一種抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽及其應(yīng)用。該短肽的短肽片段、類似物、衍生物、變體的氨基酸主序列具有與該短肽氨基酸主序列≥70%的相同性，≥90%的相似性；短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有抗菌止癢消炎消腫的各類皮膚消毒或治療皮膚病的藥物，制備神經(jīng)性皮炎、接觸性皮炎、慢性濕疹、蟲咬性皮炎及瘙癢性皮膚病的局部治療的藥物應(yīng)用。本發(fā)明涉及的短肽分子結(jié)構(gòu)明確，生產(chǎn)技術(shù)成熟，成品無毒無害無副作用，顯著特點(diǎn)是治愈后不落疤痕，是一種優(yōu)異的外用皮膚消炎消腫止癢消毒劑或皮膚病藥物。
【專利說明】一種抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)藥領(lǐng)域，本發(fā)明更具體涉及了一種抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]各類皮膚紅腫、發(fā)炎、瘙癢是常見多發(fā)性的皮膚病，嚴(yán)重影響人們的健康，通常分為神經(jīng)性皮炎、接觸性皮炎、急慢性濕疹、蟲咬性皮炎及瘙癢性皮膚病等。目前市場上有各種膏體藥物治療皮膚病，但這些膏類藥物有的療效不佳有的有副作用而不能治愈皮膚病，有的雖然能夠治愈皮膚病，但卻會(huì)讓患者落下疤痕，主要原因是這些藥物大都是無機(jī)化合物，化學(xué)合成所得的產(chǎn)品。而用生物活性肽——來自于蛋白質(zhì)的片段的氨基酸序列所形成的短肽，做為皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕的藥物，迄今尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，研制抗菌止癢消炎消腫去疤痕的生物活性短肽及其應(yīng)用具有十分重要的意義與價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是針對上述問題，提供一種抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽及其應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明所述的一種抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽，其特征在于:
<1>組成短肽的氨基酸序列如下所示:
Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys或者
Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg 或者 Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg
<2>所述短肽的核苷酸序列是指短肽的每個(gè)氨基酸序列所對應(yīng)的3個(gè)密碼子構(gòu)成的基因序列。
[0005]本發(fā)明所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于:短肽片段的氨基酸序列具有與所述短肽氨基酸序列> 70%的相同性，或> 90%的相似性，所述片段為把所述的6個(gè)或7個(gè)氨基酸的序列從任意位置截取成3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)氨基酸組成的與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。
[0006]本發(fā)明所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的制備方法及其應(yīng)用，其短肽氨基酸序列所對應(yīng)的核苷酸的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于:短肽的核苷酸片段的堿基序列具有與所述短肽的堿基序列> 70%的相同性，^ 90%的相似性，所述片段為把所述的6個(gè)或7個(gè)氨基酸的對應(yīng)的核苷酸序列從任意位置截取成3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)氨基酸對應(yīng)的堿基序列所組成的與所述短肽的核苷酸序列具有同樣生物活性的短肽。
[0007]本發(fā)明所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的制備方法及其應(yīng)用，其短肽類似物，其特征在于:所述短肽類似物具有與所述短肽相同的生物活性，所述類似物是指在用所述短肽和另一種化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質(zhì)而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白質(zhì)。[0008]本發(fā)明所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的制備方法及其應(yīng)用，其短肽衍生物，其特征在于:所述短肽衍生物的氨基酸序列具有與所述短肽氨基酸序列> 70%的相同性，^ 90%的相似性，所述衍生物是指把所述短肽的氨基酸的序列中的氨基酸的一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸的某個(gè)基團(tuán)用另外的基團(tuán)取代后與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。
