利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌及構建方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌及構建方法和用途，利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌其保藏編號為CGMCC?No.?7999；構建方法為：敲除大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并過量表達乙醛酸循環的關鍵酶異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶，得到進化的出發菌株；并通過進化，得到能夠在以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基中生長的并且乙醛酸循環的通量得到增強的進化菌株；敲除琥珀酸脫氫酶基因、過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脫氫酶系，得到利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌。該菌株生長速度快，菌體密度高，從而提高甘油生產琥珀酸的生產速率。
【專利說明】利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌及構建方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，涉及一種利用甘油生產琥珀酸的菌株及其構建方法和應用。
【背景技術】
[0002]琥珀酸又稱丁二酸，它作為一種重要的原料在醫藥、食品、塑料、油漆、農藥、染料以及表面活性劑等行業有著廣泛的用途。它還是一種重要的平臺化合物，可用于合成四氫呋喃、η -甲基吡咯烷酮、2 -吡咯烷酮及丁二醇等。
[0003]琥珀酸的合成方法包括化學合成法和微生物發酵法。其中微生物發酵法由于其環境污染小，成本低，越來越受到各國科研工作者的關注。微生物發酵法生產琥珀酸所用的菌株主要包括產琥珀酸放線桿菌、產琥珀酸厭氧螺菌、谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌等。其中大腸桿菌作為研究最多的模式微生物，其代謝途徑比較清楚，基因組信息和調控信息比較全面，各種基因操作手段比較成熟，因此大腸桿菌被廣泛用來通過代謝工程的手段生產琥珀酸。近年來由于生物柴油產業的迅猛發展，甘油作為其主要的副產物成為了一種廉價和豐富的工業微生物發酵原料。通過微生物發酵的方式以甘油為底物來生產有價值的化工產品和能源例如有機酸、1，3 -丙二醇、乙醇和氫氣等成為目前研究的熱點。利用大腸桿菌以甘油為底物生產琥珀酸的研究主要使用厭氧條件或微好氧條件，通過失活副產物途徑和增強羧化途徑來提高琥珀酸產量。但是由于大腸桿菌在厭氧條件或微好氧條件下的甘油利用速率和生長速率非常緩慢，因此琥珀酸生產速率也相對較低，從而限制了工業化生產。
[0004]構建好氧條件的琥珀酸生產菌株普遍使用的代謝工程策略包括失活琥珀酸脫氫酶使琥珀酸作為終產物積累、敲除副產物生成途徑、增強羧化途徑和激活乙醛酸循環作為第二條琥珀酸生產途徑等。乙 醛酸循環作為其中一條琥珀酸生成途徑對于提高琥珀酸產量有非常重要的作用。由于乙醛酸循環受到許多因素的調控，因此通過基因工程的手段調控其通量效果比較有限。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種能在好氧條件利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌。
[0006]本發明的第二個目的是提供一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌的構建方法。
[0007]本發明的第三個目的是提供一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌的用途。
[0008]本發明的技術方案概述如下:
[0009]—種利用甘油生產琥拍酸的大腸埃希氏菌(Escherichia coli),其保藏編號為CGMCC N0.7999。
[0010]一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌的構建方法，包括如下步驟:
[0011](I)敲除大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并過量表達乙醛酸循環的關鍵酶異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶，得到進化的出發菌株；
[0012](2)將步驟(I)獲得的菌株通過在以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基中連續轉接培養的方式進行進化，得到能夠在以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基中生長的并且乙醛酸循環的通量得到增強的進化菌株；
[0013](3)將步驟(2)獲得的菌株通過敲除琥珀酸脫氫酶基因、過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脫氫酶系，得到利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。
[0014]一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌的用途，包括如下步驟:
[0015]在發酵罐中，裝入以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基，以6%_8%的體積比將一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌接入所述培養基中，在28-40°C，通氣速度為
0.5-1.5vvm，通過調節攪拌速率控制溶氧在飽和溶氧的30%以上，全程控制pH在6.8-7.3，發酵50-60小時，得到含琥珀酸的發酵液。
[0016]本發明的優點:
