏡(購至德國Leica公司)觀察突光信號。
[0046]結果分析
[0047]a.共培養肝細胞在不同培養時間點的形態學觀察分析:
[0048]利用上述兩步膠原酶灌注法分離得到的單細胞混合物包括大細胞(成熟肝細胞)、小細胞(未成熟肝細胞)、肝星形細胞、肝表皮細胞、竇狀內皮細胞等。為了避免原代細胞的接觸抑制性，該混合物以低密度(小于等于8X IO4活細胞/cm2)的方式鋪板，在生長培養基的培養下，這樣可以極大限度的刺激肝細胞和肝非實質細胞的快速增殖。如圖1 (A)所示，在第10天時肝細胞區(大箭頭)被非實質細胞環繞，肝細胞與肝非實質細胞接觸尚且不緊密，存在一定的非細胞區，此時細胞仍需繼續生長，肝細胞之間的膽小管結構清晰可見(小箭頭)，而環繞生長的主要是肝星形細胞(五角星);30天后(如B圖)，細胞緊密程度加深，特別是非實質細胞區，此時為生長培養的終點，繼續在生長培養基中培養對長期培養不利；此后，細胞在含2%DMSO的維持培養基中培養，第60天時，該共培養發生了顯著變化，肝細胞聚集凸起，膽小管結構消失，肝細胞與非實質細胞的界線高亮明顯，形成典型的肝島狀結構；接下來的培養，第80天(如D圖)，和第100天(如E圖)時，細胞狀態沒有明顯變化，從細胞形態上看肝細胞仍然維持真肝細胞分化狀態；但第120天(如F圖)，肝細胞狀態尚好，肝非實質細胞出現凋亡與老化現象，個別區域出現了集體死亡現象，我們把該時間點確定為共培養的終點。圖片標尺為100微米。
[0049]b.肝島狀結構的形態學觀察與免疫熒光檢測:
[0050]為了進一步了解肝島狀結構及肝細胞的狀態，首先利用相差顯微鏡在同一視野下觀察同一肝島狀結構，在不同的焦平面拍照，如圖2 (A，B, C)所示，肝細胞堆積成簇生長，在水平面上肝細胞高于非實質細胞生長；為了進一步弄清肝非實質細胞是否入侵到肝島底層生長及肝島上的肝細胞是否具有肝細胞特性，我們利用免疫熒光的方法檢測了肝細胞的白蛋白表達及肝細胞核是否與非實質細胞重疊，如圖2(D:綠色，白蛋白；E:藍色，細胞核；F:同一視野下白蛋白與細胞核重疊圖)，肝島上的肝細胞表達白蛋白，說明該肝細胞尚未丟失肝細胞特性，再者肝細胞與肝非實質細胞的細胞核部分重疊，說明肝非實質細胞入侵到肝細胞的底層，形成一種類似細胞生物學上的飼養層結構。這種結構是肝細胞得以長期維持培養的關鍵所在。圖片標尺為100 μ m。
[0051]2.HBV感染長期培養的肝細胞:
[0052]鋪板后42天到72天，進行了 HBV易感性調查。感染液的配置方法為:WE中加入2%v/v DMS0、4% m/v (質量體積比)聚乙二醇8000、10% v/v高病毒滴度的病人血清(病毒滴度為2X IO9拷貝/ml)。配置好的感染液加入到待感染的細胞中，孵育16至24小時候，去掉感染液，用磷酸緩沖液清洗3次 ，加入新鮮含2%DMS0的維持培養液，2天換I次新鮮的培養液；收集舊培養液用作酶聯免疫吸附試驗，分析乙肝病毒表面抗原(英文縮寫為HBsAg)、乙肝病毒e抗原(英文縮寫為HBeAg)的分泌水平。在培養的后期，細胞固定后用免疫熒光的方法檢測細胞內核心抗原(英文縮寫為HBcAg)的表達。
[0053]ELISA與免疫熒光檢測病毒感染后的關鍵指標檢測方法:
[0054]HBeAg檢測參照上海科華公司提供的乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒說明書，首先，將試劑盒中提供的25倍濃縮的洗滌液稀釋成I倍的工作濃度，具體方法為:量取480ml純化水，加入20ml濃縮洗滌液，充分混勻后，成500ml工作濃度洗滌液，待用。每孔加入待測樣品50μ 1，每個樣品設三個重復，設陰、陽性對照各2孔，每孔加入陰性對照或陽性對照各50 μ 1，并設空白對照I孔；接著每孔加入酶結合物50 μ 1，充分混勻，封板，置于37°C孵育30分鐘；然后，手工洗板，即棄去孔內液體，用試劑盒提供的洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復五次后拍干；完成洗板后每孔加入試劑盒提供的顯色劑A液、顯色劑B液各50 μ I(或I滴)，充分混勻，封板，置37°C孵育15分鐘，之后每孔加入終止液50 μ I (或I滴)，混勻；最后用酶標儀讀數，取波長450nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。
