一株農業秸稈降解真菌草酸青霉njgz-2及其菌劑的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株能降解農業廢棄物秸稈的常溫真菌NJGZ-2，屬于農業廢棄物資源利用技術。該菌株NJGZ-2分類命名為：草酸青霉，菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC?NO.7527。試驗表明，水稻秸稈接種孢子(1％的107孢子/mL)懸液后，30℃條件下170r/min液體發酵培養7d，水稻秸稈的失重率分別為59.7％。發酵粗酶提取液，其內切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶活及總纖維素酶活性分別為113.3U/gds、11.6U/gds、1439.7U/gds、2.0U/gds和13.8U/gds。粗酶液能水解低濃度堿處理的玉米芯產生高濃度的還原糖(962.2mg還原糖/g底物)，本發明是利用微生物發酵技術降解農業廢棄秸稈使其轉化為有機肥料，可以變廢為寶、保護環境，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一株農業秸稈降解真菌草酸青霉NJGZ-2及其菌劑
一、【技術領域】
[0001]本發明涉及一株農業秸桿降解真菌及其菌劑，屬于農業集約化生產技術，專用于降解廢棄秸桿生產有機肥料，實現有機廢棄物資源化。
二、【背景技術】
[0002]我國是一個農業大國，如何處理農作物秸桿是大多數農區面臨的一個難題，大量的廢棄秸桿若不及時處理，不僅影響正常耕作，而且也成了病蟲害繁殖的場所；如把其付之一炬，不僅嚴重污染環境，同時也浪費了秸桿中所含的有用資源和能源。利用秸桿降解菌處理廢棄秸桿，具有環保、節能、高效等特點，符合可持續發展的要求。農業廢棄秸桿是一種十分寶貴的農業資源，含有豐富的有機碳和大量的氮、磷、鉀、硅等礦質營養元素以及微量元素，合理利用這種資源是農業可持續發展的一項重要任務。然而，秸桿中含有大量的木質素和纖維素，不易腐爛，因此不宜就地進行還田處理，也不適用于作飼料。于是，絕大部分秸桿都作為廢棄物被丟棄或被焚燒，不同程度地污染了當地的生活生產環境，也造成了寶貴資源的浪費。
[0003]大量的研究表明，秸桿還田能夠有效增加土壤有機質含量，改良土壤，培肥地力，對于緩解中國土壤氮、磷、鉀肥比例失調的矛盾具有十分重要的意義。但由于中國人口多耕地少，耕地復種指數高，倒茬時間短，加之秸桿碳氮比值高，給秸桿還田帶來困難，且效果較差。因此通過秸桿處理將其制成有機肥，是一項能源環保雙贏的技術。秸桿的資源化處理包括有物理法、化學法和生物法，而前兩類方法處理成本高，且易造成二次污染，因此目前大多采用微生物處理法。微生物處理法就是把秸桿通過添加特定的秸桿分解菌劑，在田間常溫的條件下，加速秸桿的腐解和轉化。秸桿資源通過微生物分泌的細胞壁降解相關酶的分解成葡萄糖、木糖、纖維二糖、可溶性的寡糖，是大多數生物優先利用的碳源營養物質而被直接高效地轉化利用。 因此，利用纖維素分解菌劑建立新型的生物秸桿還田技術將成為解決大量秸桿資源的一條重要途徑。
[0004]通過接種秸桿降解菌劑，加快底物中木質纖維類物質的分解，真菌產生的胞外纖維素分解酶活性遠遠高于細菌產生的纖維素分解酶活性。若能篩選到相應的高效功能菌株，將其用于廢棄秸桿的降解和肥料生產，將會有很好的應用前景。
三、
【發明內容】

[0005]1.技術問題
[0006]本發明的目的在于篩選一株能夠高效分解農業廢棄秸桿的常溫真菌草酸青霉，其能高效分解農業廢棄秸桿，使得農田中的廢棄秸桿資源化，確?？沙掷m農業的順利發展。
[0007]2.技術方案
[0008]—株能降解稻桿的常溫真菌，該真菌NJGZ-2屬于草酸青霉(Penici 11 iumoxalicum)，2013年4月27日寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院，中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC N0.7527 ;其生物學特性為，在PDA平板上，初期菌落中間呈淺白色、輪廓規則，外觀呈絨毛狀。菌絲細胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，呈藍綠色。采用真菌通用引物ITSl和ITS4進行PCR擴增，將PCR產物連接pMD_19T載體后測序,所得序列經NCBI比對,與Penicillium oxalicumstrain als2_d38有99%的相似度。選取和它相近的一些菌株繪制系統發育進化樹，以及結合菌落和菌絲形態學特征，鑒定該菌株為草酸青霉。
