一種鑒定子鼠基因型的pcr方法
【專利摘要】本發明涉及一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，包括：（1）通過Blast兩種品系小鼠的線粒體序列，找到4個SNP位點，選取其中一個位點以子代小鼠線粒體DNA為模板進行PCR擴增；（2）PCR結束后對PCR產物凝膠電泳檢測，若出現陽性條帶，則進行LDR反應；其中，LDR反應中，每一個SNP位點設計三條探針；（3）LDR結束后，對LDR產物進行凝膠電泳檢測，電泳結束后，利用軟件提取泳道數據，即可。本發明通過鑒定子代小鼠母本，比較子代表型差異，將母體效應和基因類型聯系起來，補充了以往研究中通過改變孕鼠的營養狀況或藥物激素暴露等方式，從環境因素揭示母體效應的不足，擴展了人們對母體效應的遺傳學機制的認識。
【專利說明】—種鑒定子鼠基因型的PCR方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于小鼠遺傳學領域，特別涉及一種鑒定子鼠基因型的PCR方法。
【背景技術】
[0002]性發育是指個體性成熟并獲得生殖能力的過程。下丘腦-垂體-性腺軸系統的重新激活對哺乳動物性發育的啟動起著決定性的作用。該性狀是一個復雜性狀，在個體水平上受多種遺傳因素和環境因素的影響。性發育的啟動除了受個體本身的基因型影響外，還受到母體效應的影響。母體效應主要包含兩方面的因素，胚胎發育的子宮環境以及由于父本及母本來源的不同所產生的基因印跡的影響。
[0003]流行病學調查發現，母親的身高能直接影響胎兒的大小，同母異父的同胞出生體重的相似性小于同父異母的同胞的出生體重(Gluckman PD, Hanson MA (2004), Maternalconstraint of fetal growth and its consequences.，Semin Fetal NeonatalMed9:419 - 425);另外，試管嬰兒的出生體重只與受體母親的體重有關而與供卵母親的體重無關(Brooks AA, Johnson MR, Steer PJ, Pawson ME, Abdalla HI (1995), Birthweight:nature or nurture?Early Hum Dev42:29 - 35)。大鼠實驗顯不，在妊娠過程中給予母鼠低蛋白飲食，會導致雌性后代陰門開啟時間延遲；而以6-不飽和脂肪酸喂飼妊娠期雌鼠，其雌性后代的陰門開啟時間提前；而給妊娠期雌鼠注射雌激素，會導致其雌性后代的性發育時間提前并增加患乳腺癌的風險(Hilakiv1-Clarke L, Clarke R, Onojafe I, RaygadaM, CHO E, Lippman M, (1997)A maternal diet high in n26polyunsaturated fats altersmammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female ratoffspring Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.94:9372 - 9377)。
[0004]早期胚胎中基因的表達還受到基因印跡的調控，基因印記對個體出生前后的發育，行為和疾病都發揮作用。有.研究表明，小鼠的父源性印跡基因Pgel表現出很強的方向性和親源效應，父系為Pgel (中胚層特異性轉錄的)突變的小鼠表現出發育遲緩，而且雌性多為不育，而這種表型與其本身的基因型無關(Lefebvre, L., S.Viville, S.C.Barton, F.1shino,E.B.Keverne et al., (1998), Abnormal maternal behaviour andgrowth retardation associated with loss of the imprinted gene Mest.Nat.Genet.20:163 - 169)。與此相似的是小鼠父源性基因3的突變會影響子代的胚胎發育和出生后的生長(Curley, J.P.，S.Barton, A.Surani and E.B.Keverne, (2004), Coadaptationin mother and infant regulated by a paternally expressed imprinted gene.Proc.R.Soc.Lond.Ser.B271:1303 - 1309)。
[0005]目前，研究性發育調控的母體因素多從營養學角度來進行，一般采用對孕期母本的營養攝入改變或激素藥物暴露來研究胚胎發育環境對子代出生后性狀的影響，沒有涉及母本基因背景的影響研究。

【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，該方法通過鑒定子代小鼠母本，比較子代表型差異，將母體效應和基因類型聯系起來，補充了以往研究中通過改變孕鼠的營養狀況或藥物激素暴露等方式，從環境因素揭示母體效應的不足，擴展了人們對母體效應的遺傳學機制的認識。
[0007]本發明的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，包括:
[0008](I)通過Blast兩種品系小鼠的線粒體序列，找到4個SNP位點，選取其中一個位點以子代小鼠線粒體DNA為模板進行PCR擴增；其中，PCR引物為:
[0009]上游引物:5，-CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3，；
[0010]下游引物:5，-TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3，；
[0011](2) PCR結束后對PCR產物凝膠電泳檢測，若出現陽性條帶，則進行LDR反應；其中，LDR反應中，每一個SNP位點設計三條探針,一條為位點通用探針(Allele-universalprobe)可以與模板完全配對，其5’端磷酸化，3’端用FAM熒光標記；另外兩條位點特異性探針(Allele-specific probes)分別對應該多態性位點的兩種等位基因,位點特異性探針的長度相差若干堿基，從而導致其連接產物長度亦有同樣的差異，在377測序系統上，兩種不同長度的連接產物將表現為不同位置的峰，從而得到鑒別；本發明采用的特異性探針是:
[0012]mtDNA_G: TTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAC ；
[0013]mtDNA_A: TTTTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAT ；
[0014](3 )LDR結束后，對LDR產物進行凝膠電泳檢測，電泳結束后，利用軟件提取泳道數據，即可。
