一種水稻開花素重組蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種水稻開花素重組蛋白的制備方法，所述方法包括RNA提取、重組載體制備、基因工程菌獲得、重組蛋白分離純化等步驟；實(shí)驗(yàn)證明，在本發(fā)明低溫條件16～20℃下，誘導(dǎo)的蛋白可溶性明顯增大，包涵體含量降低。本發(fā)明首次嘗試了對(duì)植物開花素蛋白OsHd3a的原核表達(dá)，成功克隆了OsHd3a基因并構(gòu)建了表達(dá)載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，再經(jīng)測序確認(rèn)序列正確，最后經(jīng)過Ni-NTAResin分離純化得到重組蛋白Hd3a，為將其應(yīng)用于植物開花生理過程的調(diào)控提供了基礎(chǔ)，對(duì)植物生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的意義。
【專利說明】一種水稻開花素重組蛋白的制備方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水稻開花素重組蛋白的制備方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]開花是綠色植物特有的現(xiàn)象，開花植物使得世界絢麗多彩。多年來，科學(xué)家一直在對(duì)植物開花機(jī)理進(jìn)行不懈的探索，并希望對(duì)植物開花的周期進(jìn)行調(diào)控。1937年，俄國植物生理學(xué)家Mikhail Chailakhyan提出開花素(Florigen)假說,認(rèn)為植物葉片接收到光信號(hào)后會(huì)產(chǎn)生某種物質(zhì)并傳遞到植物莖頂端誘導(dǎo)花芽產(chǎn)生。利用嫁接等研究方法也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)植物葉子可以通過感受日晝長短變化來感受季節(jié)變化，并因此而產(chǎn)生某種物質(zhì)，引發(fā)一種從葉到莖尖的長距離信號(hào)傳導(dǎo)，最終促進(jìn)開花。這種可能的物質(zhì)被稱為開花素，但是幾十年來開花素的化學(xué)本質(zhì)一直沒有被鑒定。最近幾年在擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oriza sativa)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了開花素，它是一種可移動(dòng)的蛋白分子，參與花器官形成的誘導(dǎo)。在擬南芥中開花素是由葉片中Flowering Locus T(FT)基因編碼的FT蛋白，可通過維管系統(tǒng)運(yùn)送至莖尖，激活其它開花相關(guān)基因并引起開花。水稻中的FT同源蛋白是0sHd3a，能從葉中傳遞到莖尖分生組織從而導(dǎo)致水稻開花。在番爺(Solanum Iycopersicum)中也存在 FT 同源基因 SINGLE-FLOWER TRUSS (SFT)，在煙草(Nicotiana tabacum)或番茄中過量表達(dá)FT或SFT基因都會(huì)促進(jìn)提前開花。
[0003]開花素相關(guān)的研究結(jié)果給我們利用開花的分子機(jī)制對(duì)植物開花進(jìn)行調(diào)控提供了重要啟示，開花素既然是葉片中產(chǎn)生并可以移動(dòng)的蛋白，那么就可以通過人工的方法生產(chǎn)開花素蛋白并施用于植物，如果可以應(yīng)用于農(nóng)作物、花卉觀賞園藝等植物進(jìn)行開花周期的調(diào)控，那么具有巨大的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。植物的開花年限，既是科學(xué)家研究的熱點(diǎn)也是實(shí)踐生產(chǎn)中需要解決的問題。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種水稻開花素重組蛋白的制備方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種水稻開花素重組蛋白的制備方法，所述方法包括:
[0007](I)取開花期水稻葉片，用液氮研磨后，按常規(guī)方法提取總RNA ；
[0008](2)以水稻總RNA為模板，用擴(kuò)增弓I物進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆至PMD18-T，獲得重組載體pMD18-T-0sHd3a ；
[0009]所述擴(kuò)增引物序列如下:
[0010]h游引物:5’ -CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3’ ；
[0011]下游引物:5’-GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3，；
[0012]擴(kuò)增得到的核苷酸序列如下:
[0013]ATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAGGGACCCTCTTGTGGTT GGTAGGGTTGTGGGTGATGTGCTGGACGCGTTCGTCCGGA GCACCAACCTCAAGGTCACCTATGGCTCCAAGACCGTGTC CAATGGCTGCGAGCTCAAGCCGTCCATGGTCACCCACCAG CCTAGGGTCGAGGTCGGCGGCAATGACATGAGGACATTCT ACACCCTTGTGATGGTAGACCCAGATGCACCAAGCCCAAG TGACCCTAACCTTAGGGAGTATCTACATTGGTTGGTCACTG ATATTCCTGGTACTACTGCAGCGTCATTTGGGCAAGAGGTG ATGTGCTACGAGAGCCCAAGGCCAACCATGGGGATCCACC GGCTGGTGTTCGTGCTGTTCCAGCAGCTGGGGCGTCAGAC AGTGTACGCGCCCGGGTGGCGTCAGAACTTCAACACCAA GGACTTCGCCGAGCTCTACAACCTCGGCTCGCCGGTCGCC GCCGTCTACTTCAACTGCCAGCGCGAGGCAGGCTCCGGCG GCAGGAGGGTCTACCCCTAG ；