[0009]本發(fā)明所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的制備方法及其應(yīng)用，其短肽變體，其特征在于:所述短肽變體的氨基酸序列具有與所述短肽氨基酸序列> 70%的相同性，^ 90%的相似性，所述變體是指一種具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中間的任一位置缺失、插入或替換氨基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基酸或核苷酸。
[0010]本發(fā)明所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于:所述的短肽采用化學(xué)合成方法制備。
[0011]本發(fā)明所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于:所述核苷酸采用人工合成方法制備。
[0012]本發(fā)明所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于:所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有抗菌止癢消炎消腫的各類皮膚消毒或治療皮膚病的藥物。其對皮膚病恢復(fù)過程中，對皮膚細(xì)胞具有修復(fù)作用，從而使得皮膚不留疤痕，其適用于神經(jīng)性皮炎、接觸性皮炎、急慢性濕疹、蟲咬性皮炎及瘙癢性皮膚病的局部治療。
[0013]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明的短肽來自于運(yùn)用生物信息學(xué)的方法把國際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的蛋白進(jìn)行序列比對，篩選出來的一種新型的具有活性功能的生物活性肽，運(yùn)用本發(fā)明的短肽對皮膚病的治療擁有卓越的顯著功效，最大的優(yōu)點(diǎn)是治愈后皮膚不留疤痕。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明涉及的短肽殺菌效果實(shí)驗(yàn)圖。其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，無金黃色葡萄球菌長出來；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌；(c)實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，無金黃色葡萄球菌長出來；(d)對照組在48小時(shí)后長出的金黃色葡萄球菌的數(shù)量增多，顆粒明顯變大。
[0015] 圖2是患者被蚊子叮咬后，使用本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽噴劑，使用前后對比效果圖。其中(a)臨床患者的胳膊，被蚊子叮后，出現(xiàn)紅腫與瘙癢；(b)噴涂本發(fā)明的短肽噴劑，患者立刻感到不癢了 ；(C)噴涂本發(fā)明的短肽噴劑10分鐘后，紅腫完全消失，痊愈。
[0016]圖3是本發(fā)明涉及的短肽殺菌效果實(shí)驗(yàn)圖。其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，無金黃色葡萄球菌長出來；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌；(c)實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，無金黃色葡萄球菌長出來；(d)對照組在48小時(shí)后長出的金黃色葡萄球菌的數(shù)量增多，顆粒明顯變大。
[0017]圖4是本發(fā)明涉及的短肽衍生物殺菌效果實(shí)驗(yàn)圖。其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，金黃色葡萄球菌的數(shù)量明顯少于對照組；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌；
圖5是本發(fā)明涉及的短肽殺菌效果實(shí)驗(yàn)圖。其中(a)實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，無金黃色葡萄球菌長出來；(b)對照組在48小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
[0018]圖6是本發(fā)明涉及的短肽截取的短肽片段殺菌效果實(shí)驗(yàn)圖。其中(a)實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，金黃色葡萄球菌的數(shù)量明顯少于對照組；(b)對照組在48小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
[0019]圖7是本發(fā)明涉及的短肽變體殺菌效果實(shí)驗(yàn)圖。其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，金黃色葡萄球菌的數(shù)量明顯少于對照組；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
[0020]圖8是本發(fā)明涉及的短肽融合蛋白質(zhì)SOD所制得的融合蛋白殺菌效果實(shí)驗(yàn)圖。其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，金黃色葡萄球菌的數(shù)量明顯少于對照組；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
【具體實(shí)施方式】
[0021]短肽的制備方法采用化學(xué)合成的方法，即本領(lǐng)域熟知的已經(jīng)非常成熟的固相肽合成方法，既可以采用Boc方法也可以采用Fmoc方法。具體做法就是將被保護(hù)的氨基酸逐個(gè)偶聯(lián)到惰性固相載體上去，然后利用強(qiáng)酸將肽鏈從載體上裂解下來，同時(shí)去除側(cè)鏈保護(hù)。