[0009]NJGZ-2能在CMC-剛果紅培養基上生長并產生透明的水解圈。CMC-剛果紅培養基配方為:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10g, (NH4) 2S042g, KH2PO4Ig, MgSO4.7Η200.5g，剛果紅
0.2g，瓊脂 20g，水 1000mL，12rC高壓滅菌 20min。 [0010]秸桿降解菌NJGZ-2孢子懸液(菌劑)的制備方法為:
[0011]液體培養基的配制:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末20g，(NH4)2SO4L 4g，KH2P042g,MgSO4.7Η200.3g, CaCl20.4g,胰蛋白胨 lg, FeSO4.7Η200.0075g ；MnSO4.H2O0.0025g ；ZnSO40.002g, CoCl20.003g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ；
[0012]水稻秸桿粉培養基配方為:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末10g，KH2P43.0g ；NaN0s3.0g ；CaCl20.5g ；MgS04.7H200.5g, FeSO4.7H200.0075g, MnSO4.H2O0.0025g,ZnSO40.002g, CoCl20.003g，瓊脂 20g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ；
[0013]液體培養基的配制:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末20g，(NH4)2SO4L 4g，KH2P042g,MgSO4.7Η200.3g, CaCl20.4g,胰蛋白胨 lg, FeSO4.7Η200.0075g, MnSO4.H2O0.0025g,ZnSO40.002g, CoCl20.003g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ；
[0014]將菌株NJGZ-2接種至裝有50mL秸桿粉培養基的三角瓶中，30°C條件下靜止培養7d，加30mL無菌水去三角瓶中，放在搖床上震蕩30min，用紗布過濾培養物后即為孢子懸液菌劑。按I %的接種量接種于液體培養基中，30°C條件下，以170r/min培養6d，離心過濾除去菌體和雜質，得到粗酶液。
[0015]酶解秸桿反應體系:0.5g秸桿粉末，20mL粗酶液(pH5.0)，于50mL的帶螺口帽的離心管中，50°C，200r/min，水解72小時。
[0016]所用的秸桿粉末指的是粉碎后過40目篩，含水量10%以下。
[0017]上述孢子懸液菌劑可用于降解農業廢棄秸桿。
[0018]3.有益效果
[0019]該菌株在CMC-剛果紅培養基上可產生水解圈(圖1)，可以在農業廢棄物秸桿(水稻、小麥、玉米等秸桿)為唯一碳源的培養基上生長。該菌塊接種于水稻秸桿粉培養基后，30°C條件下靜止培養7d，加無菌水過濾菌絲后可獲得孢子懸液。試驗表明，水稻秸桿接種孢子(1%的IO7孢子/mL)懸液后，30°C條件下170r/min液體發酵培養7d和靜止條件下固體發酵14d，水稻秸桿的失重率分別為59.7%和32.5%。液體發酵完成后，過濾菌絲和固體雜質得到粗酶提取液，其內切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶活及總纖維素酶活性分別為 113.3U/gds、ll.6U/gds、1439.7U/gds、2.0U/gds 和 13.8U/gds。粗酶液能水解低濃度堿處理的玉米芯產生高濃度的還原糖(962.2mg還原糖/g底物)，本發明是利用微生物發酵的方法降解農業廢棄秸桿使其轉化為有機肥料，可以變廢為寶、保護環境，具有廣闊的應用前景。
[0020]秸桿降解真菌NJGZ-2可將廢棄農業秸桿發酵分解后制成有機物料，加速秸桿還田腐熟，不僅可以變廢為寶、保護環境，還可以促進可持續發展，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1鑒定NJGZ-2的系統發育樹
[0022]圖2NJGZ-2在CMC-剛果紅平板上產生的水解圈
[0023]圖3NJGZ-2ITS rRNA 核酸序列
[0024]圖4水稻秸桿降解前后對比效果和電鏡圖
[0025]圖5粗酶水解秸桿產生還原糖
四、【具體實施方式】