[0014]其編碼的氨基酸序列如下:
[0015]MAGSGRDRDPLVVGRVVGDVLDAFVRSTNLKVTYGSKTVS NGCELKPSMVTHQPRVEVGGNDMRTFYTLVMVDPDAPSPS DPNLREYLHWLVTDIPGTTAASFGQEVMCYESPRPTMGIHRL VFVLFQQLGRQTVYAPGffRQNFNTKDFAELYNLGSPVAAVY FNCQREAGSGGRRVYP ；
[0016](3)測序正確的重組載體1?18-1'-08!1(13&經(jīng)限制性內(nèi)切酶恥61/10 I酶切后，將含目的基因片段插入pET28b，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET28b-0sHd3a，經(jīng)過測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21 (DE3)；
[0017](4)含重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL21 (DE3)在37°C活化培養(yǎng)后，挑取單菌落轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)12h，所得菌液按照1:100體積比加入到含卡那霉素50 μ g/m L的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)至OD6tltl為0.4，加入終濃度0.50mmol/L的IPTG，20°C誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD6c?為1.0 ;實(shí)驗(yàn)證明，在本發(fā)明的溫度條件(20°C)下，誘導(dǎo)的蛋白可溶性明顯增大，包涵體含量降低。
[0018](5)步驟(4)所得菌液經(jīng)分離純化，得到所述水稻開花素重組蛋白。
[0019]優(yōu)選的，為增加可溶性蛋白的含量，步驟(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中還可添加有2g/L的葡萄糖。
[0020]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明首次嘗試了對(duì)植物開花素蛋白0sHd3a的原核表達(dá)，成功克隆了 0sHd3a基因并構(gòu)建了表達(dá)載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，再經(jīng)測序確認(rèn)序列正確，最后經(jīng)過N1-NTA Resin分離純化得到重組蛋白Hd3a，為將其應(yīng)用于植物開花生理過程的調(diào)控提供了基礎(chǔ)，對(duì)植物生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的意義。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1為重組質(zhì)粒pET-28b_0sHd3a的酶切結(jié)果分析；M:marker ; 1:重組質(zhì)粒pET-28b_0sHd3a ；
[0022]圖2為親和層析后目的蛋白SDS-PAGE圖；
[0023]圖3為IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化；IPTG濃度為:1:不加IPTG的對(duì)照；2:0.25mmol/L ；3:0.SOmmoI /I, ；4: 1.00mmol/L。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0025]實(shí)施例1:
[0026]一、獲得0sHd3a基因的編碼區(qū)DAN片段；
[0027]水稻總RNA提取采用RNAiso Reagent試劑盒(Takara公司)進(jìn)行:取開花期水稻葉片lOOmg，用液氮研磨后，加入提取液按照說明書提取總RNA。提取的總RNA加入DNase去除基因組DNA，進(jìn)行氯仿抽提純化后溶于RNase free ddH20，隨后參照PrimeScript RT-PCRKit使用說明合成cDNA —鏈。水稻開花調(diào)控基因0sHd3a擴(kuò)增的正向引物為:5’ -CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3’，下劃線為限制酶 Nde I。反向引物為:5’ -GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3’，下劃線為限制酶Xho I。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后進(jìn)行凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆至PMD18-T (上海生工)載體進(jìn)行測序。
[0028]二、構(gòu)建含有目的基因的大腸桿菌重組表達(dá)載體PET28b-0sHd3a ;測序正確的pMD18-T-0sHd3a載體和pET28b(Novagen)分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel/Xhol酶切后，連接，將目的基因片段(SEQ ID N0.3)插入pET28b，構(gòu)建pET28b-0sHd3a載體，獲得目標(biāo)基因融合有His-tag的重組表達(dá)載體。pET28b-0sHd3a經(jīng)過測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21 (DE3)進(jìn)行重組蛋白(SEQ ID N0.4)的表達(dá)研究。重組載體的酶切驗(yàn)證圖見附圖1。