[0022]短妝的氨基酸序列，Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys或者 Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg或者Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg為主要序列，從任意位置截取成3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)氨基酸組成的與所述短肽具有同樣生物活性的短肽片段，短肽類似物，短肽衍生物，短肽變體等都具有本發(fā)明所述的功效作用。
[0023]核苷酸采用人工合成方法制備；編碼短肽的核苷酸包含下組中的一種:
Ca)編碼具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、類似物、衍生物或其變體的核苷酸； (b)與(a)所述核苷酸互補(bǔ)的核苷酸；
(C)與(a)或(b)中所述核苷酸有> 75%相同性的核苷酸；
該核苷酸基本由編碼具有〈1>所述的氨基酸序列短肽的核苷酸組成，本發(fā)明的核苷酸序列，其形式為DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的也可以是雙鏈的。編碼短肽的編碼區(qū)序列可以和〈2>中的核苷酸相同，也可以不同，稱為變異體，其中變異體是指具有編碼權(quán)利要求1中的氨基酸序列的編碼，但可以和〈2>中的核苷酸不同。變異體可以是一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸序列，但不會(huì)改變編碼〈1>中氨基酸序列的短肽的活性功能。
[0024]該短肽或核苷酸的“變體”是指一種具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列。改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入、添加或替換。變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，也可以有“非保守性”改變，其中替換的氨基酸不具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)。“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸的缺失；“插入”是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中間任意位置插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸；“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸；“替換”是指用不同的氨基酸或核苷酸替換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸。
[0025]該短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備抗菌止癢消炎消腫包括但不限于下述疾病的藥物的用途:1.神經(jīng)性皮炎:慢性單純性苔蘚，包括局限性神經(jīng)性皮炎和彌漫性神經(jīng)性皮炎。
[0026]2.接觸性皮炎:包括變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎和刺激性接觸性皮炎以及速發(fā)型接觸性反應(yīng)、光毒性及光變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎等。
[0027]3.急慢性濕疹:包括急性濕疹、亞急性濕疹和慢性濕疹。
[0028]4.蟲咬性皮炎:包括蚊蟲叮咬后引起的皮炎。
[0029]5.瘙癢性皮膚病:包括普通型和過敏性皮膚瘙癢癥。
[0030]6.外陰瘙癢癥:包括肛門、陰唇和陰囊瘙癢癥。
[0031]在計(jì)算短肽片段、短肽衍生物和短肽變體的氨基酸主序列具有與短肽氨基酸主序列的相同性和相似性時(shí)，“相同性百分率”是指兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同的百分率。根據(jù) Cluster 法(Higging D.G.& Sharp P.M., Gene 1988，73:234-237 )通過檢查所有配對之間的距離將各組序列排列成簇，然后將各簇以成對或成組分配。兩個(gè)氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率通過下式計(jì)算:
__mi A鼙序到B之_匹配讓幾.纂個(gè)數(shù)父100%
序到A鐘幾.基個(gè)數(shù)-序列A中間__蔑?個(gè)數(shù)-序列B宇變*個(gè).“相似性”是指在確定兩條氨基酸序列比對中相同氨基酸序列位置確定后，在相同氨基酸之間排列的對應(yīng)的氨基酸的保守性取代程度。根據(jù)生物信息【技術(shù)領(lǐng)域】周知的氨基酸得分 PAM 250 scoring matrix (Dayhoff, M.Schwartz, R.M.and Orcutt, B.C.Atlasof Protein Structure 1978， 345-352 ； DeLisij C.and Kanehisaj M.MathematicalBiosciences 1984.69: 77-85 ；Schwartz, R.M.and Dayhoffj M.0.Atlas of ProteinStructure, 1979.353-358)，當(dāng)相對應(yīng)的不同氨基酸比較得分> O時(shí)，該兩個(gè)氨基酸相似；當(dāng)不同氨基酸得分< O時(shí)，兩個(gè)氨基酸不相似。兩個(gè)氨基酸序列如序列C和序列D之間的相似性百分率通過下式計(jì)算:
