與玉米抗旱性相關的單體型及其分子標記的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與玉米抗旱性相關的單體型及其分子標記。所述單體型由5個多態性位點組成；所述5個多態性位點X1、X2、X3、X4和X5分別對應于玉米基因組DNA中序列表序列1的自5’末端第296位、第539位、第614位和第615位之間、第646位和第649位；這5個多態性位點在不同玉米自交系中共存在兩種單體型，即三種基因型。通過檢測所述5個多態性位點的情況，即可找到抗旱性相對較高的玉米。本發明為玉米的分子標記輔助選擇育種提供了一個新方法，在培育抗旱玉米品種或研究中具有重要意義。
【專利說明】與玉米抗旱性相關的單體型及其分子標記

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種與玉米抗旱性相關的單體型及其分子標記。

【背景技術】
[0002] 植物在復雜多變的環境中生長發育，常受到逆境脅迫，其中干旱是影響和限制植 物生長發育的主要逆境因子，甚至會導致植物死亡，嚴重影響農業生產。因此，培育抗旱作 物品種一直是農業科學技術研究的主要目標之一。玉米（Zea mays L.)是重要的糧食作物 之一，培育抗旱玉米品種對提高玉米產量具有重要意義。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提供一種與玉米抗旱性相關的單體型及其分子標記。
[0004] 本發明所提供的與玉米抗旱性相關的單體型由五個多態性位點組成；所述五個多 態性位點X1、X2、X3、X4和X5分別對應于玉米基因組DNA中序列表序列1自5'末端第296 位、第539位、第614位和第615位之間、第646位和第649位。
[0005] 本發明研究發現，這五個多態性位點在不同玉米自交系中共存在兩種單體型，即 三種基因型，因此本發明保護一種利用玉米多態性位點鑒定或輔助鑒定玉米基因型的方 法，所述多態性位點為所述XI、X2、X3、X4和X5五個多態性位點；
[0006] 所述五個多態性位點XI、X2、X3、X4和X5依次為下述a)、b)和C)的情況時相對 應的基因型分別為A、B和C:
[0007] a) A/A、C/C、無堿基插入/無堿基插入、G/G和G/G (即單體型甲純合）；
[0008] b)C/C、T/T、插入CAC/插入CACU個堿基缺失/1個堿基缺失和C/C (即單體型乙 純合）；
[0009] c) A/C、C/T、無堿基插入/插入CAC、G/1個堿基缺失和G/C (即單體型甲和乙雜 合）；
[0010] 所述"/"前為一條同源染色體上的情況，所述"/"后為另一條同源染色體上的情 況。
[0011] 所述獲得基因型A、B和C的方法可為檢測待測玉米基因組DNA中對應于序列表序 列1自5'末端第779位至第798位的情況，若為序列表序列7所示DNA片段/序列表序列 7所示DNA片段，則所述待測玉米的基因型為B ;若為缺失/缺失，則所述待測玉米的基因型 為A ;若為序列表序列7所示DNA片段/缺失，則所述待測玉米的基因型為C。所述"/"前 為一條同源染色體上的情況，所述"/"后為另一條同源染色體上的情況；
[0012] 所述檢測待測玉米基因組DNA中對應于序列表序列1自5'末端第779位至第798 位的情況所使用的PCR引物對可為序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單 鏈 DNA ;
[0013] 若所述PCR產物的大小為46bp，則所述待測玉米的基因型為A ;若所述PCR產物的 大小為66bp，則所述待測玉米的基因型為B ;若所述PCR產物的大小為46bp和66bp，則所 述待測玉米的基因型為c。
[0014] 所述獲得基因型A、B和C的方法還可為利用引物對PCR擴增待測玉米的基因組 DNA中任意一段含有所述五個多態性位點的DM片段后進行測序；
[0015] 所述引物對為序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA。
[0016] 所述獲得基因型A、B和C的方法還可為PCR-RFLP或SNP微測序的方法。
[0017] 本發明保護上述任一所述方法在鑒定或輔助鑒定玉米抗旱性中的應用。
[0018] 在上述應用中，被確定為基因型為A的待測玉米，其抗旱性高于被確定為基因型 為B和C的待測玉米；被確定為基因型為C的待測玉米，其抗旱性高于被確定為基因型為B 的待測玉米。
[0019] 在上述方法和應用中，所述待測玉米可為玉米自交系，也可為玉米雜交種如玉米 單交種。
[0020] 本發明還保護擴增如下DNA片段I或II的PCR引物對：
[0021] DNA片段I :玉米基因組DNA上的任意一段含有序列表序列1自5'末端第778位 和第799位核苷酸的DNA片段；
