利用高分辨熔解曲線分析技術檢測mthfr基因多態性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因分型的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，設計包含目標位點的檢測引物，根據高分辨熔解曲線分析技術對PCR擴增后的基因序列進行位點分型。本發明靈敏度高、特異性好，檢測速度快，可用于預測甲氨蝶呤的藥物敏感性和耐受性。
【專利說明】利用高分辨熔解曲線分析技術檢測MTHFR基因多態性的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因分型的檢測方法，屬于分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)定位于染色體lp36，cDNA全長2220bp，基因包括 11 個外顯子和 10 個內含子，為 5，10-methy Ienetetrahydrof ο late reductase(NADPH)(亞甲基四氫葉酸還原酶)蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸鹽。5-甲基四氫葉酸鹽可以進一步進入甲基傳遞通路，通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接得為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個較低的水平。MTHFR基因對DNA的合成、活化、修復等起調控作用，其多態性是目前疾病尤其是癌癥以及遺傳藥理學方面研究較多的基因之一。研究發現突變頻率較高的多態位點之一是C677T，存在CC、TC、TT三個基因型，CC型(野生型)最多見，其次為CT型(雜合子型)，TT型(純合子型)最少。研究表明MTHFR基因C677T的突變頻率在不同國家、同一國家不同地區及同一地區不同民族的分布有顯著差異。
[0003]人類MTHFR基因C677T位于MTHFR催化區域，該位點突變直接影響亞甲基四氫葉酸還原酶的活性和耐熱性 ，表現為不同程度的酶活性降低并伴有酶的耐熱性降低。37°C時，TT型突變酶的活性為CC型酶活性的40%-50%，46°C時為35%，雜合子突變酶活性的下降程度居CC型與TT型之間。有研究發現，TT基因型的血Hcy水平明顯高于CC型和CT型(P〈
0.05)，而CT型又顯著高于CC型(P〈 0.05)，說明TT型和CT型患者的MTHFR酶活力有一定程度的下降，導致了高Hcy血癥。McQuillan等研究了 1111例中位年齡為52歲者，發現MTHFR基因TT型突變者的血漿Hcy水平顯著高于CT型和CC型。同型半胱氨酸水平升高增加了葉酸拮抗劑的毒性，而甲氨喋呤在體內正以競爭方式與二氫葉酸還原酶結合，降低葉酸的血漿濃度，導致血漿Hcy升高，嚴重時能引起白細胞和血小板減少，巨幼紅細胞性貧血等毒副作用。由于不同患者對甲氨蝶呤的敏感性和耐受程度不同，臨床用藥過程中可出現不同毒副反應。遺傳藥理學認為人類基因組存在的基因多態性(SNPs)是造成不同個體對藥物反應和耐受不同的主要遺傳因素。有研究顯示MTHFR基因多態性與大劑量甲氨蝶呤化療后毒副作用存在相關性，攜帶C677T T等位基因患者的毒副作用高于攜帶C677T C等位基因的野生型基因型。對兒童急性淋巴細胞白血病患者的研究中發現:MTHFR 677位突變的白血病患兒發生甲氨蝶呤毒副反應的風險為未突變者的11.3倍。由此可見，通過對個體MTHFR基因C677T位點的基因型進行檢測可以預測甲氨喋呤藥物的敏感性和耐受性，為個體化用藥提供依據。
[0004]目前普遍應用的基因分型檢測方法為Taqman探針法和DNA直接測序法。Taqman熒光探針兩端分別標記報告基團和淬滅基團，探針在未與目標序列結合保持完整時，熒光報告基團和淬滅基團沒有分離，熒光信號被淬滅基團吸收，不能受激發出熒光；PCR擴增時，完全互補配對后由Taq酶所具有的5’_3’外切酶活性將探針酶切降解，熒光報告基團和淬滅基團分離，熒光檢測系統可以接到熒光信號，實現熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。如果探針與目標序列存在錯配堿基，就會大大減少探針與目標序列結合的緊密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影響探針的熒光釋放量，使帶有不同堿基的DNA序列得以鑒定。這種方法步驟少，不易污染，便于對大樣本進行分型；但對引物設計有一定的限制，對于SNP附近的序列有一定要求，受突變堿基位點與類型局限。DNA直接測序法能直接提供準確的堿基信息，被當成突變檢測的金標準，但存在費時費力，成本較昂貴，不適用于對大量樣本進行檢測等缺點。
[0005]本發明應用一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法——高分辨熔解曲線(High resolution melting, HRM)分析技術。其原理是根據DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補性差異，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，飽和性熒光染料高濃度占據雙鏈DNA所有堿基對，當雙鏈DNA局部解鏈時，熒光染料釋放，熒光強度的降低精準可靠地反映出DNA分子的解鏈情況。HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料更易于檢測單堿基突變、小片段插入或缺失。該方法與其他遺傳分型技術相比，操作簡單，具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優點，結果準確，且實現了真正的閉管操作。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種簡單易行的5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因分型的檢測方法。
[0007]為了達到上述目的，本發明提供一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因分型的方法，其特征在于，具體步驟為:
第一步:采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，采用電泳凝膠成像法對DNA 的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到lOng/ul ;已知MTHFR C677T位點基因型為CC的樣本DNA為陰性對照，基因型為CT的樣本DNA為陽性對照1，基因型為TT的為陽性對照2。
[0008]第二步:用無菌水配制濃度為lOumol/L的MTHFR基因正向引物溶液以及濃度為lOumol/L的MTHFR基因反向引物溶液；MTHFR基因正向引物的序列為:5’ -TATTGGCAGGTTACCCCAAA-3’，MTHFR基因反向引物的序列為:5’ -TCACAAAGCGGAAGAATGTG-3’。