(序列C與If列1>之_區(qū)配的殘基個(gè)ft+ff列C與序列6之__似_.基個(gè)數(shù))X 100?mi c Μ*基個(gè)數(shù)-序列c中間11的鰻基個(gè)歡-序到1.中___獲基個(gè)數(shù)其中，序列C中間隔的殘基個(gè)數(shù)和序列D中間隔的殘基個(gè)數(shù)都不包括相似氨基酸的個(gè)數(shù)。
[0032]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施舉例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列所有列舉實(shí)施例所涉及的所有合成短肽都具有本發(fā)明涉及的藥物功能而不限于所列舉功能。
[0033]實(shí)施例1
抗菌實(shí)驗(yàn)效果(合成本發(fā)明涉及的短肽:Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg)
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽，經(jīng)過HPLC純化后，純度超過97%，采用金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。即先將菌斜面接種活化，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，次日觀察斜面長出純金黃色葡萄球菌；對于已經(jīng)活化的金黃色葡萄球菌取少量與IOOml液體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中進(jìn)行搖床(37°C，150r/min)培養(yǎng)12h，后可看到培養(yǎng)液由澄清變成渾濁。將本發(fā)明涉及的短肽制成濃度為0.1 mg/ml的液體，取100ml，加入到固體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl2.5g和瓊脂7.5g)存在的培養(yǎng)皿中，涂均勻，同時(shí)，不加短肽的空白作為對照；最后再加入SOul的已經(jīng)被稀釋40000倍的菌懸液，在培養(yǎng)皿平板上涂均勻，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別與24h和48h后觀察記錄菌體生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從培養(yǎng)24h和48h后的結(jié)果觀察到，本發(fā)明涉及的短肽對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用(附圖1所示)，其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，無金黃色葡萄球菌長出來；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌；(c)實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果,無金黃色葡萄球菌長出來；(d)對照組在48小時(shí)后長出的金黃色葡萄球菌的數(shù)量增多，顆粒明顯變大。
[0034]實(shí)施例2
神經(jīng)性皮炎(合成本發(fā)明涉及的短肽:Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys)
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽，經(jīng)過HPLC純化后，純度超過97%，采用金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。即先將菌斜面接種活化，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，次日觀察斜面長出純金黃色葡萄球菌；對于已經(jīng)活化的金黃色葡萄球菌取少量與IOOml液體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中進(jìn)行搖床(37°C，150r/min)培養(yǎng)12h，后可看到培養(yǎng)液由澄清變成渾濁。將本發(fā)明涉及的短肽制成濃度為0.1 mg/ml的液體，取100ml，加入到固體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl
2.5g和瓊脂7.5g)存在的培養(yǎng)皿中，涂均勻，同時(shí)，不加短肽的空白作為對照；最后再加入SOul的已經(jīng)被稀釋40000倍的菌懸液，在培養(yǎng)皿平板上涂均勻，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別與24h和48h后觀察記錄菌體生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從培養(yǎng)24h和48h后的結(jié)果觀察到，本發(fā)明涉及的短肽對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用(附圖3所示)，其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果,無金黃色葡萄球菌長出來；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌；(c)實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果,無金黃色葡萄球菌長出來；(d)對照組在48小時(shí)后長出的金黃色葡萄球菌的數(shù)量增多，顆粒明顯變大。
[0035]臨床病例1，福州市鼓樓區(qū)蔣女士，年齡36歲，脖子頸部出扁平丘疹，劇癢難耐，抓撓皮破，醫(yī)生診斷為神經(jīng)性皮炎，使用醫(yī)生所開藥膏，無顯著療效，服用消炎藥，也無明顯效果，依舊奇癢無比。改用本 發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽制備成的噴劑，涂上后，癢立刻消失，紅腫漸漸消失，3天后痊愈。
