一種提高分枝桿菌對植物甾醇降解速率的方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物藥業制劑，特別是涉及一種通過對一種微生物進行復合誘變來提高其對植物甾醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法。包括以下步驟：（1）以植物甾醇降解菌為出發菌株，將該菌在斜面上培養4天。（2）將成熟斜面制成菌懸液進行離子束輻照誘變：隨后立即涂斜面。（3）斜面成熟后制備種子液，培養14-16h后涂平板進行紫外誘變：隨后經平板初篩和搖瓶復篩，得高產菌株。（4）對該菌落再制備斜面、種子液，種瓶培養14-16h后涂平板再進行紫外與激光復合誘變，誘變后再經平板初篩和搖瓶復篩，最終得高產菌株。通過本方法得到的菌株在底物甾醇為5%，樹脂為6%的基礎下50L發酵罐平均效價可達25-30g/l，甾醇轉化率為86.8%。這樣就可大大降低生產成本。
【專利說明】一種提高分枝桿菌對植物留醇降解速率的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物工程制備雄烯二酮的方法，特別涉及一種通過對分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法。屬生物工程領域。
【背景技術】
[0002]4-雄烯二酮(化學名稱:雄留-4-烯-3,17- 二酮,英文名4_Androstenedione,簡稱AD)，該產品外觀形狀呈近白色晶體粉末，無異味，無毒性，不溶于水，是一種當今世界上用途極廣，科技含量高的生物化工中間體。
[0003]雄烯二酮是生產激素類原料藥的重要中間體，可以說幾乎所有留體激素藥物都可以以雄烯二酮為起始原料進行生產，如用于生產皮質激素、性激素、孕激素及蛋白同化激素，又可用于合成可的松、強的松、黃體酮、雌烯醇、地塞米松等100余種藥物，也是用于生產抗早孕米非司酮和各類計劃生育用藥必不可少的原料。
[0004]雄烯二酮作為合成留體類激素藥物重要的原料和關鍵的中間體，市場前景廣闊。甾體激素藥物經過幾十年的研究開發，目前已形成種類繁多、臨床應用廣泛和需要旺盛的一大類留體藥物。從實際留體激素藥物產業發展來看，國外1980年產量約9.5噸，銷售15億美元，占醫藥產品銷售總額的4.3%；1990年產量增至105噸，銷售108億美元，平均遞增
10.4% ；2010年銷售額達到400億美元，約占世界醫藥銷售額的18%，保持快速發展走勢，藥品品種達1920種之多。
[0005]我國留體激素藥物經過40多年發展，開發實力非常強勁，企業發展非常迅速。甾體激素藥物年產值超過80億元，占醫藥工業總產值的5%，成為我國醫藥工業體系中的重要組成部分。拒統計，1996年我國留體激素藥物年生產能力已達220噸，產量100余噸。雄烯二酮海關編號是29372900，海關數據表明，2005年留體激素及其衍生物進口 0.14噸，進口金額2335美元，出口 151.891噸，出口金額達2542萬美元。主要出口地區是印度、德國、美國、荷蘭、巴西等，進口地區主要來自瑞典與新加坡。2008年1-2月份，留體激素及其衍生物進口 26噸，進口金額45.3美元，出口 111.2噸，出口金額5655萬美元，預計2012年進出口數量情況較往年將會大幅度增加，金額也會繼續大幅增加，主要是由于我們的產品質量與檔次提高的原因。國內出口比較活躍的地區是北京、天津、上海、陜西、浙江、湖北、云南等省份，大致與其資源與加工區域一致。
[0006]目前，雄烯二酮全球市場800億美元，市場增長率20%。我國雄烯二酮現生產能力大約在1000噸左右，與需求還有很大差距。據2004年國際市場留體激素類藥物原料藥統計，我國制藥企業每年對雄烯二酮的需求量約6000噸，其中約3000噸來需來自薯蕷皂甙生產，另外約3000噸需來自植物留醇生產，這一比例隨著環境污染的要求會增加植物留醇轉化生產雄烯二酮的量(從薯蕷(黃姜)分離皂甙生產雄烯二酮污染嚴重，許多省份已禁止生產)。所以以植物留醇或膽固醇生產雄烯二酮的受到重視，可以預見，隨著生產技術的進一步發展，全球市場上植物留醇轉化為雄烯二酮的銷售量還將快速增長。因此，對植物留醇轉化雄烯二酮大規模生產的市場前景非常誘人。[0007]激素的生產工藝生產周期長，反應過程復雜，行業進入壁壘高，國內外的生產廠家不多，競爭對手數量較少，且非常集中。國內集中在天藥股份、仙琚藥業等一些企業，而目前它們大都采用化學合成方法生產皮質類激素。相比化學合成法，微生物轉化法具有原料成本低、生產步驟簡化、生產周期縮短、生產材料費用降低等優點。國外從1998年以來一直采用植物留醇為原料生產雄烯二酮的生產工藝，攻克微生物發酵生產激素的技術一直是國內廠商多年努力方向。