[0022] DNA片段II :玉米基因組DNA上的任意一段含有所述五個多態性位點的DNA片段。
[0023] 所述擴增DNA片段I的PCR引物對為序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列 4所示的單鏈DNA ;
[0024] 所述擴增DNA片段II的PCR引物對為序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列 6所示的單鏈DNA。
[0025] 本發明還保護如下1) 一4)中任一種DNA片段及其在調控玉米抗旱性中的應用：
[0026] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1的第296位至第798位所示的DNA分子；
[0027] 2)其核苷酸序列是序列表中序列1的第1位至第798位所示的DNA分子；
[0028] 3)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少 具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具 有99%同源性的DNA分子；
[0029] 4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交的DNA分子。
[0030] 本發明通過對105個玉米自交系組成的自然變異群體中與抗旱性相關的基因 ZmDREB2. 7遺傳變異分析，找到了形成玉米不同抗旱性的所述五個多態性位點（SNP-503， SNP-260, InDel-185, InDel-154和SNP-150)，且這五個多態性位點僅存在兩種單體型。實 驗證明，通過檢測所述5個多態性位點的情況，即可找到抗旱性相對較高的玉米。本發明為 玉米的分子標記輔助選擇育種提供了一個新方法，在培育抗旱玉米品種或研究中具有重要 意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為本發明兩種單體型在抗旱型玉米和旱敏感型玉米中的序列差異。
[0032] 圖2為對不同玉米自交系中分子標記InDel-21進行PCR擴增的結果。其中，泳道 1一5 分別為玉米自交系 Shen5003、CMBL70、CMBL91、(nMBL92 和 CML118。
[0033] 圖3為對不同分離群體各單株中分子標記InDel-21進行PCR擴增的結果。 其中，從上至下的四幅圖依次為分離群體CMBL70 X Shen5003、CMBL91 X Shen5003、 CMBL92XShen5003和CML118XShen5003的結果，泳道Pl均為親本一玉米自交系 5116115003，泳道？2依次為親本一(：頂81^70、(：頂81^91、(：頂81^92和01^118，其余泳道為各分離 群體中的不同單株。
[0034] 圖4為ZmDREB2. 7遺傳變異與玉米抗旱性的關聯分析。其中，X軸為2. Ikb的基 因組片段示意圖，包括ZmDREB2. 7基因 ATG上游600bp和下游1486bp，起始密碼子（ATG)中 的A記為"+l"，y軸為"-log1(l (P值)"。啟動子區的5個顯著多態性和編碼區的4個非同 義替換，均用實線連接坐標和連鎖不平衡圖。指示強連鎖（連鎖不平衡值r 2> 0.8)。
[0035] 圖5為ZmDREB2. 7基因的相對表達水平與存活率的相關分析。其中，圖A、B和C分 別為苗期干旱處理后正常生長（RLWC=98%)、中度干旱（RLWC=70%)和極度干旱（RLWC=58%) 時的結果。
[0036] 圖6為不同亞群中本發明兩種單體型的等位基因頻率。
[0037] 圖7為蛋白轉錄激活活性試驗結果。
[0038] 圖8為T3代轉基因擬南芥植株的RT-PCR產物的電泳結果。
[0039] 圖9為T3代轉基因擬南芥植株經干旱處理并復水6天后的表型。
[0040] 圖10為T3代轉基因擬南芥植株經干旱處理并復水6天后的存活率統計結果。

【具體實施方式】
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0043] 下述實施例中多態性位點的命名方法為標記類型+序號；其中，標記類型有SNP和 InDel兩種，SNP代表單核苷酸多態性，InDel代表插入或缺失；序號是以玉米自交系B73基 因組DNA中ZmDREB2. 7基因的起始密碼子（ATG)中的A記為"+1" ；如SNP-503代表在起始 密碼子（ATG)中的A的上游第503位堿基處存在單核苷酸多態性；InDel-185代表在起始密 碼子（ATG)中的A的上游第185位堿基下游存在1個或多個堿基的插入或缺失；
