一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是核酸擴(kuò)增與檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管。此外，本發(fā)明還涉及一種擴(kuò)增和檢測核酸的方法，其包括使用本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管。此外，本發(fā)明還涉及包含所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管的試劑盒，以及所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管用于制備試劑盒的用途。
【專利說明】一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是核酸擴(kuò)增與檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及 一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管。此外，本發(fā)明還涉及一種擴(kuò)增和檢測核酸的方法，其 包括使用本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管。此外，本發(fā)明還涉及包含所述全封閉 一體式核酸擴(kuò)增與檢測管的試劑盒，以及所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管用于制備試 劑盒的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（以下簡稱PCR技術(shù))，是一種在體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)，其 通常包括多個循環(huán)，每個循環(huán)包括變性、退火和延伸三個步驟，并且在理想狀態(tài)下，每經(jīng)過 一個循環(huán)，目的核酸分子的數(shù)目就擴(kuò)增一倍。一般而言，經(jīng)過30-40個循環(huán)后，目的核酸分 子數(shù)目就能擴(kuò)增到原來的近IO 9倍。因此，PCR是體外大量獲得目的DNA片段的最有效方 法，并且所獲得的核酸分子可用于進(jìn)一步的分析和檢驗。
[0003] 目前，PCR技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。例如，在基礎(chǔ)研究中，PCR 作為一個"無細(xì)胞基因擴(kuò)增系統(tǒng)"，可用于克隆基因，并由此可對基因組DNA進(jìn)行直接序列 分析，檢測突變位點，分析染色體重組等。在應(yīng)用研究中，PCR則可以用于傳染病的診斷、 遺傳疾病的檢測、產(chǎn)前診斷、法醫(yī)研究等。美國專利4, 683, 202 ;4, 683, 159 ;4, 800, 159 ; 4, 965, 188等已對PCR技術(shù)做出了詳細(xì)描述。
[0004] DNA的體內(nèi)擴(kuò)增是指，在細(xì)胞內(nèi)有關(guān)因子的參與下，雙螺旋的DNA分子被解鏈成2 條單鏈，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物與單鏈DNA堿基互補配對，形成引物單鏈DNA 復(fù)合物；在DNA聚合酶作用下，沿著5' -3'方向，按堿基互補配對原則，在引物3'端開始， 逐一將互補的三磷酸脫氧核苷酸接上，最終形成一條新的雙鏈DNA分子。
[0005] DNA分子的體外PCR擴(kuò)增模擬了體內(nèi)的三個步驟：首先，在大約95°C的高溫下加 熱雙鏈DNA分子，以使雙鏈間的氫鍵斷裂，從而使得DNA熱分解成兩條互補的單鏈DNA分子 (這一過程稱為高溫解鏈反應(yīng)）；然后，溫度迅速降到大約50-65°C的范圍內(nèi)，在這個溫度下 單鏈DNA與引物按堿基互補配對原則結(jié)合(這一過程稱為低溫退火反應(yīng));退火反應(yīng)結(jié)束后， 溫度又迅速升高到72°C左右，在這個溫度下，在DNA聚合酶以及適當(dāng)鎂離子濃度的條件下， 從引物的3'端開始結(jié)合單核苷酸，從而形成一條新的DNA (這一過程稱為延伸反應(yīng))。經(jīng)過 一個這樣的過程，原來的一個DNA雙鏈分子就形成了兩個DNA分子，增加了一倍。反復(fù)進(jìn)行 高溫解鏈-低溫退火-中溫延伸三個過程，就可以獲得數(shù)量更多的復(fù)制雙鏈，并且這些新形 成的雙鏈又可以作為下次循環(huán)的模板。
[0006] 通過這樣一種循環(huán)擴(kuò)增方法，經(jīng)過30-40個循環(huán)，目的核酸分子數(shù)目可由1個增加 到原來的近IO 9倍。然而，PCR的高靈敏度始終伴隨著這樣的弊端，S卩，其極其容易被污染。 僅僅1個DNA拷貝的污染就可能會導(dǎo)致獲得錯誤的檢測結(jié)果。因此，為了避免檢測過程中 的樣品污染，國家衛(wèi)生部明確規(guī)定：PCR臨床診斷必須將樣品處理、擴(kuò)增和檢測在分割的房 間進(jìn)行，而且物流是從樣品處理，擴(kuò)增至檢測一個方向進(jìn)行，否則擴(kuò)增后的試管不能進(jìn)行開 放檢測。
[0007] 因此，如何在PCR的全過程中避免污染也是現(xiàn)今核酸擴(kuò)增和檢測領(lǐng)域的一個重要 研究方向，并且也取得了很多的進(jìn)展。例如，熒光PCR的出現(xiàn)使得對核酸產(chǎn)物的檢測避免了 開管取樣的步驟，從而大大減少了核酸產(chǎn)物污染的機會。另外，UNG酶的使用也避免了 PCR 過程中核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。然而，以上所述方法均需要昂貴的試劑或精密的儀器，且操作 復(fù)雜，不適宜用于核酸的現(xiàn)場快速檢測。
[0008] 因此，本領(lǐng)域仍然迫切需要一種操作簡單、快速、成本低廉、能夠有效避免核酸擴(kuò) 增和檢測過程中的污染的方法和裝置。為此，本發(fā)明開發(fā)出了一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增 與檢測管。當(dāng)使用本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測時，在核 酸擴(kuò)增后無需開管即可進(jìn)行核酸檢測，從而有效避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的外泄以及擴(kuò)增和檢測中 的污染。此外，使用本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測時，操作 簡單、成本低廉、無須使用昂貴的試劑或精密的儀器，從而，本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò) 增與檢測管可廣泛應(yīng)用于核酸的體外診斷，且特別適宜用于核酸的現(xiàn)場快速檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實驗室操作步 驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語 的定義和解釋。
[0010] 如本文中所使用的，術(shù)語"擴(kuò)增"應(yīng)從廣義上來理解，其包括從RNA或DNA獲得DNA 的過程，并且包括但不限于PCR反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以及其各種變型(例如實時PCR反應(yīng))。
[0011] 如本文中所使用的，術(shù)語"全封閉"是指，當(dāng)擴(kuò)增管（1)和檢測管（2)組裝完畢時， 二者構(gòu)成一個完全封閉的環(huán)境。
[0012] 在一個方面，本發(fā)明提供了一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管，其包括相互配 合的用于完成擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增管（1)，和用于對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和結(jié)果判讀的檢測管 (2)，其中擴(kuò)增管（1)與檢測管（2)是密閉連接的，并且擴(kuò)增管（1)位于檢測管（2)的下方， 并且檢測管（2 )包括固定在試紙條容納固定區(qū)（7 )中的試紙條（6 )。