[0036]實(shí)施例3
接觸性皮炎(合成本發(fā)明涉及的短肽衍生物，在酪氨酸加磷酸類基團(tuán)修飾:T yr/7 -Leu-Tyr-G I u_Va 1-AI a-Arg )
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽，在酪氨酸Tyr的R基團(tuán)用磷酸基團(tuán)取代，經(jīng)過HPLC純化后，純度超過98%，用超純水溶解本發(fā)明的肽，制備成10ug/ml的溶液，裝入噴劑瓶。
[0037]采用金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。即先將菌斜面接種活化，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，次日觀察斜面長出純金黃色葡萄球菌；對于已經(jīng)活化的金黃色葡萄球菌取少量與IOOml液體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中進(jìn)行搖床(37°C，150r/min)培養(yǎng)12h，后可看到培養(yǎng)液由澄清變成渾濁。將本發(fā)明涉及的短肽衍生物制成濃度為0.1 mg/ml的液體，取100ml，加入到固體培養(yǎng)基存(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和瓊脂7.5g)在的培養(yǎng)皿中，涂均勻，同時(shí)，不加短肽的空白作為對照；最后再加入80ul的已經(jīng)被稀釋40000倍的菌懸液，在培養(yǎng)皿平板上涂均勻，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別與24h和48h后觀察記錄菌體生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從培養(yǎng)24h和48h后的結(jié)果觀察到，本發(fā)明涉及的短肽對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用(附圖4所示)，其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，金黃色葡萄球菌長的數(shù)量明顯少于對照組；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
[0038]臨床病例2，福州市臺(tái)江區(qū)溫先生，年齡25歲，系褲腰帶接觸皮膚導(dǎo)致腰部皮膚紅腫、泡狀、觸癢，使用上述方法制備的本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽制備成的噴劑，涂上后，接觸即不癢了，2小時(shí)后紅腫消失，泡緊縮，破皮處結(jié)硬殼，3天痊愈，未留下任何疤痕。
[0039]實(shí)施例4
急慢性濕疫(合成本發(fā)明涉及的短肽:Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg)
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽，經(jīng)過HPLC純化后，純度超過99%，用超純水溶解本發(fā)明的肽，制備成100 ug/ml的溶液，裝入噴劑瓶。
[0040]臨床病例3，福州市鼓樓區(qū)林小姐，年齡25歲，不明原因腳面紅腫、泡狀、奇癢難耐，醫(yī)生診斷為丘疹皮炎，使用醫(yī)生所開藥膏，無顯著療效，口服消炎藥物，也無顯著效果，半個(gè)月有余，無法忍受奇癢，后改用應(yīng)用上述方法制備的本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽制備成的噴劑，噴涂后，立即止癢，3天痊愈。
[0041]實(shí)施例5
蟲咬性皮炎(合成本發(fā)明涉及的短肽:Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1Ie-Arg)
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽，經(jīng)過HPLC純化后，純度超過98.5%，用超純水溶解本發(fā)明的肽，制備成I mg/ml的溶液，裝入噴劑瓶。
[0042]采用金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。即先將菌斜面接種活化，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，次日觀察斜面長出純金黃色葡萄球菌；對于已經(jīng)活化的金黃色葡萄球菌取少量與IOOml液體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中進(jìn)行搖床(37°C，150r/min)培養(yǎng)12h，后可看到培養(yǎng)液由澄清變成渾濁。將本發(fā)明涉及的短肽制成濃度為0.1 mg/ml的液體,取100ml,加入到固體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和瓊脂7.5g)存在的培養(yǎng)皿中，涂均勻，同時(shí)，不加短肽的空白作為對照；最后再加入80ul的已經(jīng)被稀釋40000倍的菌懸液，在培養(yǎng)皿平板上涂均勻，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別與24h和48h后觀察記錄菌體生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從培養(yǎng)24h和48h后的結(jié)果觀察到，本發(fā)明涉及的短肽對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用(附圖5所示)，其中(a)實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，無金黃色葡萄球菌長出來；(b)對照組在48小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