[0009]第三步:在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的MTHFR基因正向引物溶液0.5ul、MTHFR基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92_97°C變性5_15分鐘，92-97°C變性 10-30 秒，57-65°C退火 10-30 秒，70-75°C 延伸 10-30 秒，30-50 個循環；HRM 反應條件:92-97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95 0C，過程中實時監測熒光信號，30-50次每秒。
[0010]第四步:應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果,通過標準曲線基于曲線偏移(純合子)和曲線形狀變化(雜合子)展現不同的基因型。定義已知樣本基因型后，軟件會自動調出所有檢測樣本的基因型。
[0011]本發明對MTHFR基因C677T位點的基因型進行檢測，可用于預測甲氨蝶呤藥物的敏感性和耐受性。
[0012]本發明基于HRM分析技術，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料，操作簡單，不僅具有靈敏度高、特異性好、成本低、檢測速度快、高通量等優點，而且分辨率高，全部反應在封閉的反應管中完成，有效避免了交叉污染。
[0013]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發明實施例PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2為本發明實施例大樣本的HRM標準曲線圖；
圖3為本發明實施例大樣本的HRM差異曲線圖。
【具體實施方式】
[0015]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
實施例
[0016]1、采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞基因組DNA，電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到lOng/ul ；
陰性對照DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑒定MTHFR C677T位點基因型為CC ；
陽性對照I DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑒定MTHFR C677T位點基因型為CT ；
陽性對照2 DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑒定MTHFRC677T位點基因型為TT。
[0017]2、根據MTHFR基因的保守區域，采用在線軟件Primer 3設計引物，確定最佳引物為18-24bp大小，PCR產物長度70-150bp，目標位點周邊位置避免其他SNP位點(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用無菌水配制濃度為lOumol/L的MTHFR基因正向引物溶液以及濃度為lOumol/L的MTHFR基因反向引物溶液；MTHFR基因正向引物的序列為:5’_TATTGGCAGGTTACCCCAAA -3’，MTHFR 基因反向引物的序列為:5’ - TCACAAAGCGGAAGAATGTG-3，。
[0018]3、在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生產，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?緩沖液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步驟2所得的MTHFR基因正向引物溶液0.5ul、MTHFR基因反向引物溶液
0.5ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入步驟I得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在1?於01-66116 Q上進行反應，PCR反應條件為95°C變性10分鐘，95 °C變性10秒，57 °C退火10秒，72 °C延伸10秒，40個循環；HRM反應條件:95°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度65°C開始程序升溫熔解至95°C，過程中實時監測熒光信號，40次每秒。
[0019]4、應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果，如圖2、圖3所示，在10例口腔粘膜上皮細胞提取的DNA檢測中，有5例MTHFRC677T位點基因型為CC，4例基因型為CT，I例基因型為TT。
【權利要求】
1.一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測MTHFR基因多態性的方法，其特征在于，具體步驟為: 第一步:采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA,電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到10ng/ul ;已知MTHFRC677T位點基因型為CC的樣本DNA為陰性對照，基因型為CT的樣本DNA為陽性對照1，基因型為TT的為陽性對照2; 第二步:用無菌水配制濃度為lOumol/L的MTHFR基因正向引物溶液以及濃度為lOumol/L的MTHFR基因反向引物溶液；MTHFR基因正向引物的序列為:5’ -TATTGGCAGGTTACCCCAAA -3，，MTHFR 基因反向引物的序列為:5’- TCACAAAGCGGAAGAATGTG_3，； 第三步:在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的MTHFR基因正向引物溶液0.5ul、MTHFR基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92_97°C變性5-15分鐘，92_97°C變性10-30秒，57-65 °C退火10-30秒，70-75 °C延伸10-30秒，30-50個循環；HRM反應條件:92-97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95°C，過程中實時監測熒光信號，30-50次每秒； 第四步:應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果，通過標準曲線基于曲線偏移(純合子)和曲線形狀變化(雜合子)展現不同的基因型；定義已知樣本基因型后，軟件會自動調出所有檢測樣本的基因型。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103525912SQ201310431133
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】吳穎臻, 張奕, 傅詠南, 王校, 毛丹丹, 卞雪蓮 申請人:上海中優醫藥高科技有限公司