[0008]我公司經多年研究，開發出一套高產AD的新技術，該技術是采用以植物甾醇為主，同時輔以黃豆粉、葡萄糖和其他常用的普通發酵用化工產品，綜合運用現代生物技術，解決了微生物選擇性降解側鏈來獲得雄烯二酮產品的工業化生產的一系列技術難點，菌種轉化效率高，與化學合成相比，工藝流程短，反應條件溫和，提取溶劑可以回收充分利用，有很高的成本優勢，是一種區別于傳統工藝的全新技術，有效地促進了傳統工藝技術的升級換代。

【發明內容】

[0009]目前，提高植物甾醇降解菌生產的能力，仍以誘變育種為主要手段。針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種通過對分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法
1、本發明的一種通過對分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其包括以下步驟:
(O以植物留醇降解菌為出發菌株，將植物留醇降解菌在斜面培養基上預培養3-4天獲得新鮮成熟菌體。
[0010](2)將預培養后的植物留醇降解菌制備成菌體量為I X IO6個/mL的菌懸液進行離子束輻照誘變:誘變溫度為25°C，誘變劑量為50Gy誘變后立即涂培養基斜面。(3)斜面成熟后制備種子液，種子液接種后培養14_16h后涂平板進行紫外誘變:用15W功率的紫外燈管和固定距離為20cm的條件下進行分劑量照射，照射劑量為0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，誘變后再經培養基平板初篩和搖瓶發酵方法復篩，獲得高產菌落。
[0011](4)對該高產菌落再進行制備斜面、種子液，種子液接種后培養14-16h后涂平板再次進行紫外與激光復合誘變:用15W功率的紫外燈管和固定距離為20cm的條件下進行照射2分鐘，隨后立即避光轉移自激光處理裝置中用YAG倍頻脈沖激光照射，輻照次數分別為200、400、600、800、1000、1200。誘變后再經培養基平板初篩和搖瓶發酵方法復篩，最終獲得高產菌落。
[0012]2、步驟(1)或步驟(2)或步驟(4)斜面養基的配方為:葡萄糖10g，硝酸銨12g，硫酸鎂2.5g，磷酸二氫鉀0.25g，酵母浸粉4.5g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0-7.2。步驟(3)或步驟(4)的平板培養基的配方為:葡萄糖10g，硝酸銨12g，硫酸鎂0.3g，磷酸二氫鉀0.25g，酵母浸粉4.5g，瓊脂粉20g,加水定容至1000ml,調pH值至
7.0-7.2。步驟(3)或步驟(4)的種子液培養基的配方為:葡萄糖2.4g，硝酸銨2.4g，硫酸鎂0.6g，磷酸二氫鉀0.80g，酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。
[0013]3、步驟(1)或步驟(2)步驟(3)或步驟(4)斜面和平板的培養條件為:溫度為29±1°C，濕度為30-60%， 平板培養周期為6天，斜面培養周期為4天。[0014]4、步驟(3)或步驟(4)的種子液培養基的配方為:葡萄糖2.4g，硝酸銨2.4g，硫酸鎂0.6g，磷酸二氫鉀0.80g，酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。其培養條件為29°C，220轉/分，16小時。
[0015]5、步驟(3)或步驟(4)的搖瓶種子瓶培養基的配方為:葡萄糖2.4g，硝酸銨2.4g，硫酸鎂0.6g，磷酸二氫鉀0.80g，酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。
[0016]搖瓶發酵培養基配方為:葡萄糖30g，酵母浸粉24g，硫酸鎂2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸亞鐵0.005g，碳酸鈣10g，植物留醇50g，PEG60g，樹脂60g，加水定容至1000ml，調pH值至 7.0。