[0013] 在一個優(yōu)選的實施方案中，擴(kuò)增管（1)和檢測管（2)通過螺紋卡口結(jié)構(gòu)、環(huán)狀卡口 結(jié)構(gòu)或凸點鎖扣結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)密閉連接。
[0014] 在一個優(yōu)選的實施方案中，擴(kuò)增管（1)包括儲液區(qū)（3)及核酸擴(kuò)增區(qū)（4)，其中儲 液區(qū)（3)位于核酸擴(kuò)增區(qū)（4)的上方。任選地，儲液區(qū)（3)中預(yù)裝有用于核酸擴(kuò)增的試劑， 例如但不限于，引物，dNTP混合物，酶(例如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)，探針，內(nèi)標(biāo)、緩沖液等。
[0015] 在一個優(yōu)選的實施方案中，擴(kuò)增管（1)是適用于雷諾-本納德對流PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增 管。雷諾-本納德對流PCR擴(kuò)增是指，利用自然對流（即雷諾-本納德對流）原理進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的方法。該技術(shù)是將PCR反應(yīng)液置于一個封閉的柱形反應(yīng)腔內(nèi)，反應(yīng)腔的上下表面分 別進(jìn)行恒溫控制，通常上端溫度為60°C，下端溫度為97°C。通過上下表面的溫差驅(qū)動液體 經(jīng)過不同的溫區(qū)，實現(xiàn)PCR擴(kuò)增。這種方法不需要改變器件的溫度，也不需要外加驅(qū)動來 實現(xiàn)樣品的流動，只需要一個反應(yīng)腔，并控制其上下兩端的溫度為恒溫，就可以實現(xiàn)PCR擴(kuò) 增。因此，該方法具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點。
[0016] 因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，擴(kuò)增管（I)是適用于雷諾-本納德對流PCR擴(kuò)增 的擴(kuò)增管，其包括儲液區(qū)（3)及核酸擴(kuò)增區(qū)（4)，其中儲液區(qū)（3)位于核酸擴(kuò)增區(qū)（4)的上 方。
[0017] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)（4)的高度/內(nèi)徑比值為3 - 12。在 進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)（4)的高度/內(nèi)徑比值為6 - 9,所述核酸擴(kuò)增 區(qū)（4)的最大內(nèi)徑小于或等于10mm，且所述核酸擴(kuò)增區(qū)（4)的內(nèi)徑小于所述儲液區(qū)（3)的 內(nèi)徑。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)（4)的最大內(nèi)徑小于等于5mm。
[0018] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)（4)的內(nèi)腔為橫截面上寬下窄的錐狀 中空結(jié)構(gòu)或多層梯形中空結(jié)構(gòu)。
[0019] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)（4)的內(nèi)腔為上下內(nèi)徑相等的柱狀 中空結(jié)構(gòu)。
[0020] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)（4)上設(shè)有可見的體積刻度標(biāo)識。在 一個優(yōu)選的實施方案中，所述儲液區(qū)（3)的外壁上設(shè)有防滑溝槽。
[0021] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)（4)與儲液區(qū)（3)的連接處內(nèi)部為圓 滑導(dǎo)角結(jié)構(gòu)。
[0022] 在一個優(yōu)選的實施方案中，擴(kuò)增管（1)通過螺紋卡口（5)而和檢測管（2)密閉連 接。優(yōu)選地，螺紋卡口（5)位于儲液區(qū)（3)的內(nèi)部。然而，螺紋卡口（5)也可以位于儲液區(qū) (3)的外部。
[0023] 在一個優(yōu)選的實施方案中，試紙條（6)包括用于與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的樣品墊區(qū)（8) 及用于反應(yīng)和呈現(xiàn)結(jié)果的檢測區(qū)（9)。
[0024] 在本領(lǐng)域中，利用試紙條來檢測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法已得到良好建立。例如，一個 典型的方法是，在核酸擴(kuò)增過程中，使擴(kuò)增產(chǎn)物同時攜帶第一標(biāo)記和第二標(biāo)記(例如，通過 使用帶有第一標(biāo)記(例如FITC)的探針以及帶有第二標(biāo)記(例如生物素）的引物對樣品進(jìn)行 擴(kuò)增)，并且在試紙條的上游設(shè)置有可隨流體移動的、特異性識別第一標(biāo)記的檢測劑(例如 標(biāo)記有鼠 FITC抗體的乳膠顆粒)，在下游（S卩，檢測線處）固定有不可移動的、特異性識別第 二標(biāo)記的捕獲劑(例如鏈霉親和素)。由此，當(dāng)樣品中存在目的DNA時，在擴(kuò)增后將產(chǎn)生同時 攜帶第一標(biāo)記和第二標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物；該擴(kuò)增產(chǎn)物在流動通過試紙條時，首先結(jié)合檢測劑 形成擴(kuò)增產(chǎn)物/檢測劑復(fù)合物，然后該復(fù)合物進(jìn)一步被捕獲劑捕獲，并在固定捕獲劑的位 置處（即，檢測線處)積累，并最終顯現(xiàn)出有色條帶。另外，為了驗證試紙條的有效性，還可以 在檢測線的下游（即，質(zhì)控線處）固定特異性識別檢測劑的物質(zhì)(例如羊抗鼠二抗)，從而檢 測劑將在質(zhì)控線處被捕獲和積累，并顯現(xiàn)出有色條帶。此外，為了驗證擴(kuò)增過程的有效性， 還可以在擴(kuò)增過程中添加內(nèi)標(biāo)，并使內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶第一標(biāo)記和第三標(biāo)記(例如，通過 使用帶有第一標(biāo)記(例如FITC)的內(nèi)標(biāo)特異性探針和帶有第三標(biāo)記(例如地高辛）的內(nèi)標(biāo)特 異性引物)，并且在檢測劑下游、質(zhì)控線上游（即，內(nèi)標(biāo)線處）固定有不可移動的、特異性識別 第三標(biāo)記的捕獲劑(例如抗地高辛抗體)。由此，在擴(kuò)增過程中，內(nèi)標(biāo)將被擴(kuò)增并產(chǎn)生攜帶有 第一標(biāo)記和第三標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物移動通過試紙條時將結(jié)合檢測劑，并被特異 性識別第三標(biāo)記的捕獲劑所捕獲，從而在內(nèi)標(biāo)線處積累并顯色。關(guān)于檢測試紙條以及相關(guān) 檢測方法的詳細(xì)描述，可參見例如，中國專利申請200610109620. 4和Magda Anastassova Dineva 等人，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 2005 年 8 月，第 4015 - 4021 頁，其全 部公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0025] 因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，試紙條（6)的檢測區(qū)（9)包括測試線，其用于確 定目標(biāo)核酸分子是否存在于樣品中；并且任選地包括質(zhì)控線和/或內(nèi)標(biāo)線，其中所述質(zhì)控 線用于驗證試紙條本身的有效性；所述內(nèi)標(biāo)線用于驗證擴(kuò)增過程的有效性。在一個優(yōu)選的 實施方案中，試紙條（6 )的檢測區(qū)（9 )可包括一條或多條測試線，從而可用于單重或多重檢 測（即，檢測一種或多重目標(biāo)核酸分子)。