[0017]本發明采用定性途徑進化的方式來增強乙醛酸循環的通量，這種進化方式具有途徑定向性，且未見公開，可廣泛應用于潛在途徑的激活。本發明得到了能夠高效利用甘油為底物生產琥珀酸的菌株。本發明的發酵條件可以加快菌體生長速度，提高菌體密度，從而提高甘油生產琥珀酸的生產速率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為菌種構建示意圖。
`[0019]圖2為代謝網絡圖。
[0020]圖3為實施例1中敲除ppc基因的電泳鑒定圖。
[0021]圖4為實施例1中置換aceBA啟動子的電泳鑒定圖。
[0022]圖5為實施例3中敲除sdhCDAB的電泳鑒定圖。
[0023]圖6為實施例3中置換ppc啟動子的電泳鑒定圖。
[0024]圖7為實施例3中置換sucAB啟動子的電泳鑒定圖。
【具體實施方式】
[0025]下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明，下面的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但不對本發明作任何限制。
[0026]本發明一種利用甘油生產琥拍酸的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)命名為BPB18SPS，于2013年8月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，并已存活，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101，電話:010-64807355，其微生物保藏編號為CGMCC N0.7999。
[0027]實施例1
[0028]構建定向途徑進化的出發菌株
[0029](I)敲除大腸桿菌BL21 (DE3)(購自Novagen公司)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并過量表達乙醛酸循環的關鍵酶異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶，得到進化的出發菌株；
[0030]敲除大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的具體操作如下:[0031]利用擴增引物Kanl/Kan2以質粒pKD3 (購自CGSC)為模板擴增氯霉素抗性基因，在Hind III /Sal I位點克隆到質粒pUC18 (購自Invitrogen公司)中得到質粒pCMOl。
[0032]利用擴增引物Poutl/Pout2以大腸桿菌BL21 (DE3)的基因組為模板擴增ppc基因的上游同源臂，在Hind III位點克隆到質粒pCMOl中，獲得質粒pCMppcH。
[0033]利用擴增引物Pout3/Pout4以大腸桿菌BL21 (DE3)的基因組為模板擴增ppc基因的下游同源臂，在BamH I /Sac I位點克隆到質粒pCMppcH中，獲得質粒pCMppcHR。
[0034]以質粒pCMppcHR為模板，利用擴增引物Pout5/Pout6擴增得到的片段電轉到含有質粒PKD46 (購自CGSC)的大腸桿菌BL21(DE3)的電轉感受態中。用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。氯霉素抗性基因再用含有FLP重組酶的質粒pCP20(購自CGSC)刪掉，從而得到ppc基因敲除的菌株BP。
[0035](2)過量表達乙醛酸循環的關鍵酶異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶是通過將aceBA操縱子的啟動子置換為trc強啟動子來實現的。
[0036]具體操作如下:
[0037]首先利用擴增引物Trcl/Trc2,以質粒pTrc99a(購自addgene)為模板,擴增trc啟動子，并將擴增得到的片段克隆在質粒PUC18的BamH I /EcoR I位點處,得到質粒pUCtrc。再以PKD4 (購自CGSC)為模板，用引物Kanl/Kan2擴增卡那霉素抗性基因，并將擴增得到的片段克隆到質粒pUCtrc的Hind III /Sal I位點,得到質粒pKMtrc。
[0038]將質粒PKD46轉入步驟(I)獲得的ppc基因敲除的菌株BP中并制作成電轉感受態；利用含有50bp同源臂的引物Ace3/Ace4，以質粒pKMtrc為模板擴增得到的片段轉入本步驟獲得的電轉感受態，并用卡那霉素篩選陽性克隆。卡那霉素抗性基因用含有FLP重組酶的質粒pCP20刪掉，從而得到定向途徑進化的出發菌株BPB。
[0039]實施例2
[0040]通過定向途徑進化的方式提高乙醛酸循環的通量
[0041]為了提高乙醛酸循環的通量來降低琥珀酸生產中副產物α-酮戊二酸的積累，以菌株BPB為出發菌株采用定向途徑進化的方式來增強乙醛酸循環的通量。
[0042]具體操作如下:將實施例1獲得的菌株BPB在以甘油為唯一碳源的Μ9基本鹽培養基中培養，培養條件為37° C，220rpm，并在菌體生長的對數期進行連續轉接培養，轉接的時間間隔為12小時，培養到100代時，分離到能在以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基中以比生長速率0.41 1生長的菌株，取其中一株，命名為BPB18。對菌株BPB18進行單基因敲除驗證，發現乙醛酸循環成為其最主要的回補途徑。通過定向途徑進化，該菌株的乙醛酸循環通量得到提高。
[0043]以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基的配制方法為:取Na2HP046.8g，KH2P043g,NaCl0.5g, NH4Cllg ；MgS04.7H200.49g ；CaCl2.2H200.015g ；FeS04.7H202.8X 10_4g ；硫胺素.HCll.0X l(T7g ;CoCl2.6Η207.I X l(T6g，(NH4)6Mo7O24.4H203.7 X 10_6g,MnCl2.4Η201.6Xl(T5g，CuS042.41 X l(T6g，ZnSO4.7Η202.8X l(T6g，H3B042.5 X 10_5g ；3-(N-嗎啉基)