[0017]6、步驟(3)或步驟(4)的搖瓶發酵是將種子培養基中培養成熟的種子液按接種量為10%接入發酵搖瓶培養基中。
[0018]7、步驟(3)或步驟(4)的搖瓶種子液培養條件為:29°C，220轉/分，振蕩培養32-36h。步驟(3)或步驟(4)的搖瓶發酵液培養條件為:29°C，220轉/分，振蕩培養168h。
[0019]8、步驟(3)或步驟(4)的搖瓶發酵液培養成熟后其效價檢測方法為高效液相色譜法:
色譜條件:色譜柱:Kromasil C18 5Mm 200X4.6mm,流動相:CH30H:H2O = 80:20 (v/v),流速:1.0ml/min，檢測波長:242nm。
[0020]標準曲線的測定:
配制一系列不同濃度的AD標準溶液(50-500μ8/πι1)，分別取各濃度標準溶液的過濾液20μ1注入高效液相色譜儀中，測定其吸收峰面積，然后對濃度(Y)和吸收峰面積(X)進行一元線性回歸，得到一元線性回歸方程。
[0021]效價計算方法:
將待測樣品制成合適濃度(50-50(^g/ml)的甲醇溶液，用0.45Mm的微孔濾膜過濾，準確吸取濾液20μ1注入HPLC中，記錄色譜圖，將AD峰面積代入上述的回歸方程中，計算得到樣品中AD量。
[0022]9、步驟(3)或步驟(4)的搖瓶發酵液培養成熟后植物留醇轉化率計算方法:發酵完成后，發酵液經甲醇處理后，再用液相色譜定量測出雄烯二酮的含量，然后計算植物甾醇的轉化率:轉化率/%=發酵液中AD含量*100/ (投料油中留醇含量*0.66*0.95)。
[0023]10、一級種子罐培養基配方:葡萄糖9g，硝酸銨9g，硫酸鎂2.25g，磷酸二氫鉀
2.25g，酵母浸粉45g，加水定容至2L，調pH值至7.0。
[0024]發酵罐培養基配方為:葡萄糖500g，酵母浸粉375g，硝酸銨125g，硫酸鎂50g，磷酸氫二鉀30g，硫酸亞鐵0.125g，碳酸鈣25g，植物留醇1250g，樹脂1500g，加水定容至20L，調pH值至7.0。
[0025]11、將培養成熟的分枝桿菌種子液按照10% (V/V)的接種量接入50L發酵罐中，300C，220轉/分，通氣培養7天左右，得雄烯二酮，利用HPLC測定效價。
[0026]本發明的優點:
1、本發明通過微生物發酵提取“AD”其工業化生產技術有著誘人的前景，不僅可從根本上改變傳統化學合成留體藥物步驟多、得率低、價格貴等不足之處，還可充分利用和發揮資源優勢，擺脫原材料來源因季節、地域等自然因素對生產的制約，對保護自然資源和生態環境、維護人類健康起重大作用。[0027]2、本發明通過三種誘變方法、四次誘變、兩次篩選，得到對植物留醇降解速率較高的突變分枝桿菌。通過本方法得到植物留醇降解菌在底物留醇濃度為5%，樹脂濃度為6%的基礎下50L發酵罐放罐平均效價可達25-30g/ml，對植物留醇的轉化率為86.8%。這樣在生產過程中就會大大降低生產成本。
[0028]本發明是通過下列技術措施來實現的:
1制備材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種
菌種來源:DY20111816-102 (山東東藥藥業股份有限公司)
1.1.2儀器與分析條件
HPLC:安捷倫-1260,色譜條件:色譜柱---Kromasil C18 5Mm 200X4.6mm
流動相---CH3OHiH2O = 80:20 (v/v),流速---1.0ml/min,檢測波長---242nm。試
劑:雄留-4-烯-3，17-二酮(AD)標準品和甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。含量用外標峰面積法計算。
[0029]1.2實施方法
1.2.1培養基
斜面和平板培養基:葡萄糖10g，硝酸銨12g，硫酸鎂2.5g，磷酸二氫鉀0.25g，酵母浸粉
4.5g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0-7.2。
[0030]種子瓶培養基:
葡萄糖2.4g,硝酸銨2.4g,硫酸鎂0.6g,磷酸二氫鉀0.80g,酵母浸粉15g,加水定容至1000ml，調 pH 值至 7.0。
[0031]發酵瓶培養基:葡萄糖30g，酵母浸粉24g，硫酸鎂2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸亞鐵
