利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛MyoDⅠ基因核心啟動子的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛MyoDⅠ基因核心啟動子的方法，包括以下步驟：構建含關嶺牛MyoDⅠ基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體；對骨骼肌生長相關的細胞進行培養和鋪板；配制啟動子重組子/脂質體的混合物，對步驟2）獲得的細胞進行轉染；通過雙熒光素酶報告基因對步驟3）獲得的轉染細胞進行雙熒光素酶活性檢測。本發明具有靈敏度高、檢測速度快、費用低、不需使用放射性同位素等優點，使用的pGL3-Basic報告基因，因其無啟動子和增強子，可通過熒光素酶報告基因的表達來檢測插入啟動子的啟動活性，并且比較啟動子的強弱，進而初步確定核心啟動子區域。
【專利說明】利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛辦/基因核心啟
動子的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子遺傳學領域，尤其是一種利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛MyoD /基因核心啟動子的方法。
【背景技術】
[0002]/的全稱為myogenic differentiation I，其中文名稱為生肌決定因子，是骨骼肌生長發育過程中重要的正調控基因，在肌形成肌肉特異基因轉錄調控中，MyoD /起著總開關的作用，可以結合到肌細胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、結蛋白等基因啟動子區發揮重要調控作用，促進它們的轉錄激活。MyoD /介導的肌分化機制作為研究細胞分化的最佳模型，已成為當前眾多學者研究的焦點，尤為重要。目前，國內外對該基因的表達調控在小鼠、雞和豬的肌細胞生成機理等方面的相關研究較多，在牛上已有一些研究，包括遺傳變異及功能研究等，但主要集中在轉錄后和翻譯水平，/基因轉錄調控的分子機制尚不清楚。因此，基因啟動子的研究具有廣闊的研究前景，以期為轉基因牛的培育和牛肉品質的提高提供理論依據。生肌決定因子I的主要功能包括:(I)促使靜止期的肌衛星細胞向成肌細胞轉化。(2)能把許多種類型細胞轉化為成肌細胞，并可促進成肌細胞進一步融和、分化為成熟的肌纖維。
[0003]pGL3-Basic是一類常用的報告基因，因其無啟動子和增強子，可通過熒光素酶報告基因的表達來檢測插入片段的啟動活性，并且比較啟動子的強弱和骨骼肌特異性，進而初步確定核心啟動子區域。

【發明內容】

[0004]技術要求
本發明所要解決的技術問題是提供一種利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛I基因核心啟動子的方法，它具有靈敏度高、檢測速度快、費用低、不需使用放射性同位素等優點。
[0005]本發明是這樣實現的:利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛/基因核心啟動子的方法，包括以下步驟:
步驟I)、構建含關嶺牛MyoD I基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體；
步驟2)、對骨骼肌生長相關的細胞進行培養和鋪板；
步驟3)、配制啟動子重組子/脂質體的混合物，對步驟2)獲得的細胞進行轉染；
步驟4)、通過雙熒光素酶報告基因對步驟3)獲得的轉染細胞進行雙熒光素酶活性檢測。
[0006]步驟4)中所述的雙熒光素酶報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
[0007]所述的雙熒光素酶活性檢測所采用的工作液是通過promega試劑盒配制獲得。
[0008]步驟I)中所采用的引物為8對，引物PO的上游引物的序列為:5 ' -ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物PO的下游引物的序列為:5 ' -GAAACCCAGCCGCATCTA-3 '；引物Pl的上游引物的序列為:5 ' - ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物Pl的下游引物的序列為:5 '-GGTTTGGGTTGCTAGACG-3';引物 P2 的上游引物的序列為:5' - GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物P2的下游引物的序列為:5 ' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3 ';引物P3的上游引物的序列為:5 ' - GATATGGAGCTGCTGTCGC-3 '，引物P3的下游引物的序列為:5 ^ - AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3 ';引物P4的上游引物的序列為:5 ^ -GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物 P4 的下游引物的序列為:5' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3'；引物P5的上游引物的序列為:5 ' - CTCCCTGATTCGGTAGATC-3 '，引物P5的下游引物的序列為:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3 ';引物P6的上游引物的序列為:5 ' - CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3 '，引物P6的下游引物的序列為:5 ' - AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3 ';引物P7的上游引物的序列為:5 '-TTAGGCTACTACGGGATAAA-3 '，引物 P7 的下游引物的序列為:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC_3' o
[0009]有益效果
(I)本發明提供的方法具有靈敏度高、檢測速度快、費用低、不需使用放射性同位素等優點。
[0010](2)本發明使用的pGL3-Basic報告基因，因其無啟動子和增強子，可通過熒光素酶報告基因的表達來檢測插入啟動子的啟動活性，并且比較啟動子的強弱，進而初步確定核心啟動子區域。
【專利附圖】