[0044]丙磺酸20.9g ;甘油10g，加蒸餾水至1L。
[0045]實施例3
[0046]通過基因工程的方法構建琥珀酸高產菌株[0047]以進化菌株BPB18為出發菌株，通過基因工程手段包括敲除琥珀酸脫氫酶基因、過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脫氫酶系構建得到能夠利用甘油為底物高效生產琥珀酸的菌株。其中過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脫氫酶系是通過將各自的啟動子置換為trc強啟動子來實現的。
[0048](I)敲除琥珀酸脫氫酶基因sdhCDAB的具體操作如下:將質粒pKD46轉入實施例2獲得的進化菌株BPB18中并制作成電轉感受態；利用包含45bp上下游同源臂的引物Sdhl/Sdh2，以pKD4為模板，擴增包含卡那霉素抗性基因和上下游同源臂的片段，電轉入含有質粒PKD46的本步驟獲得的電轉感受態，并用卡那霉素篩選陽性克隆。卡那霉素抗性基因用含有FLP重組酶的質粒pCP20刪掉，從而得到敲除琥珀酸脫氫酶基因的菌株BPB18S。該菌株能夠將琥珀酸作為終產物積累。但是由于琥珀酸脫氫酶基因的缺失使得乙醛酸循環無法作為回補途徑，因而該菌株無法在以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基中生長，因此需要將磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因恢復。
[0049](2)過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的具體操作如下:在大腸桿菌BL21 (DE3)中以置換aceBA啟動子同樣的步驟置換ppc基因的啟動子，并以成功發生同源重組的陽性克隆的基因組為模板，以P0ut5/P0ut6為擴增引物，擴增包含上下游同源臂、氯霉素抗性基因和trc啟動子的片段。將質粒pKD46轉入本實施例獲得的菌株BPB18S中并制作成電轉感受態；并將本步驟獲得的片段電轉入本步驟獲得的電轉感受態中。用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。氯霉素抗性基因再用含有FLP重組酶的質粒PCP20刪掉，從而得到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶過量表達的菌株BPB18SP。該菌株由于恢復了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，因此能夠在以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基中生長，并能高效生產琥珀酸。
[0050]為了進一步降低副產物α-酮戊二酸的積累，本發明還過量表達了 α-酮戊二酸脫氫酶系。具體操作如下:利用擴增引物Trcl/Trc2,以質粒pTrc99a為模板,擴增trc啟動子，并將擴增得到的片段克隆在質粒PCMOl的BamH I /EcoR I位點處，得到質粒pCMtrc。利用擴增引物SU1/SU2以大腸桿菌BL2`1 (DE3)的基因組為模板擴增sucAB基因的上游同源臂,在Hind III位點克隆到質粒pCMtrc中，獲得質粒pCMtrcH。利用擴增引物SU4/U4以大腸桿菌BL21(DE3)的基因組為模板擴增sucAB基因的下游同源臂，在EcoR I位點克隆到質粒PCMtrcH中，獲得質粒pCMtrcHR。然后以該質粒為模板，利用弓I物SU3/U6擴增PCR片段用于電轉。用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。氯霉素抗性基因再用含有FLP重組酶的質粒pCP20刪掉，從而得到α -酮戊二酸脫氫酶系過量表達的菌株BPB18SPS并進行保藏，保藏號為CGMCC N0.7999。該菌株在發酵時副產物α -酮戊二酸的積累量大大減少。
[0051]表I菌株構建所用引物序列
[0052]
【權利要求】
1.一種利用甘油生產琥拍酸的大腸埃希氏菌(Escherichia coli),其保藏編號為CGMCC N0.7999。
2.權利要求1的一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌的構建方法，其特征包括如下步驟:(I)敲除大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并過量表達乙醛酸循環的關鍵酶異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶，得到進化的出發菌株； (2)將步驟(I)獲得的菌株通過在以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基中連續轉接培養的方式進行進化，得到能夠在以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基中生長的并且乙醛酸循環的通量得到增強的進化菌株； (3)將步驟(2)獲得的菌株通過敲除琥珀酸脫氫酶基因、過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脫氫酶系，得到利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)。3.權利要求1的一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌的用途，其特征是包括如下步驟:在發酵罐中，裝入以甘油為唯一碳源的M9基本鹽培養基，以6%-8%的體積比將一種利用甘油生產琥珀酸的大腸埃希氏菌接入所述培養基中，在28-40°C，通氣速度為.0.5-1.5vvm，通過調節攪拌速率控制溶氧在飽和溶氧的30%以上，全程控制pH在6.8-7.3，發酵50-60小時，得到含琥珀酸.的發酵液。
【文檔編號】C12R1/19GK103436477SQ201310358766
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月15日 優先權日:2013年8月15日
【發明者】陳濤, 李寧, 王智文, 趙學明 申請人:天津大學