專利名稱：通用actb基因熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種操作簡便、快速，且能夠定量檢測人、大鼠、小鼠三個物種β-肌動蛋白(Beta-actin，ACTB)基因mRNA表達的DNA體外擴增試劑盒，該發明屬于分子生物學檢測技術中的熒光定量DNA體外擴增技術領域。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)是現有的DNA體外擴增技術中最常用、也是最有效的技術；該技術系將耐熱DAN聚合酶、特異引物、dNIPs底物、模板 DNA、鎂離子等放在同一個緩沖反應體系中，進行反復高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環，從而達到靶DNA片段在反應液中呈2η倍擴增(其中η為熱循環次數)；熒光定量PCR 技術則在PCR反應的基礎上，耦合以實時熒光檢測和計算機分析技術，即在PCR反應體系中加入特定的熒光物質，通過檢測每個熱循環后PCR反應體系中的熒光變化情況來實時探測 DNA的擴增情況，并獲得每個標本的熒光定量變化曲線，進而獲得每個反應管的Ct值(熒光變化達到閾值時的循環數)；同時，在相同的反應體系和反應條件下檢測4-5個倍數稀釋的已知數量的靶標DNA，獲得其Ct值，以起始模板數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標制備標準曲線，據此標準曲線和各個標本的Ct值對每個反應的起始DNA模板數進行定量測定； TaqMan探針技術是目前最常用的熒光定量PCR技術；TaqMan探針是一條能夠與待擴增檢測的靶DNA序列互補配對的寡核苷酸，其5’端標記了一個熒光報告基團(R)，其3’端標記了一個熒光淬滅基團(Q)；當該探針處于游離狀態或者沒有發生反應時，R所產生的熒光將被 Q淬滅；在PCR退火過程中，該探針可與目標基因發生雜交，并由TaqDNA聚合酶的依賴于聚合的外切活性切斷，使得R與Q分離，游離的R發出熒光被熒光檢測裝置檢測；隨著PCR反應的進行，游離的R與PCR產物相對應地增加；因此，根據R產生的熒光信號的強弱，即可間接測量出PCR反應產物的數量；再依據標準曲線即可對每個反應的起始DNA模板數進行定量測定。
在熒光定量PCR檢測中，經常遇到檢測基因相對表達量的情況，其中內對照基因常常選擇ACTB ；有鑒于此，我們通過大量的實驗研究優選出了一套能夠有效檢測人、大鼠、 小鼠三個物種ACTB基因表達的引物和探針，優化出了其PCR反應的條件，并組裝成通用 ACTB基因表達檢測熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒，以滿足生命科學研究和醫學檢測的需要。發明內容
本發明的技術方案是首先獲得人、大鼠、小鼠的ACTB標準序列，進行BLAST同源性比較，再根據比較結果設計相應的引物和探針，最后將引物、探針加入含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板cDNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等組成的PCR擴增緩沖反應體系中，在熱循環儀上進行高溫、低溫、中溫的反復熱循環；并在中溫時檢測和記錄熒光值。
所優選出的引物和探針的序列分別如下
上游引物Pl :5，-GAA GAT CAA GAT CAT TGC TCC T_3，(SEQ ID NO 1)；
下游引物P2 :5，-TGG ATC AGC AAG CAG GAG TA-3，(SEQ ID NO 2)；
TaqMan 探針序列5，-FAM-CTG TCC ACC TTC CAG CGA-TAMRA-3，(SEQ ID NO 3)
所優化出的PCR擴增緩沖反應體系是由引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+、PCR緩沖液、超純水等組成的，各個成分的終濃度分別如下特異的引物和探針每條 0. 28umol/L, Taq DNA 聚合酶 1. 5/50ul、dNTPs 底物 0. 25mmol/L、模板 cDNA 若干、 Mg2+2. 5mmol/L、緩沖液 IXPCR ；其中 1 XPCR 緩沖液包括 50mmol/L KClUOmmol/LTris 'HCl PH8. 3、0· 01% 明膠。
該ACTB熒光定量PCR由于引物和探針在人、大鼠、小鼠中完全同源，所以能夠有效擴增來源于這些物種的ACTB基因，從而檢測ACTB基因的表達量。
根據上述研究結果，將上述引物、探針和其他PCR試劑混合后分裝到PCR擴增管中，并配以 10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML 等系列稀釋度的標準 ACTB 基因模板組裝成通用ACTB基因熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒。標準ACTB基因模板的序列為
5’ -GAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGATTGGTGGCTCTATCCTGGC CTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3，(SEQ ID NO 4)
實施例
1、在DNA合成儀上人工合成下述引物和探針各20D，并用TE緩沖液(其中含 lOmmol/LTris, 1 含 10mmol/L EDTA)稀釋至 10umol/L。其中上游引物 Pl 序列為5，-GAA GATCAA GAT CAT TGC TCC T_3，(SEQ ID NO :1)；下游引物P2 :5，-TGG ATC AGC MGCAG GAG TA-3，(SEQ ID NO :2) ；TaqMan 探針序列5'-FAM-CTG TCC ACC TTC CAGCGA-TAMRA-3，(SEQ ID NO 3)