[0026] 在一個優(yōu)選的實施方案中，試紙條容納固定區(qū)（7)包括試紙條底座（10)和試紙條 上蓋（11 )，其中，試紙條底座部分（10)和試紙條上蓋部分（11)能夠密閉連接且將試紙條 (6)固定在其中。
[0027] 在一個優(yōu)選的實施方案中，試紙條底座部分（10)包括用于支撐試紙條（6)的橫隔 (12)、用于試紙條（6)定位的凹槽（13)、用于實現(xiàn)試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)與檢測區(qū)（9)物 理性分隔的橫隔（14)、用于實現(xiàn)檢測管（2)試紙條容納固定區(qū)（7)的試紙條底座部分（10) 的上方和試紙條上蓋部分（11)的上方密閉的凸條（15)、用于實現(xiàn)檢測管（2)的試紙條容納 固定區(qū)（7)的試紙條底座部分（10)的側(cè)邊和試紙條上蓋部分（11)的側(cè)邊密閉的凸點（16)、 用于與擴(kuò)增管（1)的螺紋卡口（5)配合的螺紋卡口（ 17);并且
[0028] 試紙條上蓋部分（11)包括用于將試紙條（6)卡緊的相對于橫隔（12)的橫隔（18)、 用于試紙條（6)定位的相對于凹槽（13)的凹槽（19)、用于實現(xiàn)試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)與 檢測區(qū)（9)物理性分隔的相對于橫隔（14)的橫隔（20)、用于實現(xiàn)檢測管（2)的試紙條容納 固定區(qū)（7)的試紙條底座部分（10)的上方和試紙條上蓋部分（11)的上方密閉的相對于凸 條（15)的凹槽（21)、用于實現(xiàn)檢測管（2)的試紙條容納固定區(qū)（7)的試紙條底座部分（10) 的側(cè)邊和試紙條上蓋部分（11)的側(cè)邊密閉的相對于凸點（16)的凹槽（22)、用于與擴(kuò)增管 (1)實現(xiàn)密閉的相對于螺紋卡口（ 17 )的螺紋卡口（ 23)。
[0029] 在一個優(yōu)選的實施方案中，試紙條上蓋部分（11)還包括用于觀測試紙條（6)的檢 測區(qū)（9)的透明視窗（24)。
[0030] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在將擴(kuò)增管（1)和檢測管（2)組裝完畢后，二者構(gòu)成一 個全封閉的環(huán)境，從而防止管內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物外泄，和避免可能的外來物質(zhì)的污染。
[0031] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在將擴(kuò)增管（1)和檢測管（2)組裝完畢后，通過超聲波 對各組裝部件進(jìn)行焊接，和/或，通過對所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管整體進(jìn)行包 膜處理，從而實現(xiàn)更優(yōu)的密閉效果。
[0032] 在一個優(yōu)選的實施方案中，擴(kuò)增管（1)或檢測管（2)由聚合材料制成。在一個優(yōu)選 的實施方案中，擴(kuò)增管（1)或檢測管（2)由玻璃或塑料制成。
[0033] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸是DNA或RNA。
[0034] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述擴(kuò)增是PCR反應(yīng)。
[0035] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述擴(kuò)增是逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0036] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增和檢測樣品中的目的核酸的方法，其包括 使用本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管。
[0037] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0038] a)在擴(kuò)增管（1)內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；
[0039] b)在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，倒轉(zhuǎn)全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管，并且在全封閉條件 下，使擴(kuò)增管（I)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測管（2)，并轉(zhuǎn)移至檢測試紙條（6)上，而無需打開一 體式核酸擴(kuò)增與檢測管；和
[0040] c)讀取試紙條（6)上的檢測結(jié)果。
[0041] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在步驟b)中通過離心或震動使擴(kuò)增管（1)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)入檢測管（2)，并接觸試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)，然后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)作用遷移經(jīng) 過試紙條（6)的檢測區(qū)（9)。
[0042] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在步驟c)中，優(yōu)選通過透明視窗（24)，優(yōu)選通過肉眼 讀取試紙條（6)上的檢測結(jié)果。
[0043] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在檢測結(jié)束后，不打開所述一體式核酸擴(kuò)增與檢測管， 并將其整體廢棄于安全處。
[0044] 在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟a)包括：
[0045] al)將待檢測的樣品和用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑添加至核酸擴(kuò)增區(qū)（4)，并且例如 通過離心或震動，使反應(yīng)混合物混勻；
[0046] a2)將檢測管（2)與擴(kuò)增管（1)密閉連接(例如通過螺紋卡口（5)、螺紋卡口（17) 和螺紋卡口（23));和
[0047] a3)將密閉連接后的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管插入擴(kuò)增儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
[0048] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸是DNA或RNA。
[0049] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述擴(kuò)增是PCR反應(yīng)。
[0050] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述擴(kuò)增是逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0051] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò) 增與檢測管。本發(fā)明的試劑盒可用于在全封閉的條件下，在同一管內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測。
[0052] 在另一個方面，還提供了本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管用于進(jìn)行核酸 擴(kuò)增和檢測的用途。核酸擴(kuò)增和檢測作為一個通用的平臺，可廣泛應(yīng)用于各個方面：例如， 其可用于非診斷目的，例如檢測不與疾病相關(guān)的特定基因或突變的存在；此外，其也可用于 診斷目的，例如傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測、產(chǎn)前診斷、法醫(yī)研究等等。
