一種水霉菌絲的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要是涉及一種水霉菌絲的提取方法。具體步驟：菌株活化培養(yǎng)、菌株菌絲固體培養(yǎng)、液體菌絲體培養(yǎng)等。水霉菌的特征在于其包括寄生水霉（saprolegniaparasitica），保藏號(hào)為ATCC200013TM；多子水霉(saprolegniaferax)保藏于國家水生動(dòng)物病原庫。本發(fā)明的目的是通過對(duì)兩種不同培養(yǎng)基上水霉菌的培養(yǎng)，得到一種可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲取較多水霉菌絲的一種方法。
【專利說明】一種水霉菌絲的提取方法
[0001]【【技術(shù)領(lǐng)域】】
本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是一種關(guān)于菌絲的提取方法。
[0002]【【背景技術(shù)】】
水霉科是一類水生真菌，廣泛分布于淡水中，幾乎感染所有的淡水魚類和粘性魚卵，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國內(nèi)外對(duì)于水霉菌的研究主要集中在水霉病的癥狀描述，病原菌的鑒定，致病條件的探討，防治方法的摸索以及一些分子水平方面的研究，而在分子實(shí)驗(yàn)中水霉菌絲樣品的制備很是重要。因此，在開展分子實(shí)驗(yàn)時(shí)，最基本步驟需獲得純水霉菌絲，一種有效、簡單的樣品制備方法會(huì)使的研究工作更加順利，研究成果更加可靠。為此特發(fā)明了一種水霉菌絲高效簡易的提取方法。
[0003]中國專利文獻(xiàn)CN1090717公開了一種人參真菌及其提取物的制備方法及人參真菌提取物用途。中國專利文獻(xiàn)CN1075654公開了一種人含茯苓菌絲或其提取物的制劑及其制備方法。但是關(guān)于提取水霉菌絲的簡易方法的專利目前還未見報(bào)道。
[0004]【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種適用于水霉菌絲的高效提取方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
(I)水霉菌的提取: I)孢子懸液的制備
將水霉菌(寄生水霉和多子 水霉)接種于放有無菌油菜籽的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，于20 V恒溫條件下培養(yǎng)直至油菜籽上長滿菌絲；在六孔板中加入無菌水，將長滿菌絲的油菜籽放入六孔板中；然后于20 V恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后于顯微鏡下觀察水霉菌絲孢子的釋放情況，當(dāng)孢子數(shù)量達(dá)到一定量以后，再將菜籽取出。
[0006]2)水霉菌絲的提取
在六孔板中加入沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，置于20 V恒溫條件下培養(yǎng)直至長出菌絲；然后用無菌的鑷子夾出菌絲，于無菌水中漂洗3~4次，用無菌的濾紙吸取菌絲上的水，SP為水霉囷絲。
[0007]3)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)比較
對(duì)照組以PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，待菌絲長滿平板時(shí)，即用鑷子將培養(yǎng)基表面的菌絲夾取下來，先用生理鹽水漂洗一次，然后再用無菌水清洗。
[0008]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
1、菌絲更易獲得。
[0009]2、菌絲量更多。單位位時(shí)間內(nèi)沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基上獲得兩種水霉菌絲的重量是PDA固體培養(yǎng)基的3~4倍
3、操作更簡易。獲取相同重量的兩種水霉菌絲在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基上用的時(shí)間是是PDA固體培養(yǎng)基的1/8~1/7倍
【【具體實(shí)施方式】】
下面對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。[0010]一、材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
寄生水霉ATCC200013TM，購于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；多子水霉(將發(fā)病魚或魚卵用75%酒精浸洗3次，然后用無菌蒸餾水沖洗6次，置于加有100 mg/L鏈霉素青霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上，在20 ° C恒溫培養(yǎng)24 h后立即在長出的菌落邊緣放置無菌油菜籽，在20 ° C恒溫繼續(xù)培養(yǎng)，待油菜籽上覆蓋菌絲后將其取出并置于滅菌過濾河水中，于20 ° C培養(yǎng)直至游動(dòng)孢子釋放。無菌吸取100 μ L孢子懸液至PDA平板上均勻涂布，20 ° C恒溫培養(yǎng)并切取單菌落瓊脂塊到PDA平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，于4° C保存待用)，沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基平板、無菌蒸餾水、六孔板、ImL槍頭，購于國藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司；油菜籽粒，購于上海市古棕路菜市場(chǎng)；-80 V恒溫冰箱、生化培養(yǎng)箱，購于日本三洋公司；Ph = 5.6的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、鑷子、油菜籽粒、濾紙、I mL槍頭在I X IO5Pa高壓濕熱滅菌20 min后備用。
[0011]實(shí)施例1
2、實(shí)驗(yàn)具體步驟 水霉菌的提取
2.1孢子懸液的制備
將水霉菌(寄生水霉和多子水霉)接種于放有無菌油菜籽的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，于20 V恒溫條件下培養(yǎng)直至油菜籽上長滿菌絲；在六孔板中加入無菌水，將長滿菌絲的油菜籽放入六孔板中；然后于20 V恒溫條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36小時(shí)后于顯微鏡下觀察水霉菌絲孢子的釋放情況，當(dāng)孢子數(shù)量達(dá)到一定量以后，再將菜籽取出。
[0012]2.2水霉菌絲的提取
在六孔板中加入沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，置于20 V恒溫條件下培養(yǎng)直至長出菌絲；然后用無菌的鑷子夾出菌絲，于無菌水中漂洗3~4次，用無菌的濾紙吸取菌絲上的水；將菌絲放入無菌的1.5 mL EP管中，置于-80 V低溫冰箱中保存即可。
[0013]實(shí)施例2
3、實(shí)驗(yàn)步驟 水霉菌的提取
3.1孢子懸液的制備(同2.1)
3.2水霉菌絲的提取
在六孔板中加入馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)，置于20 V恒溫條件下培養(yǎng)直至長出菌絲；然后用無菌的鑷子夾出菌絲，于無菌水中漂洗3~4次，用無菌的濾紙吸取菌絲上的水；將菌絲放入無菌的1.5 mL EP管中，置于-80 V低溫冰箱中保存即可。
[0014]二、結(jié)果與討論
1.1表一相同培養(yǎng)時(shí)間下液體基培養(yǎng)與PDA固體培養(yǎng)基獲得菌絲重量的比較
【權(quán)利要求】
1.一種水霉菌絲的提取方法，包括以下步驟: A)孢子懸液的制備: 將水霉菌(寄生水霉和多子水霉)接種于放有無菌油菜籽的培養(yǎng)基平板上，20°C培養(yǎng)，待水霉菌絲長滿油菜籽。
2.然后將長滿水霉菌絲的油菜籽置于盛有無菌水的六孔板中，于20°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 - 3天；當(dāng)孢子數(shù)量達(dá)到IO4 /mL個(gè)時(shí)，取出油菜籽。
3.B)菌絲的提取: 在上述孢子懸液中加入液體培養(yǎng)基，于20 V恒溫培養(yǎng)箱中直至長出水霉菌絲團(tuán)，取出菌絲團(tuán)于無菌水中漂洗，用無菌濾紙吸干菌絲團(tuán)表面的水，即為水霉菌絲。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水霉菌絲的制備方法，其特征在于:所述步驟A中所述的固體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水霉菌絲的制備方法，其特征在于:所述步驟B中所述的液體培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的水霉菌絲的提取方法，其特征在于:所述的水霉菌絲是寄生水霉和多子水霉。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103468584SQ201310361168
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】胡鯤, 葉鑫, 趙依妮, 袁海蘭, 楊先樂 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)