[0043]臨床病例4，福州市鼓樓區(qū)陶小姐，年齡27歲，夜晚睡覺被螨蟲叮咬， 渾身腿部遍布紅斑，奇癢，把應(yīng)用上述方法制備的本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽，噴劑噴涂腿部后，立即止癢，I天內(nèi)紅斑消失，痊愈。
[0044]實(shí)施例6
蟲咬性皮炎(合成本發(fā)明涉及的短肽片段，在序列中截取4個(gè)或者5個(gè)氨基酸:Leu-Tyr-Glu-Val 或 Tyr-Glu-Val-Ala-Arg)
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽Leu-Tyr-Glu-Val和Tyr-Glu-Val-Ala-Arg,經(jīng)過HPLC純化后，純度超過97.8%,96.3%，用超純水分別溶解本發(fā)明的肽，制備成I mg/ml的溶液，裝入噴劑瓶。
[0045]采用金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。即先將菌斜面接種活化，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，次日觀察斜面長出純金黃色葡萄球菌；對于已經(jīng)活化的金黃色葡萄球菌取少量與IOOml液體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中進(jìn)行搖床(37°C，150r/min)培養(yǎng)12h，后可看到培養(yǎng)液由澄清變成渾濁。將本發(fā)明涉及的短肽片段制成濃度為0.1 mg/ml的液體，取100ml，加入到固體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏
2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和瓊脂7.5g)存在的培養(yǎng)皿中，涂均勻，同時(shí)，不加短肽的空白作為對照；最后再加入80ul的已經(jīng)被稀釋40000倍的菌懸液，在培養(yǎng)皿平板上涂均勻，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別與24h和48h后觀察記錄菌體生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從培養(yǎng)24h和48h后的結(jié)果觀察到，本發(fā)明涉及的短肽對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用(附圖6所示)，其中(a)實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，金黃色葡萄球菌的數(shù)量明顯少于對照組；(b)對照組在48小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
[0046]臨床病例5，福州市臺(tái)江區(qū)傅小姐，年齡22歲，大學(xué)生，在宿舍，蚊子多，腿部被蚊子叮咬的都是紅色的包，早晨起床后，發(fā)現(xiàn)遍布小腿的紅腫的包，立刻噴涂把應(yīng)用上述方法制備的本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽后，立即止癢，10分鐘內(nèi)部分紅腫的包消失，一個(gè)小時(shí)內(nèi)，皮膚恢復(fù)常態(tài)，看不出任何被蚊子叮咬過的痕跡，沒有明顯疤痕出現(xiàn)。
[0047]實(shí)施例7
蟲咬性皮炎(合成本發(fā)明涉及的短肽:Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1Ie-Arg)
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽，經(jīng)過HPLC純化后，純度超過99.1%，用超純水溶解本發(fā)明的肽，制備成I mg/ml的溶液，裝入噴劑瓶。
[0048]臨床病例6，福州市鼓樓區(qū)李女士，年齡51歲，是過敏性皮膚，被蚊子叮咬后，皮膚經(jīng)常紅腫，并且紅腫面積經(jīng)常越來越大，癢也越來越嚴(yán)重，經(jīng)常要3、4天才會(huì)好，且經(jīng)常留有痕跡。她在被蚊子叮咬后，立刻噴涂把應(yīng)用上述方法制備的本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽后，立即止癢，10分鐘內(nèi)紅腫消失，半小時(shí)內(nèi)，皮膚恢復(fù)常態(tài)，看不出任何被蚊子叮咬過的痕跡。如附圖2所示:其中(a)臨床患者的李女士的胳膊，被蚊子叮后，出現(xiàn)紅腫與瘙癢；(b)在被叮咬部位噴涂本發(fā)明的短肽噴劑，患者立刻感到不癢了 ；(c)噴涂本發(fā)明的短肽噴劑10分鐘后，紅腫完全消失，痊愈。
[0049]實(shí)施例8
瘙癢性皮膚病(合成本發(fā)明涉及的短肽變體，即在序列的N端增加一個(gè)Gla氨基酸:Gla- Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg)
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽變體，即在N端增加一個(gè)Gla氨基酸，合成短肽序列變體序列Gla- Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg,經(jīng)過HPLC純化后，純度超過99.1%,用超純水溶解本發(fā)明的肽，制備成I mg/ml的溶液,裝入噴劑瓶。