[0053] 在另一個方面，還提供了本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管用于制備試劑 盒的用途，所述試劑盒用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測。
[0054] 發(fā)明的有益效果
[0055] 本發(fā)明提供了一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管，以及在所述全封閉一體式管 內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增及檢測的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案將核酸擴(kuò)增與試紙檢 測整合至同一密閉式擴(kuò)增與檢測反應(yīng)管內(nèi)，其具有以下有益效果：
[0056] (1)在同一管內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增與試紙條檢測，即擴(kuò)增與檢測過程是全封閉的，可 有效防止核酸擴(kuò)增產(chǎn)物外泄，避免交叉污染，并且可有效避免核酸擴(kuò)增與檢測過程中的污 染；
[0057] (2)操作簡便、快速：不同于傳統(tǒng)的試紙條檢測方式(其在擴(kuò)增完成后還需進(jìn)行探 針添加、孵育和/或稀釋等步驟)，本發(fā)明所述的方法僅需在擴(kuò)增完成后倒轉(zhuǎn)反應(yīng)管，通過離 心、震動或其他方式，使擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測管，并與試紙條接觸，靜置數(shù)分鐘后即可進(jìn)行結(jié) 果觀測；
[0058] (3)成本低廉，有效地降低了核酸擴(kuò)增和檢測的高價格門檻。
[0059] 此外，本發(fā)明符合國家衛(wèi)生部門對核酸診斷試劑的相關(guān)規(guī)定，對核酸的現(xiàn)場快速 檢測具有重要的意義。
[0060] 下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人 員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖 和優(yōu)選實施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 將變得顯然。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0061] 圖1示意性顯示了全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管的結(jié)構(gòu)。其中，圖1A、圖1B、圖 IC分別呈現(xiàn)的是正視圖、側(cè)視圖及后視圖。圖ID呈現(xiàn)的是檢測管（2)的透視圖。
[0062] 圖2示意性說明了本發(fā)明的優(yōu)選全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管的結(jié)構(gòu)。圖2A 呈現(xiàn)的是全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管的正視方向分解圖，圖2B呈現(xiàn)的是全封閉一體 式核酸擴(kuò)增與檢測管的后視方向分解圖。其中，試紙條底座部分（10)的凹槽（13)及與其 相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的凹槽（19)，用于試紙條定位；試紙條底座部分（10)的橫 隔（12)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的橫隔（18)，用于試紙條（6)的支撐與卡緊； 試紙條底座部分（10)的橫隔（14)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的橫隔（20)，用于 實現(xiàn)試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)與檢測區(qū)（9)的物理性分隔；試紙條底座部分（10)的凸條 (15)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的凹槽（21 )，用于實現(xiàn)試紙條底座部分（10)與 試紙條上蓋部分（11)在上方的密閉；試紙條底座部分（10)的凸點（16)及與其相對應(yīng)的試 紙條上蓋部分（11)的凹槽（22)，用于實現(xiàn)試紙條底座部分（10)與試紙條上蓋部分（11)在 側(cè)邊的密閉；試紙條底座部分（10)的螺紋卡口（ 17)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11) 的螺紋卡口（23)，用于實現(xiàn)檢測管（2)與擴(kuò)增管（1)的密閉；試紙條上蓋部分（11)的透明 視窗（24)用于試紙條（6)的檢測結(jié)果觀測。
[0063] 圖3示意性說明了使用本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行核酸擴(kuò)增 與檢測的流程。
[0064] 圖4顯示了實施例2中使用全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行核酸擴(kuò)增與檢測 的結(jié)果。其中，圖4A顯示以HBV全長質(zhì)粒為范本的檢測結(jié)果：檢測線（T線)與質(zhì)控線（C線） 均呈紅色。質(zhì)控線（C線)呈紅色說明檢測有效，檢測線（T線)呈紅色說明檢測結(jié)果為陽性。 圖4B顯示以超純水為范本的檢測結(jié)果：檢測線（T線）不呈色，質(zhì)控線（C線）呈紅色。質(zhì)控 線（C線）呈紅色說明檢測有效，檢測線（T線）不呈色說明檢測結(jié)果為陰性。
[0065]圖5顯示了實施例3中使用全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行核酸擴(kuò)增與檢測 的結(jié)果。其中，圖5A顯示以HCV血清提取模板為范本的檢測結(jié)果：檢測線（T線）與質(zhì)控線 (C線）均呈紅色。質(zhì)控線（C線）呈紅色說明檢測有效，檢測線（T線）呈紅色說明檢測結(jié)果 為陽性。圖5B顯示以超純水為范本的檢測結(jié)果：檢測線（T線）不呈色，質(zhì)控線（C線）呈紅 色。質(zhì)控線（C線）呈紅色說明檢測有效，檢測線（T線）不呈色說明檢測結(jié)果為陰性。
[0066]圖6顯示了實施例4中使用全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行核酸擴(kuò)增與檢測 的結(jié)果。其中，圖6A顯示以HBV全長質(zhì)粒為范本的檢測結(jié)果：檢測線（T線)、內(nèi)標(biāo)線（I線） 與質(zhì)控線（C線）均呈紅色。內(nèi)標(biāo)線（I線）呈紅色說明擴(kuò)增有效，質(zhì)控線（C線）呈紅色說明 試紙條檢測有效，檢測線（T線)呈紅色說明檢測結(jié)果為陽性。圖6B顯示以超純水為范本的 檢測結(jié)果：檢測線（T線)不呈色，內(nèi)標(biāo)線（I線）與質(zhì)控線（C線)均呈紅色。內(nèi)標(biāo)線（I線)呈 紅色說明擴(kuò)增有效，質(zhì)控線（C線)呈紅色說明試紙條檢測有效，檢測線（T線)不呈色說明檢 測結(jié)果為陰性。圖6的結(jié)果還表明，本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管以及相關(guān)方 法適合用于多重檢測。

【具體實施方式】
[0067] 本發(fā)明提供了一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管。特別地，圖1和圖2顯示了 本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管的一種優(yōu)選實施方案，其包括相互配合的用于完 成擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增管（1)和用于對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和結(jié)果判讀的檢測管（2);其中，擴(kuò)增 管（1)包括位于上方的儲液區(qū)（3)及位于下方的核酸擴(kuò)增區(qū)（4)，其中儲液區(qū)（3)內(nèi)部有用 于與檢測管（2)實現(xiàn)密閉的螺紋卡口（5);檢測管（2)包括試紙條（6)及試紙條容納固定區(qū) (7)。