0.005g，碳酸鈣10g，植物甾醇50g，PEG60g，樹脂60g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。
[0032]一級種子罐培養基配方:葡萄糖9g，硝酸銨9g，硫酸鎂2.25g，磷酸二氫鉀2.25g，酵母浸粉45g，加水定容至2L，調pH值至7.0。
[0033]發酵罐培養基配方為:葡萄糖500g，酵母浸粉375g，硝酸銨125g，硫酸鎂50g，磷酸氫二鉀30g，硫酸亞鐵0.125g，碳酸鈣25g，植物留醇1250g，樹脂1500g，加水定容至20L，調pH值至7.0。
[0034]1.2.2培養條件:
平板和斜面:溫度為29 ± I °C，濕度為30-60%，平板培養周期為5-7天，斜面培養周期為4-5 天。
[0035]搖瓶種子:29°C ±1，220轉/分，振蕩培養32_36h。
[0036]搖瓶發酵液培養條件為:29±1°C，220轉/分，振蕩培養168h。
[0037]1.2.3制備技術一誘變處理
(I)離子束輻照誘變:將預培養后的植物留醇降解菌制備成菌體量為I X IO6個/mL的菌懸液進行離子束輻照誘變:誘變溫度為25°C，誘變劑量為50Gy誘變后立即涂培養基斜面。
[0038](2)紫外誘變:斜面成熟后制備種子液，種子液接種后培養14_16h后涂平板進行紫外誘變:先用15W功率的紫外燈管和固定距離為20cm的條件下進行分劑量照射，照射劑量為0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，誘變后再經培養基平板初篩和搖瓶發酵方法復篩，
獲得高產菌落。
[0039](3)紫外激光復合誘變:對該高產菌落再進行制備斜面、種子液，種子液接種后培養14-16h后涂平板再次進行紫外與激光復合誘變:用15W功率的紫外燈管和固定距離為20cm的條件下進行照射2分鐘，隨后立即避光轉移自激光處理裝置中用YAG倍頻脈沖激光照射，輻照次數分別為200、400、600、800、1000、1200。誘變后再經培養基平板初篩和搖瓶發酵方法復篩，最終獲得高產菌落。
[0040]2試驗結果及分析
2.1離子束輻照誘變
將預培養后的植物留醇降解菌制備成菌體量為I X IO6個/mL的菌懸液在誘變溫度為25°C，誘變劑量為50Gy的條件下進行誘變，誘變結束后立即涂培養基斜面。斜面成熟后菌層較對照組厚，顏色更重。
[0041]2.2紫外誘變
隨機挑選一定數量經不同劑量紫外光照射的單菌落進行篩選。結果發現，雖然正突變率隨誘變菌株死亡率的增加而提高，但正突變幅度最高的菌種出現在低劑量照射組(表1)。
[0042]表1 紫外誘變結果
【權利要求】
1.一種通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征依次包括以下步驟: (1）以植物留醇降解菌為出發菌株，將植物留醇降解菌在斜面培養基上預培養4天； (2)將預培養后的植物留醇降解菌制備成菌體量為I X IO6個/mL的菌懸液進行離子束輻照誘變:誘變溫度為25°C，誘變劑量為50Gy誘變后立即涂培養基斜面；(3)斜面成熟后制備種子液，種子液接種后培養14_16h后涂平板進行紫外誘變:用15W功率的紫外燈管和固定距離為20cm的條件下進行分劑量照射，照射劑量為0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，誘變后再經培養基平板初篩和搖瓶發酵方法復篩，獲得高產菌落； (4)對該高產菌落再進行制備斜面、種子液，種子液接種后培養14-16h后涂平板再次進行紫外與激光復合誘變:用15W功率的紫外燈管和固定距離為20cm的條件下進行照射2分鐘，隨后立即避光轉移至激光處理裝置中用YAG倍頻脈沖激光照射，輻照次數分別為200,400,600,800,1000,1200 ;誘變后再經培養基平板初篩和搖瓶發酵方法復篩，最終獲得高產菌落。
2.根據權利要求1所述的通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征在于:步驟(1)或步驟(2)或步驟(4)斜面養基的配方為:葡萄糖10g，硝酸銨12g，硫酸鎂2.5g，磷酸二氫鉀0.25g，酵母浸粉4.5g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0-7.2 ;步驟(3)或步驟(4)的平板培養基的配方為:葡萄糖10g，硝酸銨12g，硫酸鎂0.3g，磷酸二氫鉀0.25g，酵母浸粉4.5g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0-7.2 ;步驟(3)或步驟(4)的種子液培養基的配方為:葡萄糖2.4g，硝酸銨2.4g，硫酸鎂0.6g，磷酸二氫鉀0.80g，酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。