2、取各引物、探針各 37. 5ul，25mmol/L dNTPs 18ul, 25mmol/L MgCl2 150ul, 10 X PCR反應緩沖液150ul，5U/ul Taq DNA聚合酶9ul，超純水990. 5ul加入到2ml的干凈無菌試管中，充分混勻，配制1400ul FQ-PCR反應預混液。
3、將預混液成按46. 7ul/管分裝成30小管(用200ul PCR擴增管)，再配以10E+8/ ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀釋度的標準ACTB基因模板5管，每管各20ul，即組裝成了通用ACTB基因熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒；其中標準ACTB基因模板的序列為
5’ -GAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGATTGGTGGCTCTATCCTGGC CTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3，(SEQ ID NO 4)
4、FQ-PCR 擴增
每個裝有46. 7ulPCR反應預混液的反應管中分別加入3. 3ul待測cDNA，水或標準 ACTB基因模板，震蕩混勻，瞬時離心后上機到熒光定量PCR儀(如PE9700)中，96°C下變性 5分鐘，然后按94°C 20秒，550C 30秒，60°C 30秒熱循環45次，并在60°C時檢測記錄熒光信號；PCR反應結束后，讀取各個反應的Ct值用以定量分析；同時于3%瓊脂糖凝膠行PCR產物電泳，溴乙錠染色，GelDoclOOO下觀察，灰度掃描分析記錄各PCR反應的結果。
5、結果
在30個標本的FQ-PCR反應中，經電泳檢測，加入待測標本和標準品的反應產物中均檢測到了預期大小的Illbp左右的PCR產物條帶，而未加DNA標本的陰性對照未見相應擴增產物；加入標準ACTB基因模板和待測標本的反應均獲得了 S形的熒光變化曲線，加入標準ACTB基因模板的Ct值與加入模板拷貝數的對數呈線性關系，可以擬合成一條直線，斜率-3. 36，截距為41. 3，相關系數9. 9，說明該反應體系和反應條件均符合精確定量研究的要求。
權利要求
1.一種操作簡單、快速，能夠有效定量擴增檢測人、大鼠、小鼠的ACTB基因表達的DNA 熒光定量體外擴增檢測試劑盒；其中包含ACTB特異的引物、探針和耐熱DNA聚合酶、dNTPs、 模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等組成的PCR擴增緩沖反應體系，以及標準ACTB模板。
2.根據權利要求1所述的通用ACTB基因熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，其特征在于所用引物和探針序列分別為上游引物Pl :5，-GM GAT CM GAT CAT TGC TCC T_3，(SEQ ID NO 1)；下游引物 P2 :5，-TGG ATC AGC AAG CAG GAG TA-3，(SEQ ID NO :2) ；TaqMan 探針序列5，-FAM-CTG TCC ACC TTC CAG CGA-TAMRA-3，(SEQ ID NO :3)。
3.根據權利要求1所述的通用ACTB基因熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，其特征在于特異的引物和探針每條0. 28umol/L, Taq DNA聚合酶1. 5/50ul、dNTPs底物0. 25mmol/ L、模板 cDNA 若干、Mg2+2. 5mmol/L、緩沖液 1 XPCR ；其中 1 XPCR 緩沖液包括 50mmol/L KC1、 10mmol/L Tris · HCl PH 8·3、0·01% 明膠。
4.根據權利要求1所述的通用ACTB基因熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，其特征在于標準 ACTB 基因模板序列為5 ‘ -GAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGA TTGGTGGCTCTATCCTGGCCTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3，(SEQID NO 4)；其濃度分別為 10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML。
全文摘要
本發明涉及一種操作簡單、快速，能夠有效定量擴增檢測人、大鼠、小鼠的ACTB基因表達的DNA熒光定量體外擴增檢測試劑盒；其中包含ACTB特異的引物、探針和耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等組成的PCR擴增緩沖反應體系，以及標準ACTB模板；其中所用引物和探針序列分別為上游引物P1(SEQ ID NO1)；下游引物P2(SEQID NO2)；TaqMan探針序列(SEQID NO3)；引物和探針濃度為每條0.28umol/L、Taq DNA聚合酶1.5U/50ul、dNTPs底物0.25mmol/L、模板cDNA若干、Mg2+2.5mmol/L、緩沖液1×PCR；標準ACTB基因模板序列為(SEQ ID NO4)。
文檔編號C12Q1/68GK102517395SQ20111044855
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者劉欽松, 夏慶杰 申請人:山東博奧克生物科技有限公司