[0068] 在一個優(yōu)選的實施方案中，試紙條容納固定區(qū)（7)包括試紙條底座部分（10)和試 紙條上蓋部分（11)，用于容納和固定試紙條（6)。其中，試紙條底座部分（10)的凹槽（13) 及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的凹槽（19)，用于試紙條定位；試紙條底座部分（10) 的橫隔（12)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的橫隔（18)，用于試紙條（6)的支撐與卡 緊；試紙條底座部分（10)的橫隔（14)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的橫隔（20)，用 于實現(xiàn)試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)與檢測區(qū)（9)的物理性分隔；試紙條底座部分（10)的凸條 (15)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的凹槽（21 )，用于實現(xiàn)試紙條底座部分（10)與 試紙條上蓋部分（11)在上方的密閉；試紙條底座部分（10)的凸點（16)及與其相對應(yīng)的試 紙條上蓋部分（11)的凹槽（22)，用于實現(xiàn)試紙條底座部分（10)與試紙條上蓋部分（11)在 側(cè)邊的密閉；試紙條底座部分（10)的螺紋卡口（17)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11) 的螺紋卡口（23)，用于實現(xiàn)檢測管（2)與擴(kuò)增管（1)的密閉；試紙條上蓋部分（11)的透明 視窗（24)用于試紙條（6)的檢測結(jié)果觀測。
[0069] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在將擴(kuò)增管（1)與檢測管（2)組裝完畢后，可通過超聲 波對各組裝部件進(jìn)行焊接，和/或，通過對所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管整體進(jìn)行 包膜處理，以實現(xiàn)更優(yōu)的密閉效果。
[0070] 本發(fā)明還提供了一種擴(kuò)增和檢測樣品中的目的核酸的方法，其包括使用本發(fā)明的 全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管。特別地，圖3顯示了本發(fā)明方法的一種優(yōu)選實施方案，其 包括：
[0071] 1)將待檢測的樣品和用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑添加至擴(kuò)增管（1)的核酸擴(kuò)增區(qū) (4)，并且例如通過離心或震動，使反應(yīng)混合物混勻；
[0072] 2)通過螺紋卡口（5)、螺紋卡口（ 17)和螺紋卡口（23)將檢測管（2)與擴(kuò)增管（1) 密閉連接（即，扣合）；
[0073] 3)將密閉連接后的管插入擴(kuò)增儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增；
[0074] 4)在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取出全封閉一體式管；
[0075] 5)倒轉(zhuǎn)全封閉一體式管，并通過離心或震動使擴(kuò)增管（1)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測 管（2)，并轉(zhuǎn)移至檢測試紙條（6)上；和
[0076] 6)通過透明視窗（24)讀取試紙條（6)上的檢測結(jié)果。
[0077] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在檢測結(jié)束后，不打開所述一體式核酸擴(kuò)增與檢測管， 并將其整體廢棄于安全處。
[0078] 實施例
[0079] 現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明（而非限定本發(fā)明）的實施例來描述本發(fā)明。
[0080] 除非特別指明，本發(fā)明中所使用的分子生物學(xué)實驗方法和免疫檢測法，基本上 參照J(rèn). Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989,以及 F. M. Ausubel等人，精編分子生物學(xué)實驗指南，第3版，John Wiley&Sons, Inc.，1995中所述 的方法進(jìn)行；酶的使用依照產(chǎn)品制造商推薦的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實施例以舉例方 式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
[0081] 實施例1 :全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管
[0082] 如圖1和圖2所示，本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管包括相互配合的用 于完成擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增管（1)和用于對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和結(jié)果判讀的檢測管（2);其中， 檢測管（2)包括試紙條（6)及試紙條容納固定區(qū)（7)。在擴(kuò)增結(jié)束后，將全封閉一體式核酸 擴(kuò)增與檢測管從擴(kuò)增儀從取出，整管倒轉(zhuǎn)并通過離心、震動或其他方式，在全封閉條件下， 使擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增管（1)進(jìn)入檢測管（2)，并與其中的試紙條（6)接觸，而后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過 毛細(xì)現(xiàn)象向試紙條檢測區(qū)（9)遷移，并在檢測線和/或質(zhì)控線上發(fā)生抗原一抗體的特異性 免疫反應(yīng)。
[0083] 在本實施例中，全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管中的擴(kuò)增管（1)包括位于上方的 儲液區(qū)（3)及位于下方的核酸擴(kuò)增區(qū)（4)，其中儲液區(qū)（3)內(nèi)部有用于與檢測管（2)實現(xiàn)密 閉的螺紋卡口（5)。
[0084] 同時，全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管的檢測管（2)包括試紙條底座部分（10)和 試紙條上蓋部分（11 )，用于容納和固定試紙條（6 )。其中，試紙條底座部分（10 )的凹槽（13 ) 及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的凹槽（19)，用于試紙條定位；試紙條底座部分（10) 的橫隔（12)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的橫隔（18)，用于試紙條（6)的支撐與卡 緊；試紙條底座部分（10)的橫隔（14)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的橫隔（20)，用 于實現(xiàn)試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)與檢測區(qū)（9)的物理性分隔；試紙條底座部分（10)的凸條 (15)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11)的凹槽（21)，用于實現(xiàn)試紙條底座部分（10)與 試紙條上蓋部分（11)在上方的密閉；試紙條底座部分（10)的凸點（16)及與其相對應(yīng)的試 紙條上蓋部分（11)的凹槽（22 )，用于實現(xiàn)試紙條底座部分（10 )與試紙條上蓋部分（11)在 側(cè)邊的密閉；試紙條底座部分（10)的螺紋卡口（ 17)及與其相對應(yīng)的試紙條上蓋部分（11) 的螺紋卡口（23)，用于實現(xiàn)檢測管（2)與擴(kuò)增管（1)的密閉；試紙條上蓋部分（11)的透明 視窗（24)用于試紙條（6)的檢測結(jié)果觀測。