[0026]I)高效秸桿降解菌株分離:該降解菌是從南京紫金山腐爛樹葉土壤中篩選得至|J。利用梯度稀釋涂布法將逐級稀釋的土壤樣品的懸液涂布到CMC-剛果紅平板，30°C培養篩選纖維素降解菌。上述CMC-剛果紅培養基配方為:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10g，(NH4) 2S042g, KH2PO4Ig, MgSO4.7Η200.5g，剛果紅 0.2g，瓊脂 20g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌20mino
[0027]挑選在CMC-剛果紅平板上產生透明圈較大并生長較快的菌株純化分離，然后，將它們接種至以水稻秸桿為唯一碳源的水稻秸桿粉培養基上培養，比較各菌株生長速度和生長情況，最終得到能高效降解煙草秸桿的高溫真菌NJGZ-2。在PDA平板上，初期菌落中間呈淺白色、輪廓規則，外觀呈絨毛狀。菌絲細胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，呈藍綠色。采用真菌通用引物ITSl和ITS4進行PCR擴增，將PCR產物連接pMD_19T載體后測序，所得序列經NCBI比對，與Penicillium oxalicum strain als2_d38有99%的相似度。選取和它相近的一些菌株繪制系統發育進化樹，以及結合菌落和菌絲形態學特征，鑒定該菌株為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。
[0028]2)秸桿降解菌NJGZ-2孢子懸液菌劑
[0029]將菌株NJGZ-2接種至裝有50mL秸桿粉培養基的三角瓶中，30°C條件下靜止培養7d，加30mL無菌水去三角瓶中，放在搖床上震蕩30min，用紗布過濾培養物后即為孢子懸液菌劑。
[0030]3)粗酶液的制備
[0031]按照I %的體積接種孢子懸液菌劑于水稻秸桿為碳源的液體培養基中，在30 0C 170r/min條件下培養6d，離心過濾除去菌體和雜質，得到粗酶液。測定粗酶液中內切
酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β -木糖苷酶活及總纖維素酶活性。
[0032]
【權利要求】
1.一株降解農業稻桿的真菌NJGZ-2,該真菌屬于草酸青霉(Penicillium oxalicum),2013年4月27日寄存于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.7527 ;其生物學特性為，在PDA平板上，初期菌落中間呈淺白色、輪廓規則，外觀呈絨毛狀；菌絲細胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，呈藍綠色。
2.如權利要求1所述農業秸桿降解真菌在秸桿降解方面的應用。
3.一種采用權利要求1所述的真菌制備的降解秸桿的菌劑，其特征在于是由以下方法制備而成: 1)水稻秸桿粉培養基的配制:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末10g，KH2P043.0g,NaN0s3.0g, CaCl20.5g, MgSO4.7Η200.5g, FeSO4.7Η200.0075g, MnSO4.H2O0.0025g,ZnSO40.002g, CoCl20.003g，瓊脂 20g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ； 2)液體培養基的配制:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末20g，(NH4)2SO4L4g, KH2P042g,MgSO4.7Η200.3g, CaCl20.4g,胰蛋白胨 lg, FeSO4.7Η200.0075g, MnSO4.H2O0.0025g,ZnSO40.002g, CoCl20.003g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ； 3)將權利要求1所述菌株NJGZ-2接種至裝有50mL秸桿粉培養基的三角瓶中，30°C條件下靜止培養7d，加30mL無菌水把孢子放在搖床上震蕩30min，用紗布過濾培養物后即為孢子懸液，用血球計數板計數后可濃縮或用無菌水稀釋以達到使用濃度，一般為IO7孢子/mL，制成秸桿降解菌劑；按1%的接種量接種于秸桿粉液體培養基中，30°C條件下，以170r/min培養6d，離心過濾除去菌體和雜質，得到粗酶液。
4.如權利要求3所述的菌劑，其特征在于秸桿粉為粉碎后過40目篩，含水量10%以下。
5.權利要求3或4所述菌劑在`降解秸桿方面的應用。
【文檔編號】C12R1/80GK103667069SQ201310289313
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年7月11日 優先權日:2013年7月11日
【發明者】徐陽春, 廖漢鵬, 韋中, 沈其榮 申請人:南京農業大學