[0029]三、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，獲得基因工程菌。
[0030](I)菌株的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)
[0031]LB液體培養(yǎng)基配制:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化鈉IOg,蒸懼水1000mL。
[0032]LB平板即LB固體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基添加15g/L瓊脂。
[0033]取于_70°C保存的大腸桿菌BL21 (DE3)菌種，用滅菌牙簽沾取冰渣，劃線于LB平板(LB液體培養(yǎng)基+15g/ L瓊脂)上，.于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時(shí)。用滅菌牙簽挑取單菌落放入含5mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于30°C搖床(轉(zhuǎn)速200r/min)培養(yǎng)12小時(shí)。取500 μ L試管中菌液，轉(zhuǎn)入含50mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37°C搖床(轉(zhuǎn)速200r/min)培養(yǎng)3小時(shí)，此時(shí)OD6qq=0.4左右。
[0034](2)感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0035]培養(yǎng)液冰浴10分鐘，將90mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入2支50ml離心管中，4°C，4500r/min下離心5分鐘，棄上清液。用30mL0.lmol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，4°C，4500r/min下離心3分鐘，棄上清液。用IOmL0.lmol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，冰浴30分鐘，4°C，4000r/min下離心3分鐘，棄上清液。用2mL0.lmol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，即制成感受態(tài)細(xì)胞。
[0036](3)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
[0037]取感受態(tài)細(xì)胞菌液50 μ L，加入I μ L含有目的基因的質(zhì)粒pET28b_0sHd3a，輕輕吸打混勻，冰浴20分鐘。42°C熱擊60秒，迅速置于冰上2分鐘。加入LB液體培養(yǎng)基200 μ L，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)I小時(shí)。取培養(yǎng)后的菌液200 μ L，涂布于含卡那霉素的LB平板(卡那霉素含量50μ g/mL)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)。
[0038]四、重組蛋白分離純化
[0039]2XYT培養(yǎng)基配制:蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaC15g，蒸餾水lOOOmL，pH7.0。
[0040]含重組質(zhì)粒以及空質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL21 (DE3)在37°C活化培養(yǎng)后，挑取單菌落轉(zhuǎn)入含5mL2XYT培養(yǎng)基(含卡那霉素50μ g/mL)中37°C振蕩培養(yǎng)12h，取菌液500 μ L加入到含50mL2XYT培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μ g/mL)中，37°C搖床(轉(zhuǎn)速200r/min)培養(yǎng)OD6tltl至
0.4，加入IPTG (0.50mmol/L)誘導(dǎo)，20°C誘導(dǎo)培養(yǎng)OD6tltl至1.0。離心收集菌體，保留上清液用于檢測。菌體沉淀加入BugBuster protein extraction reagent (Merck公司)進(jìn)行溫和吸打懸浮，室溫孵育20min后于4°C、14000r/min離心20min，上清液和沉淀分別保存?zhèn)溆谩?br> [0041]經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測確定目標(biāo)蛋白所在的組分后，上清液采用His bindpurification kit(Merck公司)進(jìn)行N1-NTA Resin親和柱層析,方法按照說明書進(jìn)行。重組蛋白由唑洗脫后在4°C條件下，IOmmoI/L磷酸緩沖液PBS (pH7.0)中進(jìn)行透析，更換磷酸緩沖液4次,共透析16h以除去咪唑和NaCl等成分,透析后的蛋白經(jīng)Bradford法定量后進(jìn)行電泳分析，電泳圖中可以觀察到重組蛋白目的條帶(圖2)。上清液中蛋白來自于細(xì)胞內(nèi)部，同時(shí)表明了目標(biāo)蛋白主要是胞內(nèi)的可溶性表達(dá)。可以看出利用N1-NTA Resin能成功純化出重組目標(biāo)蛋白，目標(biāo)帶相對(duì)較純，這說明his-tag能有效的與鎳柱結(jié)合，達(dá)到高效分離純化植物開花素蛋白的目的。
[0042]本發(fā)明研制的過程中開始發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量低，且不可溶的包涵體較多，經(jīng)過改進(jìn)和條件優(yōu)化，提高了蛋白表達(dá)量以及可溶性。