[0055]HBsAg檢測參照上海科華公司提供的乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒說明書，首先將試劑盒中提供的25倍濃縮的洗滌液稀釋成I倍的工作濃度，具體方法為:量取480ml純化水，加入20ml濃縮洗滌液，充分混勻后，成500ml工作濃度洗滌液，待用；然后加入75 μ I待測樣品(每個樣品三個重復)和陰、陽性對照于反應孔中(共預留陰性對照3孔、陽性對照I孔、建議預留空白對照I孔)，用封片紙覆蓋反應板后，將反應板置于37°C孵育60分鐘；取出反應板，撕去封片，在已加入待測樣品和陰性、陽性對照的孔中加入50μ I酶結合物，手工輕輕震蕩10秒鐘，之后用封片紙覆蓋反應板后，將反應板置于37°c孵育30分鐘；取出反應板，撕去封片紙，洗滌反應板5次(手工洗板:棄去孔內液體，用配制的工作濃度洗滌液注滿各孔，靜置30至60秒，甩干，重復5次后，在干凈的吸水紙上拍干);洗滌結束后立即在所有孔內加入試劑盒提供的顯色劑A、顯色劑B各50 μ 1，混勻，手工輕輕震蕩10秒鐘。然后用封片覆蓋反應板后，將反應板置37°C孵育30分鐘，之后每孔加入50 μ I終止液，震蕩反應5秒鐘，使之充分混勻。最后用酶標儀讀數，取波長450nm，則先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。
[0056]分析HBV的核心抗原HBcAg免疫熒光的具體方法是:以六孔板的一孔為例，細胞感染至少12天后，吸去舊培養液，用常溫PBS洗一次，立即用冰冷的4%多聚甲醛1ml，常溫固定10至15分鐘；用PBS在水平搖床上洗3次，每次5分鐘；為增強抗體與細胞內蛋白的結合，使用Iml含0.25% v/v TritonlOO的PBS溶液常溫處理45分鐘；用PBS在水平搖床上洗3次，每次5分鐘；封閉，加入適量封閉液(含有5% v/v山羊正常血清，2% m/v BSA的PBS溶液)，常溫水平搖床孵育至少I小時；利用含3%山羊正常血清的PBS溶液稀釋抗體，HBcAg兔多抗(購至丹麥Dako公司)稀釋比例為1: 400，4°C搖床孵育過夜；再用含3%山羊正常血清的PBS溶液在水平搖床上洗3次，每次10分鐘，以去除非特異結合的抗體；二抗山羊抗兔 IgG 偶聯 DyLight-488 (購至美國 Thermo Fisher Scientific Inc 公司)以 1: 400 稀釋到含3%山羊正常血清的PBS溶液，于暗處避光常溫孵育I小時，此后操作一律避光；再用含3%山羊正常血清的PBS溶液在水平搖床上洗2次，每次10分鐘，第三次清洗時加入1:1000的DAPI (購至瑞士 Roche公司)用于細胞核染色，常溫孵育10分鐘；再清洗一次以清洗掉殘留的DAPI，10至20分鐘；加入適量含3%山羊正常血清的PBS溶液防止在觀察時細胞因干燥變形。最后，利用Leica DFC425C熒光顯微鏡(購至德國Leica公司)觀察熒光信號。
[0057]結果分析
[0058]HBV感染長期培養的肝細胞分析
[0059]根據國際報道以及我們的未發表數據，原代肝細胞自分離之日起，由于快速的去分化現象，對HBV的易感性會在一周左右丟失殆盡。然而，在我們的共培養體系下，原代肝細胞在鋪板42天與72天仍然具有HBV易感性。如圖3所示，A, B分別表示該共培養體系在鋪板42天后進行感染后HBsAg，HBeAg的分泌水平:一方面，HBsAg和HBeAg都是先降低后升高，表示該體系下的肝細胞具有HBV易感性；另一方面，感染后的肝細胞仍然能存活約10周，說明與肝非實質細胞共培養，不僅能保持肝細胞的HBV易感性，還能保持HBV感染后肝細胞的活力。鋪板72天后的感染(圖3，C，D), HBsAg, HBeAg的分泌水平和42天的病毒抗原分泌基本保持一致，說明該時間點該共培養體系仍然具有HBV易感性。細胞內病毒核心抗原HBcAg陽性免疫熒光信號(圖3，E)更充分說明了該長期共培養的肝細胞對HBV具有易感性。[0060]3.肝島狀結構形成與HBV成功感染的模式圖構建:
[0061]為了進一步簡單明了地說明本發明的實施方案，我們提出了以下模式圖。如圖4所示，肝細胞與肝非實質細胞混合物以低密度的方式鋪板(A);在生長培養基的培養下，肝細胞與肝非實質細胞特別是肝非實質細胞快速生長，鋪滿整個培養皿(B);在01^0的維持下，肝細胞被肝非實質細胞環繞、入侵，形成肝島狀結構(C);該島狀結構上的肝細胞能長期維持肝細胞特性和對 HBV的易感性(D) 。
【權利要求】
1.人原代肝細胞與肝非實質細胞共培養方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)新鮮的肝組織經暴露的血管用灌注溶液I灌注約30分鐘，直至肝組織中血液被沖洗干凈; 2)用37°C預熱的灌注溶液II灌注步驟I)中沖洗干凈的肝組織，直至肝組織失去彈性消化完全； 3)將步驟2)消化完全的肝組織轉移至含有細胞洗液的培養皿中，小心抖落消化好的細胞，形成細胞懸液； 4)將步驟3)中細胞懸液通過70μ m的細胞篩，得到單細胞懸液； 5)將步驟4)獲得的單細胞懸液在50Xg和4°C條件下，離心5分鐘沉降肝細胞與肝非實質細胞，用上述細胞洗液重懸，重復離心三次，然后利用鋪板培養液重懸細胞； 6)利用臺酚藍染色法計算步驟5)中重懸細胞的細胞密度與細胞活力； 7)將步驟6)中單細胞懸液以<8X IO4活細胞/cm2的細胞密度接種到膠原包被的培養板或培養皿中，膠原包被的目的是促進細胞貼壁與肝細胞特性的維持，加入鋪板培養液，搖勻，在37°C、5% CO2培養箱中培養以充分讓其貼壁；經4至6小時后，加入生長培養液培養，3至4天換I次生長培養液； 