[0050]采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽變體，即在短肽中間插入一個(gè)Tyr氨基酸，合成短肽序列變體序列Tyr-Leu-Tyr-Glu-Tyr-Val-1le-Arg,經(jīng)過HPLC純化后,純度超過98.6%，用超純水溶解本發(fā)明的肽，制備成I mg/ml的溶液，裝入噴劑瓶。
[0051]采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽變體，即在短肽中間把Glu替換成一個(gè)Tyr氨基酸,合成短肽序列變體序列Tyr-Leu-Tyr-Tyr-Val-Ala-Arg,經(jīng)過HPLC純化后,純度超過97.6%，用超純水溶解本發(fā)明的肽，制備成I mg/ml的溶液，裝入噴劑瓶 。[0052]采用金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。即先將菌斜面接種活化，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，次日觀察斜面長出純金黃色葡萄球菌；對于已經(jīng)活化的金黃色葡萄球菌取少量與IOOml液體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中進(jìn)行搖床(37°C，150r/min)培養(yǎng)12h，后可看到培養(yǎng)液由澄清變成渾濁。將本發(fā)明涉及的短肽變體Gla- Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1Ie-Arg制成濃度為 0.1 mg/ml 的液體,取 100ml,加入到固體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和瓊脂7.5g)存在的培養(yǎng)皿中，涂均勻，同時(shí)，不加短肽的空白作為對照；最后再加入80ul的已經(jīng)被稀釋40000倍的菌懸液，在培養(yǎng)皿平板上涂均勻，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別與24h和48h后觀察記錄菌體生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從培養(yǎng)24h和48h后的結(jié)果觀察到，本發(fā)明涉及的短肽對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用(附圖7所示)，其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，金黃色葡萄球菌的數(shù)量明顯少于對照組；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
[0053]同樣的，對短妝變體 Gla-Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1Ie_Arg、Tyr-Leu-Tyr-Glu-Tyr-Val-1le-Arg和Tyr-Leu-Tyr-Tyr-Val-Ala-Arg也做了相應(yīng)抗菌實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)施例中的短肽變體Gla- Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差別，故在此不作復(fù)述。
[0054]臨床病例7，沈陽市沈河區(qū)李先生，皮膚干燥，奇癢難耐，分別在身體不同部位噴涂應(yīng)用上述方法制備的本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽噴劑后，立即止癢，效果非常明顯。
[0055]實(shí)施例9
外陰瘙癢癥性皮膚病(合成本發(fā)明涉及的短肽=Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg)
采用固相Fmoc方法化學(xué)合成本發(fā)明短肽，經(jīng)過HPLC純化后，純度超過97.1%，用超純水溶解本發(fā)明的肽，制備成I mg/ml的溶液，裝入噴劑瓶。
[0056]臨床病例8，福州市鼓樓區(qū)李先生，年齡51歲，外陰部瘙癢，噴涂本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽制備成的噴劑，立即止癢，當(dāng)天痊愈。
[0057]實(shí)施例10 外陰瘙癢癥性皮膚病
采用本發(fā)明涉及的短肽Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg的核苷酸序列,應(yīng)用基因重組技術(shù)融合蛋白質(zhì)SOD (人超氧化物歧化酶)，純化后所得融合蛋白。
[0058]采用金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。即先將菌斜面接種活化，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，次日觀察斜面長出純金黃色葡萄球菌；對于已經(jīng)活化的金黃色葡萄球菌取少量與IOOml液體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中進(jìn)行搖床(37°C，150r/min)培養(yǎng)12h，后可看到培養(yǎng)液由澄清變成渾濁。將本發(fā)明涉及的融合蛋白制成濃度為0.1 mg/ml的液體,取100ml,加入到固體培養(yǎng)基(配制500ml體系中，牛肉膏
2.5g，蛋白胨7.5g，NaCl 2.5g和瓊脂7.5g)存在的培養(yǎng)皿中，涂均勻，同時(shí)，不加短肽的空白作為對照；最后再加入80ul的已經(jīng)被稀釋40000倍的菌懸液，在培養(yǎng)皿平板上涂均勻，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別與24h和48h后觀察記錄菌體生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從培養(yǎng)24h和48h后的結(jié)果觀察到，本發(fā)明涉及的短肽對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用(附圖8所示)，其中(a)實(shí)驗(yàn)組24小時(shí)培養(yǎng)的結(jié)果，金黃色葡萄球菌的數(shù)量明顯少于對照組；(b)對照組在24小時(shí)后長出金黃色葡萄球菌。