3.根據權利要求1所述的通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征在于:步驟(1)或步驟(2)步驟(3)或步驟(4)斜面和平板的培養條件為:溫度為29± 1°C，濕度為30-60%，平板培養周期為5-7天，斜面培養周期為4-5天。
4.根據權利要求1所述的通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征在于:步驟(3)或步驟(4)的種子液培養基的配方為:葡萄糖2.4g，硝酸銨2.4g，硫酸鎂0.6g，磷酸二氫鉀0.80g,酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0 ;其培養條件為30。。，220轉/分，16小時，濕度為30-60%。
5.根據權利要求1所述的通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征在于:步驟(3)或步驟(4)的搖瓶種子瓶培養基的配方為:葡萄糖2.4g，硝酸銨2.4g，硫酸鎂0.6g，磷酸二氫鉀0.80g,酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，調pH值至7.0 ;搖瓶發酵培養基的配方為:葡萄糖30g，酵母浸粉24g，硫酸鎂2g,磷酸氫二鉀2g,硫酸亞鐵0.005g,碳酸鈣IOg,植物留醇50g, PEG60g,樹脂60g,加水定容至1000ml，調pH值至7.0。
6.根據權利要求1所述的通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征在于:步驟(3)或步驟(4)的搖瓶發酵是將種子培養基中培養成熟的種子液按接種量為10%接入搖瓶發酵培養基中。
7.根據權利要求6所述的通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征在于:步驟(3)或步驟(4)的搖瓶種子液培養條件為:30°C，220轉/分，振蕩培養32-36h ;步驟(3)或步驟(4)的搖瓶發酵液培養條件為:30°C，220轉/分，振蕩培養168h。
8.根據權利要求7所述的通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征在于:步驟(3)或步驟(4)的搖瓶發酵液培養成熟后其效價檢測方法為高效液相色譜法: 色譜條件:色譜柱:Kromasil C18 5Mm 200X4.6mm,流動相:CH3OH:H2O = 80:20(v/v),流速:1.0ml/min，檢測波長:242nm ； 標準曲線的測定: 配制一系列不同濃度的AD標準溶液(50-50(^g/ml)，分別取各濃度標準溶液20μ1注入高效液相色譜儀中，測定其吸收峰面積，然后對濃度(Y)和吸收峰面積(X)進行一元線性回歸，得到一元線性回歸方程； 效價計算方法: 將待測樣品制成合適濃度(50-50(^g/ml)的甲醇溶液，用0.45Mm的微孔濾膜過濾，準確吸取濾液20μ1注入HPLC中，記錄色譜圖，將AD峰面積代入上述的回歸方程中，計算得到樣品中AD量。
9.根據權利要求7所述的通過對一種分枝桿菌進行復合誘變來提高其對植物留醇降解速率制備“雄烯二酮”的方法，其特征在于:步驟(3)或步驟(4)的搖瓶發酵液培養成熟后植物留醇轉化率計算方法:發酵完成后，發酵液經甲醇處理后，再用液相色譜定量測出雄烯二酮的含量，然后計算植物留醇的 轉化率:轉化率/%=發酵液中AD含量*10(V(投料油中甾醇含量 *0.66*0.95。
【文檔編號】C12R1/32GK103667247SQ201210361827
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月26日 優先權日:2012年9月26日
【發明者】程傳東, 李瑾, 沈玲霞, 張敏, 劉紅麗 申請人:山東方明藥業集團股份有限公司