8)培養28至35天，加入含有2%DMS0的維持培養液，3至4天換I次維持培養液； 9)培養30至40天，肝細胞堆積形成肝非實質細胞環繞、入侵生長的肝島狀結構； 其中，所述灌注溶液I具體配方為:8.00g/l氯化鈉、0.40g/l氯化鉀、3.57g/l羥乙基`哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氫二鈉、0.06g/l磷酸二氫鉀、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸納、2mM乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸，調pH至7.4 ; 所述灌注溶液II具體配方為:8.00g/l氯化鈉、0.40g/l氯化鉀、3.57g/l羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l 二水磷酸氫二鈉、0.06g/l磷酸二氫鉀、lg/1葡萄糖、ImM丙酮酸納、5mM氯化鈣、0.3g/l IV型膠原酶，調pH至7.4 ; 所述細胞洗液具體配方為=DMEM培養液中加入10% v/v胎牛血清，100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素； 所述鋪板培養液為:William’ s E medium在使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羥乙基哌嗪乙磺酸,17mM碳酸氫鈉,550mg/l丙酮酸鈉,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸,14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素,5% v/v胎牛血清;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亞油酸； 所述生長培養液為:William’ s E medium在使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM羥乙基哌嗪乙磺酸,17mM碳酸氫鈉,550mg/l丙酮酸鈉,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸,14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，20ng/ml表皮生長因子;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亞油酸； 含2% v/v DMSO的維持培養液為:William’s E medium在使用前加入IOmM尼克酰胺，20mM輕乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氫鈉，550mg/l丙酮酸鈉,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺，KT7M地塞米松，ITS+premix, 100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，2% v/v DMSO ;其中，ITS+premix 含有 6.25 μ g/ml 胰島素，6.25 μ g/ml 轉鐵蛋白，6.25ng/ml亞硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35 μ g/ml亞油酸。
2.根據權利要求1所述的人原代肝細胞與肝非實質細胞共培養方法，其特征在于:所述步驟6)中，細胞密度與細胞活力方法為:將細胞懸液與0.4% m/v臺酚藍染色液以1:1的體積比混勻，迅速將20μ I混合液加入到計數板中且將該計數板插入相應的計數儀中，儀器讀出相應的細胞密度與細胞活力，0.4%臺酚藍染色液具體配制方法為:0.4g臺酚藍固體完全溶解到100ml的PBS溶液中。
3.根據權利要求1所述的的人原代肝細胞與肝非實質細胞共培養方法，其特征在于:所述膠原包被的培養板或培養皿的制備方法:在無菌條件下，將172 μ I冰醋酸加入到100ml去離子水中，再加入終濃度為50μ g/ml的IV型鼠尾膠原，0.22μπι濾膜過濾除菌后，4°C保持待用；將該工作液以5 μ g/cm2的包被量加入到需要包被處理的培養板或培養皿中，常溫孵育；1小時后，將膠原工作液吸出，自然晾干后封口 4°C保持；用前，膠原包被的培養板或培養皿需用PBS清洗一次，`以去除殘留的醋酸。
【文檔編號】C12N5/071GK103509751SQ201310282851
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年7月8日 優先權日:2013年7月8日
【發明者】胡康洪, 周明, 曹曉蓓 申請人:康珞生物科技（武漢）有限公司