[0043]蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化:
[0044]取于_70°C保存的轉(zhuǎn)質(zhì)粒的BL21 (DE3)菌株，用滅菌牙簽分別劃線于LB平板(卡那霉素含量50 μ g/mL), 37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)。用滅菌牙簽挑取單菌落，放入含5mL2X YT培養(yǎng)基(含卡那霉素5(8/1)的試管中，371:搖床(轉(zhuǎn)速20017/111)培養(yǎng)12小時(shí)。取試管中的菌液500 μ L，分別加入到含50mL2XYT培養(yǎng)基(卡那霉素含量50 μ g/mL)的錐形瓶中，37°C搖床(轉(zhuǎn)速200r/min)培養(yǎng)2.5小時(shí)，此時(shí)OD6tltl=0.4左右。以不加IPTG為對(duì)照，進(jìn)行IPTG條件優(yōu)化，IPTG設(shè)置系列濃度梯度，包括從0.25,0.50，1.00mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間3小時(shí)和5小時(shí)，20°C搖床(轉(zhuǎn)速200r/min)誘導(dǎo)。取ImL菌液于EP管中，10000r/min離心I分鐘，去上清液。加100 μ L PBS懸浮沉淀，即制成電泳樣品。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)樣品進(jìn)行電泳。蛋白電泳結(jié)果見圖3。
[0045]結(jié)果顯示，0.50mmol/L IPTG能顯著誘導(dǎo)重組蛋白的產(chǎn)生，大于此濃度后，對(duì)蛋白表達(dá)量的誘導(dǎo)效果不大，因此采取濃度為0.50mmol/L的IPTG進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)。而在溫度為20°C條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)的蛋白可溶性明顯增大，包涵體含量降低。
[0046]實(shí)施例2:重組開花素蛋白對(duì)開花植物番茄催花的生物測定
[0047]以未開花的苗齡一致的番茄幼苗(番茄品種浙雜502)進(jìn)行重組蛋白活性生物測定。供試番茄幼苗分三組，注射重組開花素蛋白(SEQ ID N0.4)處理組、注射不含蛋白的緩沖液處理組、自然培養(yǎng)的不處理的空白對(duì)照組，從葉脈或葉柄處進(jìn)行注射，重組蛋白的最終注射用量分別為每株2、10、50μ8，不含緩沖液為lOmmol/L磷酸緩沖液PBS (pH7.0)，每個(gè)處理有20株苗。處理的和未處理的植物苗在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)自然苗及處理苗的開花時(shí)間、開花率等開花情況。結(jié)果表明，各種處理的苗最終開花率接近，達(dá)到95%以上。但是，蛋白處理組的開花率達(dá)到90%以上的時(shí)間比未處理的自然苗和緩沖液處理的對(duì)照苗平均提前了 5天，表明重組開花素蛋白對(duì)所測番茄開花進(jìn)程有一定的促進(jìn)作用。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻開花素重組蛋白的制備方法，所述方法包括: (1)取開花期水稻葉片，用液氮研磨后，提取總RNA； (2)以水稻總RNA為模板，用擴(kuò)增引物進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆至PMD18-T，獲得重組載體pMD18-T-0sHd3a ； 所述擴(kuò)增引物序列如下: 上游引物:5，-CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3，； 下游引物:5，-GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3，； (3)測序正確的重組載體pMD18-T-0sHd3a經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel/Xhol酶切后，將含目的基因片段插入pET28b，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET28b-0sHd3a，經(jīng)過測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株 BL21 (DE3)； (4)含重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL21(DE3)在37°C活化培養(yǎng)后，挑取單菌落轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)12h，所得菌液按照1:100體積比加入到含卡那霉素50 μ g/m L的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)至OD6tltl為0.4，加入終濃度0.50mmol/L的IPTG，20°C誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD6tltl為1.0 ; (5)步驟(4)所得菌液經(jīng)分離純化，得到所述水稻開花素重組蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中還添加有2g/L的葡萄 糖。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103436551SQ201310346525
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】朱廷恒, 王渭霞, 嚴(yán)宏波, 汪琨, 崔志峰 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)