利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)線粒體乙醛脫氫酶基因分型的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)線粒體乙醛脫氫酶基因分型的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：采用硅膠吸附法抽提被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞/外周血細(xì)胞樣本的基因組DNA，設(shè)計(jì)包含目標(biāo)位點(diǎn)的檢測(cè)引物，根據(jù)高分辨熔解曲線分析技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增后的基因序列進(jìn)行位點(diǎn)分型。本發(fā)明靈敏度高、特異性好，檢測(cè)速度快，可用于評(píng)估硝酸甘油類藥物對(duì)治療個(gè)體心絞痛的有效性。
【專利說明】利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)線粒體乙醛脫氫酶基因分型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種線粒體乙醛脫氫酶基因分型的檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]舌下含服硝酸甘油是處理急性心絞痛的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。其藥理機(jī)制是硝酸甘油經(jīng)過代謝后產(chǎn)生1，2- 二硝酸甘油，同時(shí)釋放出有擴(kuò)張血管活性的物質(zhì)一氧化氮，一氧化氮通過增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的含量而松弛血管平滑肌，緩解心肌缺血，降低心臟前后負(fù)荷，從而緩解心絞痛癥狀。
[0003]線粒體乙醛脫氫酶(ALDH2)定位于12q24.2，全長(zhǎng)43.4kb，含13個(gè)外顯子，編碼518個(gè)氨基酸。其主要功能是在肝臟內(nèi)將乙醇代謝產(chǎn)物乙醛進(jìn)一步脫氫成為乙酸，進(jìn)入外周組織的三羧酸循環(huán)，分解產(chǎn)生C02和水。近來研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2在硝酸甘油的生物轉(zhuǎn)化過程中起重要作用，是使硝酸甘油活化并釋放一氧化氮的關(guān)鍵酶，具有酯酶活性，能特異性代謝硝酸甘油產(chǎn)生1，2- 二硝酸甘油、亞硝酸鹽和一氧化氮，實(shí)現(xiàn)血管擴(kuò)張。研究顯示硝酸甘油介導(dǎo)的血管擴(kuò)張是cGMP依賴的，在體內(nèi)外均能夠被ALDH2抑制劑阻滯，而非cGMP依賴的血管擴(kuò)張并不被影響；在受到硝酸甘油抑制的組織中，ALDH2的酶活性明顯下降甚至完全失活，提示硝酸甘油耐受可能與線粒體乙醛脫氫酶功能缺失有關(guān)。
[0004]ALDH2第12外顯 子存在一個(gè)G/A單核苷酸多態(tài)，直接導(dǎo)致第504位谷氨酸被賴氨酸替代(Glu504Lys)，突變的蛋白基本喪失了酶活性。這個(gè)單核苷酸多態(tài)在包括中國(guó)人群的亞洲人群中的等位基因頻率最高，約30%，等位基因G的純合子(標(biāo)記為ADLH2*1 /ALDH2*I)所編碼的蛋白具有正常的酶活性，而雜合子(標(biāo)記為ALDH2*1 /ALDH2*2)和等位基因A的純合子(標(biāo)記為ALDH2*2 /ALDH2*2)所編碼的蛋白酶活性異常。在舌下含服硝酸甘油治療心絞痛臨床療效與個(gè)體線粒體乙醛脫氫酶基因型的關(guān)聯(lián)分析研究中發(fā)現(xiàn)80人中有59人對(duì)硝酸甘油有效(73.7%)，其中等位基因G純合子的個(gè)體有效率(47人中有40人，85.1%)要比至少攜帶一個(gè)等位基因A的個(gè)體有效率(33人中有19人，57.6%)高，比數(shù)比為4.21 (99%可信區(qū)間，1.5ril.7)。結(jié)果顯示舌下含服硝酸甘油治療心絞痛與線粒體乙醛脫氫酶基因型顯著相關(guān)(X 2=7.59，p=Q.006)，經(jīng)過性別、年齡和疾病嚴(yán)重程度等因素校正之后仍然顯著相關(guān)。且在硝酸甘油藥物代謝過程中雜合子和純合子突變型ALDH2相較于野生型ALDH2而言，Km值升高，Vmax值顯著降低，ALDH2 Glu504酶的催化效率比Lys504高出10倍，提示這個(gè)Lys504多態(tài)能夠影響ALDH2的酶活性，降低硝酸甘油的生物轉(zhuǎn)化能力。由此可見，線粒體乙醛脫氫酶Glu504Lys能夠影響硝酸甘油生物活性的轉(zhuǎn)化，通過對(duì)個(gè)體ALDH2基因Glu504LyS位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)，可以用于評(píng)估硝酸甘油類藥物對(duì)治療個(gè)體心絞痛的有效性。
[0005]目前普遍應(yīng)用的基因分型檢測(cè)方法為Taqman探針法和DNA直接測(cè)序法。Taqman熒光探針兩端分別標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，探針在未與目標(biāo)序列結(jié)合保持完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)沒有分離，熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，不能受激發(fā)出熒光；PCR擴(kuò)增時(shí)，完全互補(bǔ)配對(duì)后由Taq酶所具有的5’_3’外切酶活性將探針酶切降解，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以接到熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如果探針與目標(biāo)序列存在錯(cuò)配堿基，就會(huì)大大減少探針與目標(biāo)序列結(jié)合的緊密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影響探針的熒光釋放量，使帶有不同堿基的DNA序列得以鑒定。這種方法步驟少，不易污染，便于對(duì)大樣本進(jìn)行分型；但對(duì)引物設(shè)計(jì)有一定的限制，對(duì)于SNP附近的序列有一定要求，受突變堿基位點(diǎn)與類型局限。