[0085] 另外，在將擴(kuò)增管（1)與檢測管（2)組裝完畢后，可通過超聲波對各組裝部件進(jìn)行 焊接，和/或，通過對所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管整體進(jìn)行包膜處理，以實現(xiàn)更優(yōu) 的密閉效果。
[0086] 實施例2 :應(yīng)用實施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行的、以DNA為模板 的擴(kuò)增與檢測
[0087] 1、實驗材料
[0088] 化學(xué)試劑：LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture (Roche, Germany)， 二價鎂離子，超純水
[0089] 儀器耗材：自制核酸擴(kuò)增儀(參見申請CN201110456811. 9);實施例1的全封閉一 體式核酸擴(kuò)增與檢測管，其中檢測管（2)中的試紙條（6)在上游設(shè)置了標(biāo)記有抗FITC鼠抗 體的乳膠顆粒，在下游的檢測線（T)上固定有鏈霉親和素（SA)，在更下游的質(zhì)控線（C)上固 定有羊抗鼠二抗（GAM-IgG)。
[0090] 引物：B3F (生物素標(biāo)記的）：
[0091] 5' -GGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGC-3'
[0092] B3R ：
[0093] 5, -AGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAGT-3，
[0094] 探針：B3T (FITC 標(biāo)記的）：
[0095] 5' -CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-3'
[0096] 檢測范本I :HBV全長質(zhì)粒，濃度為IO3拷貝/ml
[0097] 檢測范本2:超純水
[0098] 2、實驗方法：
[0099] a)擴(kuò)增試劑的配置：lpmol B3F，lpmol B3R，0? 25pmol B3T，4 u I LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture，4mM 二價緩離子，10 ul 檢測范本 1 或檢 測范本2,總體積40 ii 1,剩余體積用超純水補足。
[0100] b)核酸擴(kuò)增：將配置好的擴(kuò)增反應(yīng)混合物添加至擴(kuò)增管（1)的儲液區(qū)（3)中，將檢 測管（2)與擴(kuò)增管（1)扣合，并通過離心、振動或其他方式，使擴(kuò)增反應(yīng)混合物從儲液區(qū)（3) 流至核酸擴(kuò)增區(qū)（4)并混勻；將裝有擴(kuò)增反應(yīng)混合物的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管插 入自制核酸擴(kuò)增儀，進(jìn)行PCR核酸擴(kuò)增。
[0101] c)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：將全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管倒置并通過離心、振動或 其他方式，在全封閉條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增管（1)進(jìn)入檢測管（2)，并與試紙條（6)的樣 品墊區(qū)（8)接觸并被其吸附，而后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)現(xiàn)象向試紙條的檢測區(qū)（9)遷移，并 依次通過標(biāo)記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒、固定有鏈霉親和素（SA)的檢測線和固定有羊 抗鼠二抗（GAM-IgG)的質(zhì)控線，并在檢測線和質(zhì)控線上發(fā)生特異性相互作用。靜置5分鐘 后，即可通過透明檢測視窗（24 )肉眼觀測檢測結(jié)果。
[0102] 實施例2的檢測結(jié)果見圖4。圖4A顯示以HBV全長質(zhì)粒為范本的檢測結(jié)果：檢測 線（T線）與質(zhì)控線（C線）均呈紅色。質(zhì)控線（C線）呈紅色說明檢測有效，檢測線（T線）呈 紅色說明檢測結(jié)果為陽性。圖4B顯示以超純水為范本的檢測結(jié)果：檢測線（T線）不呈色， 質(zhì)控線（C線）呈紅色。質(zhì)控線（C線）呈紅色說明檢測有效，檢測線（T線）不呈色說明檢測 結(jié)果為陰性。
[0103] 實施例3 :應(yīng)用實施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行的、以RNA為模板 的擴(kuò)增與檢測
[0104] 1、實驗材料
[0105] 化學(xué)試劑：AccessQuick Master Mix (Promega)，AMV Reverse Transcriptase， DEPC 水。
[0106] 儀器耗材：自制核酸擴(kuò)增儀(參見申請CN201110456811. 9)、實施例I的全封閉一 體式核酸擴(kuò)增與檢測管，其中檢測管（2)中的試紙條（6)在上游設(shè)置了標(biāo)記有抗FITC鼠抗 體的乳膠顆粒，在下游的檢測線（T)上固定有鏈霉親和素（SA)，在更下游的質(zhì)控線（C)上固 定有羊抗鼠二抗（GAM-IgG)。
[0107] 引物：C3F (生物素標(biāo)記的）：
[0108] 5, -AGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGT G-3'
[0109] C3R : 5 ' -ACCTGGGGCCCCTGCGCGGCAACAAGTATA-3 '
[0110] 探針：C3T (FITC 標(biāo)記的）：5' -TCCTAAACCTCAAAGA-3'
[0111] 檢測范本I :HCV血清提取模板，濃度為IO4拷貝/ml
[0112] 檢測范本2:DEPC水。
[0113] 2、實驗方法：
[0114] a)擴(kuò)增試劑的配置：lpmol C3F，lpmol C3R，0? 25pmol C3T，20 u I AccessQuick Master Mix(Promega)，AMV Reverse Transcriptase8u，10iil 檢測范本 1 或檢測范本 2,總 體積40 ii 1,剩余體積用超純水補足。
[0115] b)核酸擴(kuò)增：將配置好的擴(kuò)增反應(yīng)混合物添加至擴(kuò)增管（1)的儲液區(qū)（3)中，將檢 測管（2)與擴(kuò)增管（1)扣合，并通過離心、振動或其他方式，使擴(kuò)增反應(yīng)混合物從儲液區(qū)（3) 流至核酸擴(kuò)增區(qū)（4)并混勻；將裝有擴(kuò)增反應(yīng)混合物的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管插 入自制核酸擴(kuò)增儀，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。
[0116] c)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：將全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管倒置并通過離心、振動或 其他方式，在全封閉條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增管（1)進(jìn)入檢測管（2)，并與試紙條（6)的樣 品墊區(qū)（8)接觸并被其吸附，而后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)現(xiàn)象向試紙條的檢測區(qū)（9)遷移，并 依次通過標(biāo)記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒、固定有鏈霉親和素（SA)的檢測線和固定有羊 抗鼠二抗（GAM-IgG)的質(zhì)控線，并在檢測線和質(zhì)控線上發(fā)生特異性相互作用。靜置5分鐘 后，即可通過透明檢測視窗（24)肉眼觀測檢測結(jié)果