[0044] 下述實施例中引物或序列的位置均以玉米自交系B73基因組DNA中ZmDREB2. 7基 因的起始密碼子（ATG)中的A記為"+1" ；
[0045] 玉米自交系B73基因組DNA中ZmDREB2. 7基因的基因組序列如序列表序列1所示， 自序列1的5'端第701- 2284位編碼全長cDNA序列，其中無內含子，自序列1的5'端第 799-1878位編碼序列表序列2所示的蛋白；自序列1的5'端第799位為起始密碼子ATG 的中的堿基A。
[0046] 實施例1、與玉米抗旱性相關的單體型及其分子標記與應用
[0047] -、與玉米抗旱相關的單體型
[0048] 本申請發明人在研究中發現，在玉米基因組DNA中與抗旱相關的基因 ZmDREB2. 7 (見實施例3)的起始密碼子ATG上游的5個多態性位點共存在2種與抗旱相關的單體型(如 圖1所示，實施例2)，所述5個多態性位點分別為SNP-503, SNP-260, InDel-185, InDel-154 和SNP-150 ;對應于序列表序列1的位置依次為：自5'末端第296位、第539位、第614位 和第615位之間、第646位和第649位。
[0049] 所述2種與抗旱相關的單體型(分別命名為甲和乙)是在上述5個多態性位點上的 核苷酸或寡聚核苷酸不同；其中，單體型甲在上述5個多態性位點的情況依次為：A、C、3個 堿基缺失、G、G ;單體型乙在上述5個多態性位點的情況依次為：C、T、CAC、1個堿基缺失、C。
[0050] 所述 5 個多態性位點 SNP-503, SNP-260, InDel-185, InDel-154 和 SNP-150 依次 為下述a)、b)和c)三種情況：
[0051] a)A/A、C/C、無堿基插入/無堿基插入、G/G和G/G (即單體型甲純合）；
[0052] b)C/C、T/T、插入CAC/插入CACU個堿基缺失/1個堿基缺失和C/C (即單體型乙 純合）；
[0053] c) A/C、C/T、無堿基插入/插入CAC、G/1個堿基缺失和G/C (即單體型甲和乙雜 合）；
[0054] 所述"/"前為一條同源染色體上的情況，所述"/"后為另一條同源染色體上的情 況。
[0055] 二、鑒定單體型的分子標記InDel-21及其特異引物
[0056] 將表3所示105份玉米自交系中的ZmDREB2. 7基因包括ATG上游的序列進行擴增、 測序和比對發現，在ZmDREB2. 7基因的起始密碼子ATG上游的第21位堿基下游，單體型甲 純合的玉米自交系中缺失20bp的DNA片段，單體型乙純合的玉米自交系中插入20bp的DNA 片段，將該多態性位點命名為InDel-21，所述20bp的DNA片段的序列如序列表序列7所示。 該位點的多態性可作為分子標記用于鑒定玉米中上述5個多態性位點的情況，具體方法如 下：
[0057] 1、根據InDel-21兩側的保守序列，設計如下特異引物對：
[0058] F :5' -TCGCCATCAGTCGCCATA-3'（如序列表序列 3 所示）；
[0059] R :5' -GCGGCGGCACCCGATCCAT-3'（如序列表序列 4 所示)。
[0060] 2、以玉米基因組DNA為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，若擴增產物的 大小為46bp，則待測玉米為單體型甲純合的玉米；若擴增產物的大小為66bp，則待測玉米 為單體型乙純合的玉米；若擴增產物的大小為46bp和66bp，則待測玉米為單體型甲和乙雜 合的玉米。
[0061] 三、應用分子標記InDel-21及其特異引物對不同玉米進行分型及抗旱性分析
[0062] 以抗旱型玉米自交系CMBL70 (表3中序號2)，CMBL91 (表3中序號9)，CMBL92 (表3中序號6)和CML118 (表3中序號14)分別為父本，旱敏感型玉米自交系Shen5003 (表3中序號84)為母本雜交，再自交1代，獲得四個分離群體CMBL70XShen5003、 CMBL91 X Shen5003、CMBL92 X Shen5003 和 CMLl 18 X Shen5003。
[0063] 從上述五個玉米自交系親本及四個分離群體中分別隨機取150粒種子，催芽后移 栽到栽培盆(長X寬X深為〇. 70X0. 50X0. 18米，盛有5千克蛭石和5千克草炭土混合 的栽培基質)中，每盆種植144株，在溫室中，于光周期為每天16小時光照和8小時黑暗、溫 度為白天28°C、夜晚22°C、空氣濕度60%的條件下培養10天，取單株子葉按照步驟二的方 法鑒定各親本及群體中各單株的基因型，同時將植株進行干旱處理（即不澆水)，待土壤相 對含水量（即采用購于北京盟創偉業科技有限公司的土壤水分儀SU-LA(W)，測得的土壤中 水分的體積百分含量）達到〇%后一周，進行復水。復水6天后統計各親本及群體中各基因 型植株的存活率(將復水6天后地上部未能轉綠的植株，定義為死亡植株，將復水6天后地 上部能轉綠的植株定義為存活植株；存活率為存活植株占總植株數的百分比)。實驗重復三 次，每次重復約144個單株，取均值進行統計分析。結果如表1和表2和圖2和圖3所示。