【附圖說明】·
[0011]圖1為本發明所使用的技術路線；
圖2為構建構建重組子pUCm-T-1^c^ I pro載體方法示意圖；
圖3為克隆的啟動子片段；
圖4為酶切鑒定重組子pUCm-T-loi? I pro載體圖；
圖5為構建pGL3-Basic-loj I pro真核表達載體示意圖；
圖6為酶切鑒定重組子pGL3-1(F0i? 1-pro載體圖；
圖7啟動子轉染小鼠C2C12細胞雙熒光素酶活性檢測圖；
圖8為最終確定的關嶺牛/基因核心啟動子區域；
圖9、圖10為圖2的放大圖；
圖11、圖12為圖5的放大圖。
【具體實施方式】
[0012]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0013]本發明的實施例:利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛/基因核心啟動子的方法，包括以下步驟:步驟1，含關嶺牛/基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體的構建:構建重組子T載體方法示意圖見圖2，克隆的啟動子片段見圖3，酶切T載體鑒定見圖4，構建pGL3-BasiC-MyoD I pro真核表達載體見圖5,重組子pGL3-1(rc^ 1-pro載體鑒定見圖6。
[0014]步驟1.1，對/基因全長啟動子和亞克隆片段進行克隆酶切及純化；
【權利要求】
1.一種利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛/基因核心啟動子的方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟I)、構建含關嶺牛MyoD I基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體； 步驟2)、對骨骼肌生長相關的細胞進行培養和鋪板； 步驟3)、配制啟動子重組子/脂質體的混合物，對步驟2)獲得的細胞進行轉染； 步驟4)、通過雙熒光素酶報告基因對步驟3)獲得的轉染細胞進行雙熒光素酶活性檢測。
2.根據權利要求1所述的利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛/基因核心啟動子的方法，其特征在于:步驟4)中所述的雙熒光素酶報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
3.根據權利要求1所述的利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛/基因核心啟動子的方法，其特征在于:所述的雙熒光素酶活性檢測所采用的工作液是通過promega試劑盒配制獲得。
4.根據權利要求1所述的利用雙熒光素酶報告基因確定關嶺牛/基因核心啟動子的方法，其特征在于:步驟I)中所采用的引物為8對，引物PO的上游引物的序列為:5 ^ -ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物PO的下游引物的序列為:5 ' -GAAACCCAGCCGCATCTA-3 ,;引物Pl的上游引物的序列為:5 ' - ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物Pl的下游引物的序列為:5 '-GGTTTGGGTTGCTAGACG-3';引物 P2 的上游引物的序列為:5' - GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物P2的下游引物的序列 為:5 ' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3 ';引物P3的上游引物的序列為:5 ' - GATATGGAGCTGCTGTCGC-3 '，引物P3的下游引物的序列為:5 ^ - AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3 ';引物P4的上游引物的序列為:5 ^ -GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物 P4 的下游引物的序列為:5' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3'；引物P5的上游引物的序列為:5 ' - CTCCCTGATTCGGTAGATC-3 '，引物P5的下游引物的序列為:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3 ';引物P6的上游引物的序列為:5 ' - CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3 '，引物P6的下游引物的序列為:5 ' - AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3 ';引物P7的上游引物的序列為:5 '-TTAGGCTACTACGGGATAAA-3 '，引物 P7 的下游引物的序列為:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC_3' ο
【文檔編號】C12Q1/68GK103571941SQ201310341205
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年8月7日 優先權日:2013年8月7日
【發明者】許厚強, 李飛, 陳偉, 陳祥, 趙佳福 申請人:貴州大學