[0015]所述步驟(I)中的兩.種品系小鼠分別為B6C3HF1和C3HB6F1。
[0016]所述步驟(I)中作為模板的SNP位點為G9349A。
[0017]所述步驟(I)中的PCR 擴增反應條件為:95°C 15min,94°C 30s, 55 °C lmin,72°C lmin，72°C lOmin，共 35 個循環。
[0018]所述步驟(2)中的凝膠電泳檢測為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0019]所述步驟(2)中的LDR反應體系為:ddH205.95 μ L，10XLDR Bufferl μ L，探針總體積I μ L, Taq DNA連接酶0.05 μ L, PCR產物2 μ L，總體積10 μ L。
[0020]所述步驟(2)中的LDR反應條件為:94°C 2min，94°C 30s, 50°C 2min，共35個循環。[0021 ] 所述步驟(3 )中的凝膠電泳檢測為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
[0022]有益.效果
[0023]本發明通過鑒定子代小鼠母本，比較子代表型差異，將母體效應和基因類型聯系起來，補充了以往研究中通過改變孕鼠的營養狀況或藥物激素暴露等方式，從環境因素揭示母體效應的不足，擴展了人們對母體效應的遺傳學機制的認識。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為B6C3HF1的小鼠LDR分型結果圖，分子片段大小為82bp ；
[0025]圖2為C3HB6F1的小鼠LDR分型結果圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0027]實施例1
[0028]通過Blast兩種品系小鼠(B6C3HF1和C3HB6F1)的線粒體序列，找到4個SNP位點，選取其中一個位點(G9349A)以子代小鼠線粒體DNA為模板進行PCR擴增；PCR擴增反應條件為:95°C 15min，94°C 30s, 55 °C lmin, 72 °C lmin, 72 °C lOmin，共 35 個循環；其中，PCR引物為:上游引物:5’ - CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3’ ；下游引物:5， -TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3，；
[0029]PCR結束后，取8μ I PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現陽性條帶，則進行LDR反應。
[0030]LDR反應中，每一個多態性位點需設計三段探針。其中一條位點通用探針(Allele-universalprobe)可以與模板完全配對,其5’端磷酸化,3’端用FAM突光標記；另外兩條位點特異性探針(Allele-specific probes)分別對應該多態性位點的兩種等位基因。位點特異性探針的長度相差若干堿基，從而導 致其連接產物長度亦有同樣的差異。在377測序系統上，兩種不同長度的連接產物將表現為不同位置的峰，從而得到鑒別。
[0031 ] 本實施例使用的LDR探針:
【權利要求】
1.一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，包括: (1)通過Blast兩種品系小鼠的線粒體序列，找到4個SNP位點，選取其中一個位點以子代小鼠線粒體DNA為模板進行PCR擴增；其中，PCR引物為: 上游引物:5 ’ -CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3，； 下游引物:5’ -TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3’ ； (2)PCR結束后對PCR產物凝膠電泳檢測，若出現陽性條帶，則進行LDR反應；其中，LDR反應中，每一個SNP位點設計三條探針，一條為位點通用探針，另外兩條位點特異性探針分別為:
mtDNA_G: TTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAC ；
mtDNA_A: TTTTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAT ； (3)LDR結束后，對LDR產物進行凝膠電泳檢測，電泳結束后，利用軟件提取泳道數據，即可。
2.根據權利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(I)中的兩種品系小鼠分別為B6C3HF1和C3HB6F1。
3.根據權利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(I)中作為模板的SNP位點為G9349A。
4.根據權利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(I)中的 PCR擴增反應條件為:95V 15min,94°C 30s,55°C lmin,72°C lmin,72°C lOmin，共 35 個循環。
5.根據權利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(2)中的凝膠電泳檢測為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
6.根據權利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(2)中的LDR反應體系為:ddH205.95 μ L, IOXLDR Bufferl μ L，探針總體積I μ L，Taq DNA連接SI 0.05 μ L, PCR 產物 2 μ L，總體積 10 μ L0
7.根據權利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(2)中的LDR反應條件為:94°C 2min,94°C 30s, 50°C 2min，共35個循環。
8.根據權利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(3)中的凝膠電泳檢測為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436603SQ201310296488
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月15日 優先權日:2013年7月15日
【發明者】周宇荀, 管清華, 肖君華, 李凱 申請人:東華大學