[0064] 表1、親本的基因型及干旱處理后的存活率統計結果
[0065]

【權利要求】
1. 一種利用玉米多態性位點鑒定或輔助鑒定玉米基因型的方法，所述多態性位點為 X1、X2、X3、X4和X5五個多態性位點，所述五個多態性位點X1、X2、X3、X4和X5分別對應于 玉米基因組DNA中序列表序列1的自5'末端第296位、第539位、第614位和第615位之 間、第646位和第649位； 所述五個多態性位點XI、X2、X3、X4和X5依次為下述a)、b)和c)的情況時相對應的 基因型為A、B和C : a) A/A、C/C、無堿基插入/無堿基插入、G/G和G/G ; b) C/C、T/T、插入CAC/插入CAC、1個堿基缺失/1個堿基缺失和C/C ; c) A/C、C/T、無堿基插入/插入CAC、G/1個堿基缺失和G/C。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述獲得基因型A、B和C的方法為檢測 待測玉米基因組DNA中對應于序列表序列1自5'末端第779位至第798位的情況，若為序 列表序列7所示DNA片段/序列表序列7所示DNA片段，則所述待測玉米的基因型為B ;若 為缺失/缺失，則所述待測玉米的基因型為A ;若為序列表序列7所示DNA片段/缺失，則 所述待測玉米的基因型為C。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述檢測待測玉米基因組DNA中對應于 序列表序列1自5'末端第779位至第798位的情況所使用的PCR引物對為序列表序列3 所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA ; 若所述PCR產物的大小為46bp，則所述待測玉米的基因型為A ;若所述PCR產物的大小 為66bp，則所述待測玉米的基因型為B ;若所述PCR產物的大小為46bp和66bp，則所述待 測玉米的基因型為C。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述獲得基因型A、B和C的方法為利用 引物對PCR擴增待測玉米的基因組DNA中任意一段含有所述5個多態性位點的DNA片段后 測序。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述引物對為序列表序列5所示的單鏈 DNA和序列序列6所不的單鏈DNA。
6. 權利要求1一5中任一所述方法在鑒定或輔助鑒定玉米抗旱性中的應用。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于：被確定為基因型為A的待測玉米，其抗旱 性高于被確定為基因型為B和C的待測玉米；被確定為基因型為C的待測玉米，其抗旱性 高于被確定為基因型為B的待測玉米。
8. 擴增如下DNA片段I或II的PCR引物對： DNA片段I :玉米基因組DNA上的任意一段含有序列表序列1自5'末端第778位和第 799位核苷酸的DNA片段； DNA片段II :玉米基因組DNA上的任意一段含有所述五個多態性位點的DNA片段。
9. 根據權利要求8所述的PCR引物對，其特征在于： 所述擴增DNA片段I的PCR引物對為序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所 示的單鏈DNA ; 所述擴增DNA片段II的PCR引物對為序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所 示的單鏈DNA。
10. 如下1) 一4)中任一種DNA片段及其在調控玉米抗旱性中的應用： 1) 其核苷酸序列是序列表中序列1的第296位至第798位所示的DNA分子； 2) 其核苷酸序列是序列表中序列1的第1位至第798位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性的DNA分子； 4) 在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交的DNA分子。
【文檔編號】C12N15/11GK104293900SQ201310304629
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月18日 優先權日:2013年7月18日
【發明者】秦峰, 劉升學, 王向蘭, 王宏偉 申請人:中國科學院植物研究所