[0059]臨床病例9，福州市鼓樓區(qū)王女士，年齡31歲，外陰部瘙癢，噴涂應(yīng)用上述方法制備的本發(fā)明的皮膚抗菌止癢消炎消腫去疤痕短肽噴劑后，立即止癢，當(dāng)天痊愈。
[0060]SEQUENCE LISTING 〈110〉李昊
〈120〉一種抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽及其應(yīng)用
〈160〉 3
〈210〉 I
〈211〉 6
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈400〉 I
Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
I5
〈210〉 2
〈211〉 7
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈400〉 2
Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg
I5
〈210〉 3
〈211〉 7
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈400〉 3
Tyr Leu Tyr Glu Val He Arg
15
〈210〉 4
〈211〉 4
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈400〉 4
Leu Tyr Glu Val
1
【權(quán)利要求】
1.一種抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽，其特征在于:組成短肽的氨基酸序列如下所示: Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys或者 Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala-Arg 或者
Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-1le-Arg 。
2.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述短肽的核苷酸。
3.—種如權(quán)利要求1所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的短肽片段，其特征在于:所述短肽片段為將所述的6個(gè)或7個(gè)氨基酸的序列從任意位置截取成3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)氨基酸組成的，且具有抗菌止癢消炎消腫去疤痕活性的短肽片段。
4.一種如權(quán)利要求2所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的短肽片段，其特征在于:所述短肽片段的核苷酸片段為把所述的6個(gè)或7個(gè)氨基酸的對應(yīng)的核苷酸序列從任意位置截取成3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)氨基酸對應(yīng)的堿基序列所組成的，且具有抗菌止癢消炎消腫去疤痕活性的短肽片段。
5.一種如權(quán)利要求1所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的類似物，其特征在于:所述短肽類似物是指在用所述短肽和另一種化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質(zhì)而形成，且具有抗菌止癢消炎消腫去疤痕活性的多肽序列或蛋白質(zhì)。
6.一種如權(quán)利要求1所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的衍生物，其特征在于:所述短肽衍生物是指把所述短肽的氨基酸的序列中的氨基酸的一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸的某個(gè)基團(tuán)用另外的基團(tuán)取代后，且具有抗菌止癢消炎消腫去疤痕活性的短肽。
7.—種如權(quán)利要求1所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的變體，其特征在于:所述短肽變體是指一種具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中間的任一位置缺失、插入或替換氨基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基酸或核苷酸。
8.—種如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的抗菌止癢消炎消腫去疤痕的短肽的應(yīng)用，其特征在于:所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體制備具有抗菌止癢消炎消腫的皮膚消毒或治療皮膚病的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的皮膚病為神經(jīng)性皮炎、接觸性皮炎、慢性濕疹、蟲咬性皮炎、瘙癢性皮膚病或外陰瘙癢癥。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103467569SQ201310346091
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月10日
【發(fā)明者】李 昊 申請人:李 昊