DNA直接測(cè)序法能直接提供準(zhǔn)確的堿基信息，被當(dāng)成突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本較昂貴，不適用于對(duì)大量樣本進(jìn)行檢測(cè)等缺點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明應(yīng)用一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法——高分辨熔解曲線(High resolution melting, HRM)分析技術(shù)。其原理是根據(jù)DNA序列的長(zhǎng)度、GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，飽和性熒光染料高濃度占據(jù)雙鏈DNA所有堿基對(duì)，當(dāng)雙鏈DNA局部解鏈時(shí)，熒光染料釋放，熒光強(qiáng)度的降低精準(zhǔn)可靠地反映出DNA分子的解鏈情況。HRM不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料更易于檢測(cè)單堿基突變、小片段插入或缺失。該方法與其他遺傳分型技術(shù)相比，操作簡(jiǎn)單，具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果準(zhǔn)確，且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單易行的線粒體乙醛脫氫酶基因分型的檢測(cè)方法。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)線粒體乙醛脫氫酶基因分型的方法，其特征在于，具體步驟為:
第一步:采用硅膠吸附法抽提被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞/外周血細(xì)胞樣本的基因組DNA，采用電泳凝膠成像法對(duì)DNA的濃度和純度作檢測(cè)，待測(cè)樣本濃度標(biāo)化到lOng/ul ;已知ALDH2 Glu504Lys位點(diǎn)基因型為GG的樣本DNA為陰性對(duì)照，基因型為AA的樣本DNA為陽性對(duì)照1，基因型為AG的為陽性對(duì)照2。
[0009]第二步:用無菌水配制濃度為lOumol/L的ALDH2基因正向引物溶液以及濃度為lOumol/L的ALDH2基因反向引物溶液；ALDH2基因正向引物的序列為:5 ' - GATGTGTTTGGAGCCCAGTC -3 '，ALDH2 基因反向引物的序列為:5 '-CAGGTCCCACACTCACAGTTT -3'。
[0010]第三步:在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的ALDH2基因正向引物溶液0.5ul、ALDH2基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入第一步得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品及陽性對(duì)照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足15ul ;在Rotor-Gene Q上進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為92_97°C變性5_15分鐘，92-97°C變性 10-30 秒，57-65°C退火 10-30 秒，70-75°C 延伸 10-30 秒，30-50 個(gè)循環(huán)；HRM 反應(yīng)條件:92-97°C變性I分鐘，40°C復(fù)性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95 0C，過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，30-50次每秒。
[0011]第四步:應(yīng)用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結(jié)果,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線基于曲線偏移(純合子)和曲線形狀變化(雜合子)展現(xiàn)不同的基因型。定義已知樣本基因型后，軟件會(huì)自動(dòng)調(diào)出所有檢測(cè)樣本的基因型。
[0012]本發(fā)明對(duì)ALDH2基因Glu504Lys位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)，可用于評(píng)估硝酸甘油類藥物對(duì)治療個(gè)體心絞痛的有效性。
[0013]本發(fā)明基于HRM分析技術(shù)，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料，操作簡(jiǎn)單，不僅具有靈敏度高、特異性好、成本低、檢測(cè)速度快、高通量等優(yōu)點(diǎn)，而且分辨率高，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染。
[0014]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明實(shí)施例PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例樣本陰性對(duì)照的測(cè)序圖；
圖3為本發(fā)明實(shí)施例樣本陽性對(duì)照I的測(cè)序圖；
圖4為本發(fā)明實(shí)施例樣本陽性對(duì)照2的測(cè)序圖；
圖5為本發(fā)明實(shí)施例大樣本的HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
圖6為本發(fā)明實(shí)施例大樣本的HRM差異曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例
[0017]1、采用硅膠吸附法抽提被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞基因組DNA，電泳凝膠成像法對(duì)DNA的濃度和純度作檢測(cè)，待測(cè)樣本濃度標(biāo)化到lOng/ul ；
陰性對(duì)照DNA符合以下條件時(shí)視為合格:0D值A(chǔ)260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測(cè)序鑒定ALDH2 Glu504Lys位點(diǎn)基因型為GG，測(cè)序結(jié)果如圖2所示；