[0117] 實施例3的檢測結(jié)果見圖5。圖5A顯示以HCV血清提取模板為范本的檢測結(jié)果： 檢測線（T線)與質(zhì)控線（C線)均呈紅色。質(zhì)控線（C線)呈紅色說明檢測有效，檢測線（T線） 呈紅色說明檢測結(jié)果為陽性。圖5B顯示以超純水為范本的檢測結(jié)果：檢測線（T線）不呈 色，質(zhì)控線（C線）呈紅色。質(zhì)控線（C線）呈紅色說明檢測有效，檢測線（T線）不呈色說明檢 測結(jié)果為陰性。圖4和5的結(jié)果表明，本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管以及相關(guān) 方法不僅適合用于DNA分子的擴(kuò)增與檢測，而且適用于RNA分子的擴(kuò)增與檢測。
[0118] 實施例4 :應(yīng)用實施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管進(jìn)行的、含內(nèi)標(biāo)監(jiān)控 的、以DNA為范本的擴(kuò)增與檢測
[0119] 1、實驗材料
[0120] 化學(xué)試劑：LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture (Roche, Germany)，二價緩離子，超純水
[0121] 儀器耗材：自制核酸擴(kuò)增儀(參見申請CN201110456811. 9);實施例1的全封閉一 體式核酸擴(kuò)增與檢測管，其中檢測管（2)中的試紙條（6)在上游設(shè)置了標(biāo)記有抗FITC鼠抗 體的乳膠顆粒，在下游的檢測線（T)上固定有鏈霉親和素（SA)，在內(nèi)標(biāo)線（I)上固定有抗地 高辛抗體，在更下游的質(zhì)控線（C)上固定有羊抗鼠二抗（GAM-IgG)。
[0122] 引物：B3F (生物素標(biāo)記的）：
[0123] 5' -GGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGC-3'
[0124] B3R : 5，-AGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAGT-3，
[0125] IF (地高辛標(biāo)記的）：
[0126] 5, -TTGGCGATGGCTGTATCTGTGGGCT-3'
[0127] IR :5' -AACGGACAAGCGGCAAACCTAGATTGTTA-3'
[0128] 探針：B3T (FITC 標(biāo)記的）：
[0129] 5' -CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-3'
[0130] IT (FITC 標(biāo)記的）：
[0131] 5, -GCCTCATCCTGCTTGTTGGTTAAGCTGA-3'
[0132] 內(nèi)標(biāo)：T-I (在 pMD-18T 載體中）
[0133] 5 ' -TTGGCGATGGCTGTATCTGTGGGCTGTTTTATCATCTTCCTCTGGCCTCATCCTGCTTGTTGGTTA AGCTGAGTTGGTTCTTCTGGTAACAATCTAGGTTTGCCGCTTGTCCGTT-3 ,
[0134] 檢測范本I :HBV全長質(zhì)粒，濃度為IO3拷貝/ml
[0135] 檢測范本2 :超純水。
[0136] 2、實驗方法：
[0137] a)擴(kuò)增試劑的配置：lpmol B3F，lpmol B3R，0. 25pmol B3T，lpmol IF，lpmol IR， 0. 25pmol IT, 4 u I LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture，4mM 二 價鎂離子，2 u I內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒T-I (濃度為IO5拷貝/ml)，10 u I檢測范本I或IOu I檢測范本 2,總體積40 ii 1,剩余體積用超純水補足。
[0138] b)核酸擴(kuò)增：將配置好的擴(kuò)增反應(yīng)混合物添加至擴(kuò)增管（1)的儲液區(qū)（3)中，將檢 測管（2)與擴(kuò)增管（1)扣合，并通過離心、振動或其他方式，使擴(kuò)增反應(yīng)混合物從儲液區(qū)（3) 流至核酸擴(kuò)增區(qū)（4)并混勻；將裝有擴(kuò)增反應(yīng)混合物的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管插 入自制核酸擴(kuò)增儀，進(jìn)行PCR核酸擴(kuò)增。
[0139] c)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：將全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管倒置并通過離心、振動或 其他方式，在全封閉條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增管（1)進(jìn)入檢測管（2)，并與試紙條（6)的樣 品墊區(qū)（8)接觸并被其吸附，而后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)現(xiàn)象向試紙條的檢測區(qū)（9)遷移，并 依次通過標(biāo)記有抗FITC抗體的乳膠顆粒、固定有鏈霉親和素（SA)的檢測線、固定有抗地高 辛抗體的內(nèi)標(biāo)線（I)和固定有羊抗鼠二抗（GAM-IgG)的質(zhì)控線，并在檢測線、內(nèi)標(biāo)線和質(zhì)控 線上發(fā)生特異性相互作用。靜置5分鐘后，即可通過透明檢測視窗（24)肉眼觀測檢測結(jié)果。
[0140] 實施例4的檢測結(jié)果見圖6。圖6A顯示以HBV全長質(zhì)粒為范本的檢測結(jié)果：檢測 線（T線)、內(nèi)標(biāo)線（I線）與質(zhì)控線（C線）均呈紅色。內(nèi)標(biāo)線（I線）呈紅色說明擴(kuò)增有效，質(zhì) 控線（C線）呈紅色說明試紙條檢測有效，檢測線（T線）呈紅色說明檢測結(jié)果為陽性。若質(zhì) 控線（C線）和/或內(nèi)標(biāo)線（I線）之任一不呈色，則說明擴(kuò)增和/或檢測有問題：內(nèi)標(biāo)線（I 線）不呈色說明擴(kuò)增存在問題；質(zhì)控線（C線）不呈色說明檢測試紙存在問題。圖6B顯示以 超純水為范本的檢測結(jié)果：檢測線（T線）不呈色，內(nèi)標(biāo)線（I線）與質(zhì)控線（C線）均呈紅色。 內(nèi)標(biāo)線（I線）呈紅色說明擴(kuò)增有效，質(zhì)控線（C線）呈紅色說明試紙條檢測有效，檢測線（T 線)不呈色說明檢測結(jié)果為陰性。圖6的結(jié)果還表明，本發(fā)明的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢 測管以及相關(guān)方法適合用于多重檢測，即，可用于檢測一種或多種目標(biāo)核酸分子。
[0141] 最后應(yīng)當(dāng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其進(jìn)行限 制。盡管本發(fā)明的【具體實施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解：根據(jù)已經(jīng) 公開的所有教導(dǎo)，可以對細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和變動，并且這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【權(quán)利要求】