陽性對(duì)照I DNA符合以下條件時(shí)視為合格:0D值A(chǔ)260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測(cè)序鑒定ALDH2 Glu504Lys位點(diǎn)基因型為AA，測(cè)序結(jié)果如圖3所示；
陽性對(duì)照2 DNA符合以下條件時(shí)視為合格:0D值A(chǔ)260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測(cè)序鑒定ALDH2 Glu504Lys位點(diǎn)基因型為AG，測(cè)序結(jié)果如圖4所示。
[0018]2、根據(jù)ALDH2基因的保守區(qū)域，采用在線軟件Primer 3設(shè)計(jì)引物，確定最佳引物為18-24bp大小，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度70-150bp，目標(biāo)位點(diǎn)周邊位置避免其他SNP位點(diǎn)(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用無菌水配制濃度為lOumol/L的ALDH2基因正向引物溶液以及濃度為lOumol/L的ALDH2基因反向引物溶液；ALDH2基因正向引物的序列為:5 ' - GATGTGTTTGGAGCCCAGTC -3 '，ALDH2基因反向引物的序列為:5 '-CAGGTCCCACACTCACAGTTT -3'。
[0019]3、在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生產(chǎn)，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?緩沖液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步驟2所得的ALDH2基因正向引物溶液0.5ul、ALDH2基因反向引物溶液
0.5ul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入步驟I得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品及陽性對(duì)照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足15ul ;在1?於01-66116 Q上進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為95°C變性10分鐘，95 °C變性10秒，57 °C退火10秒，72 °C延伸10秒，40個(gè)循環(huán)；HRM反應(yīng)條件:95°C變性I分鐘，40°C復(fù)性I分鐘，初始熔解溫度65°C開始程序升溫熔解至95°C，過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，40次每秒。 [0020]4、應(yīng)用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結(jié)果，如圖5所示，在10例口腔粘膜上皮細(xì)胞提取的DNA檢測(cè)中，有6例ALDH2 Glu504Lys位點(diǎn)基因型為GG，3例基因型為AG，I例基因型為AA。
【權(quán)利要求】
1.在一種利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)線粒體乙醛脫氫酶基因分型的方法，其特征在于，具體步驟為: 第一步:采用硅膠吸附法抽提被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞/外周血細(xì)胞樣本的基因組DNA，電泳凝膠成像法對(duì)DNA的濃度和純度作檢測(cè)，待測(cè)樣本濃度標(biāo)化到10ng/ul ;已知ALDH2Glu504Lys位點(diǎn)基因型為GG的樣本DNA為陰性對(duì)照，基因型為AA的樣本DNA為陽性對(duì)照1，基因型為AG的為陽性對(duì)照2; 第二步:用無菌水配制濃度為lOumol/L的ALDH2基因正向引物溶液以及濃度為lOumol/L的ALDH2基因反向引物溶液；ALDH2基因正向引物的序列為:5 ' - GATGTGTTTGGAGCCCAGTC -3 '，ALDH2 基因反向引物的序列為:5 '-CAGGTCCCACACTCACAGTTT -3'; 第三步:在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的ALDH2基因正向引物溶液0.5ul、ALDH2基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入第一步得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品及陽性對(duì)照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足15ul ;在Rotor-Gene Q上進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為92_97°C變性5-15分鐘，92_97°C變性10-30秒，57-65 °C退火10-30秒，70-75 °C延伸10-30秒，30-50個(gè)循環(huán)；HRM反應(yīng)條件:92-97°C變性I分鐘，40°C復(fù)性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95°C，過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，30-50次每秒； 第四步:應(yīng)用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結(jié)果，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線基于曲線偏移(純合子)和曲線形狀變化(雜合子)展現(xiàn)不同的基因型；定義已知樣本基因型后，軟件會(huì)自動(dòng)調(diào)出所有檢測(cè)樣本的基因型。`
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525904SQ201310288926
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月11日
【發(fā)明者】傅詠南, 張奕, 王校, 毛丹丹 申請(qǐng)人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司