1. 一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管，其包括相互配合的用于完成擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增 管（1)，和用于對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和結(jié)果判讀的檢測管（2)，其中擴(kuò)增管（1)與檢測管（2) 是密閉連接的，并且擴(kuò)增管（1)位于檢測管（2)的下方，并且檢測管（2)包括固定在試紙條 容納固定區(qū)（7)中的試紙條（6); 優(yōu)選地，擴(kuò)增管（1)和檢測管（2)通過螺紋卡口結(jié)構(gòu)、環(huán)狀卡口結(jié)構(gòu)或凸點鎖扣結(jié)構(gòu)而 實現(xiàn)密閉連接； 優(yōu)選地，擴(kuò)增管（1)包括儲液區(qū)（3)及核酸擴(kuò)增區(qū)（4)，其中儲液區(qū)（3)位于核酸擴(kuò)增區(qū) (4)的上方；任選地，儲液區(qū)（3)中預(yù)裝有用于核酸擴(kuò)增的試劑，例如引物，dNTP混合物，酶 (例如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)，探針，內(nèi)標(biāo)、緩沖液； 優(yōu)選地，擴(kuò)增管（1)通過螺紋卡口（5)而和檢測管（2)密閉連接；進(jìn)一步優(yōu)選地，螺紋卡 口（5)位于儲液區(qū)（3)的內(nèi)部。然而，螺紋卡口（5)也可以位于儲液區(qū)（3)的外部； 優(yōu)選地，試紙條（6)包括用于與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的樣品墊區(qū)（8)及用于反應(yīng)和呈現(xiàn)結(jié)果 的檢測區(qū)（9);進(jìn)一步優(yōu)選地，試紙條（6)的檢測區(qū)（9)包括一條或多條測試線，其用于確定 目標(biāo)核酸分子是否存在于樣品中；并且任選地包括質(zhì)控線和/或內(nèi)標(biāo)線，其中所述質(zhì)控線 用于驗證試紙條本身的有效性；所述內(nèi)標(biāo)線用于驗證擴(kuò)增過程的有效性； 優(yōu)選地，在將擴(kuò)增管（1)和檢測管（2)組裝完畢后，通過超聲波對各組裝部件進(jìn)行焊 接，和/或，對所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管整體進(jìn)行包膜處理； 優(yōu)選地，擴(kuò)增管（1)或檢測管（2)由聚合材料制成；優(yōu)選地，擴(kuò)增管（1)或檢測管（2)由 玻璃或塑料制成。
2. 權(quán)利要求1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管，其中試紙條容納固定區(qū)（7)包括試 紙條底座（10 )和試紙條上蓋（11 )，其中，試紙條底座部分（10 )和試紙條上蓋部分（11)能夠 密閉連接且將試紙條（6)固定在其中； 優(yōu)選地，試紙條底座部分（10)包括用于支撐試紙條（6)的橫隔（12)、用于試紙條（6)定 位的凹槽（13)、用于實現(xiàn)試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)與檢測區(qū)（9)物理性分隔的橫隔（14)、 用于實現(xiàn)檢測管（2)試紙條容納固定區(qū)（7)的試紙條底座部分（10)的上方和試紙條上蓋部 分（11)的上方密閉的凸條（15)、用于實現(xiàn)檢測管（2)的試紙條容納固定區(qū)（7)的試紙條底 座部分（10)的側(cè)邊和試紙條上蓋部分（11)的側(cè)邊密閉的凸點（16)、以及用于與擴(kuò)增管（1) 的螺紋卡口（5)配合的螺紋卡口（17);并且，試紙條上蓋部分（11)包括用于將試紙條（6) 卡緊的相對于橫隔（12)的橫隔（18)、用于試紙條（6)定位的相對于凹槽（13)的凹槽（19)、 用于實現(xiàn)試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)與檢測區(qū)（9)物理性分隔的相對于橫隔（14)的橫隔 (20)、用于實現(xiàn)檢測管（2)的試紙條容納固定區(qū)（7)的試紙條底座部分（10)的上方和試紙 條上蓋部分（11)的上方密閉的相對于凸條（15 )的凹槽（21 )、用于實現(xiàn)檢測管（2 )的試紙條 容納固定區(qū)（7)的試紙條底座部分（10)的側(cè)邊和試紙條上蓋部分（11)的側(cè)邊密閉的相對 于凸點（16)的凹槽（22)、以及用于與擴(kuò)增管（1)實現(xiàn)密閉的相對于螺紋卡口（17)的螺紋卡 口（23); 優(yōu)選地，試紙條上蓋部分（11)還包括用于觀測試紙條（6)的檢測區(qū)（9)的透明視窗 (24)。
3. -種試劑盒，其包含權(quán)利要求1或2的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管。
4. 一種擴(kuò)增和檢測樣品中的目的核酸的方法，其包括使用權(quán)利要求1或2的全封閉一 體式核酸擴(kuò)增與檢測管， 優(yōu)選地，所述核酸是DNA或RNA ; 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增是PCR反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
5. 權(quán)利要求4的方法，其包括以下步驟： a) 在擴(kuò)增管（1)內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)； b) 在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，倒轉(zhuǎn)全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管，并且在全封閉條件下，使 擴(kuò)增管（1)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測管（2)，并轉(zhuǎn)移至檢測試紙條（6)上，而無需打開一體式 核酸擴(kuò)增與檢測管；和 c) 讀取試紙條（6)上的檢測結(jié)果； 優(yōu)選地，在步驟b)中通過離心或震動使擴(kuò)增管（1)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測管（2)，并接 觸試紙條（6)的樣品墊區(qū)（8)，然后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)作用遷移經(jīng)過試紙條（6)的檢測區(qū) (9)； 優(yōu)選地，在步驟c)中，通過透明視窗（24)，優(yōu)選通過肉眼，讀取試紙條（6)上的檢測結(jié) 果； 優(yōu)選地，在檢測結(jié)束后，不打開所述一體式核酸擴(kuò)增與檢測管，并將其整體廢棄于安全 處； 優(yōu)選地，步驟a)包括： al)將待檢測的樣品和用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑添加至核酸擴(kuò)增區(qū)（4)，并且例如通過 離心或震動,使反應(yīng)混合物混勻； a2 )將檢測管（2 )與擴(kuò)增管（1)密閉連接(例如通過螺紋卡口（ 5 )、螺紋卡口（ 17 )和螺 紋卡口（23));和 a3)將密閉連接后的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管插入擴(kuò)增儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
6. 權(quán)利要求4的方法，其包括以下步驟： 1) 將待檢測的樣品和用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑添加至擴(kuò)增管（1)的核酸擴(kuò)增區(qū)（4)， 并且例如通過離心或震動,使反應(yīng)混合物混勻； 2) 通過螺紋卡口（5)、螺紋卡口（ 17)和螺紋卡口（23)將檢測管（2)與擴(kuò)增管（1)密閉 連接（即，扣合）； 3) 將密閉連接后的管插入擴(kuò)增儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增； 4) 在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取出全封閉一體式管； 5) 倒轉(zhuǎn)全封閉一體式管，并通過離心或震動使擴(kuò)增管（1)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測管 (2)，并轉(zhuǎn)移至檢測試紙條（6)上；和 6) 通過透明視窗（24)讀取試紙條（6)上的檢測結(jié)果。
7. 權(quán)利要求1或2的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測的用 途。
8. 權(quán)利要求1或2的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測管用于制備試劑盒的用途，所述試 劑盒用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測。
【文檔編號】C12M1/34GK104293659SQ201310304324
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】周文彬, 張師音, 葛勝祥, 陳杰裕, 張軍, 夏寧邵 申請人:廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司, 廈門大學(xué)